发展。2009年11月1日；136(21): 3679–3689.
Brachyury和海鞘中的FoxA肠蝉
美国威尔医学院细胞与发育生物学系康奈尔大学，1300 York Avenue，Box 60，New York，NY 10065，USA。
- 补充资料
【补充资料】
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总结
脊索是脊索动物身体平面图的一个定义特征。实验在海鞘中，青蛙和小鼠胚胎显示Brachyury的共同表达和FoxA类转录因子是脊索发育所必需的。然而，关于介导协同作用的顺调控序列的研究这些转录因子的作用因其有限的脊索基因和顺调控模块的知识两者都直接瞄准。我们已经确定了一个易于测试的模型在来自海鞘的155-bp脊索特异性CRM中进行的此类调查肠蝉。此CRM包含的功能绑定站点二者都玻璃海鞘Brachyury（Ci-Bra）和FoxA（Ci-FoxA-a）。通过组合点突变分析和错误表达实验，我们证明这两种转录因子与该CRM的结合是必要和充分的以激活转录。深入了解反监管标准控制其活动，我们调查了155-bp CRM中的转录因子结合位点。155-bp序列包含两个具有相同核心序列但相反的Ci-Bra结合位点方向，其中只有一个是增强子活动所必需的。中的更改这些位置的方向和间距都会对活动产生重大影响客户关系管理，作为在玻璃海鞘基因组不同的排列不能激活脊索中的转录细胞。这项工作首次证明了协同作用在Brachyury和FoxA之间激活单个脊索CRM，并强调转录因子结合位点排列的重要性它的功能。
关键词：玻璃海鞘、Brachyury、，福克斯汽车公司、Notochord、Muscle、Ascidian、T-box、Cis-调节模块、转录
简介
T盒转录因子Brachury和FoxA的成员翼螺旋/叉头盒转录因子正态组证明在脊索发育中发挥关键作用（例如。Friedman和Kaestner，2006年;Herrmann和Kispert，1994年).Brachury和FoxA直向同源物在脊索的形成来源于对各种模型系统的研究，包括小鼠和海鞘胚胎。在鼠标中，详细分析截断(总胆固醇)突变表明这种基因缺陷，其特征是后脊索发育受损由于诺托基因，在既短又短福克斯2突变胚胎(Abdelkhalek等人，2004年).
在海鞘中肠蝉（以下简称玻璃海鞘)，的福克斯2正交曲线Ci-FoxA-a公司（原名称为叉头或HNF3-β)表示为脊索，以及中枢神经系统、内胚层和表皮前体(Di Gregorio等人。，2001;Imai等人。，2004). 在玻璃海鞘和其他海鞘，Brachyury公司只在脊索细胞中表达，这与该基因在胚胎发育早期的全中胚层表达脊椎动物和文昌鱼(威尔金森等人al.，1990年;Smith等人。，1991;Yasuo和Satoh，1993;Holland等人。，1995;Corbo等人。，1997;Takada等人。，2002). 在玻璃海鞘，的表达式Ci-FoxA-a公司在里面脊索前体先于Ci-Brachyury公司(Ci-Bra公司),表明Ci-FoxA-a可能在Ci-Bra公司(Di Gregorio等人，2001年).这一假设得到了以下证据的支持：Ci-Bra公司在胚胎中的表达被废除Ci-FoxA-a公司已经是吗啉寡核苷酸敲除(Imai等人，2006年). A类海鞘中Foxa2与Brachyury直系生物的协同作用脊索的形成最初是由年的研究提出的盐藻属罗雷茨，其中已经表明，它们各自的共同注射mRNA转化为非脊索谱系的前体足以转换这些卵裂球对脊索的命运(Yasuo和Satoh，1998年;Shimauchi等人，2001年).
相关发现来源于爪蟾，其中胚胎中的动物帽与品塔拉维斯（a）Foxa4公司类基因）和Xbra公司mRNA引起背侧中胚层和脊索的剂量依赖性(O'Reilly等人，1995年).有趣的是，非脊索动物也表现出类似的协同作用无脊椎动物果蝇属，其中Brachyury公司和福克斯2正交曲线，短消化道(拜恩)和叉头(福卡)分别配合规范以及尾侧内脏中胚层的形成，而尾侧内脏中胚层在拜恩/福卡双突变体果蝇在前中胚层，当这两个基因都过度表达时(库什和路透社，1999年).总的来说，这些来自遥远分类群的报告表明Foxa2和Brachyury正交曲线之间的协同作用是一个关键步骤形成专门的中胚层隔室。
尽管有大量证据表明Foxa2的合作功能和脊索中的Brachyury直系木，目前还没有关于顺调节模块（CRM）直接受这两种转录的控制可用于在单核苷酸水平。因此，关于结构、数量的信息以及这些转录因子结合位点的排列可能会调节其相互作用的架构约束，仍然非常有限。收集这些信息，这对阐明Foxa2和Brachyury同源基因的分子机制为了协调控制脊索的发育，我们研究了155-bp脊索CRM与玻璃海鞘胚胎发育迅速，加上紧凑、全序列的基因组和易于转基因，使这种无脊椎动物脊索动物适应快速鉴定和控制基因表达的CRM特征（例如。库萨卡贝，2005年;Shi等人，2005年;帕萨马内克和迪格雷戈里奥，2005).
这里描述的脊索CRM指导在脊索细胞，与一种新的脊索基因有物理联系，顺时针方向155-bp的脊索活动顺时针方向客户关系管理依赖于两个不同的顺调控序列，即Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合位点。我们证明了Ci-Bra和Ci-FoxA-a的错误表达足以触发异位CRM在肌肉细胞发育中的激活。通过组合操作对这些站点的空间组织进行全基因组搜索相关序列，我们发现证据表明顺时针方向CRM，作为以及在不相关但组织相似的基因组序列中Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合位点的方向和间距受到限制脊索活动的因素。
材料和方法
胚胎培育与细胞松弛素B治疗
成人肠蝉和海鞘是从Marine Research and Educational Products（M-REP；Carlsbad，CA，美国），并保存在水族馆的循环人工海水中～18°C。用于解理阻止实验、受精、去角质胚胎在单细胞阶段进行电穿孔并在过滤后饲养直到110细胞或早期原肠胚阶段加入细胞松弛素B，最终浓度为2μg/ml胚胎保存在细胞松弛素B溶液中，直到未经处理的对照来自同一离合器的胚胎，平行培养，达到尾芽晚期。
质粒构建与电穿孔
XPA16474质粒由1655 bp的基因组片段克隆到pCES载体(Harafuji等人。，2002). 用于删除和突变的所有后续插入以该质粒为模板，通过PCR扩增进行分析，并克隆到pFBΔSP6载体中(Oda-Ishii和Di Gregorio，2007). 用于PCR的寡核苷酸列表放大图见.
表1。
| 顺时针方向客户关系管理截断* | 正向引物序列（5′-3′） | 反向引物序列（5′-3′） |
|---|
| B类 | gtaactagcacgagggtgtatg | CTGCAGCAGTATTCATCATGA公司 |
| C类 | CTCTTGCGAGAGAGGCGACA公司 | ACAAGGCATGGCCTCGCATA公司 |
| D类 | CTCTTGCGAGAGAGGCGACA公司 | GATCACGTATAGTGTATGCTA |
| E类 | GCGTGCAAAATACACACTAT公司 | ACAAGGCATGGCCTCGCATA公司 |
| F类 | GCGTGCAAAATACACACTAT公司 | AAGTCCGCATTAAAGCAGGGC公司 |
| G公司 | TGTACTGAATAGTTGCTGATTC公司 | ACAAGGCATGGCCTCGCATA公司 |
| H（H） | GCGTGCAAAATACACACTAT公司 | GCTCGCTTATTGTCTCATTTG公司 |
| 我 | CGCAATCTTACCTTACAAATG公司 | AAGTCCGCATTAAAGCAGGGC公司 |
| J | GCGTGCAAAATACACACTAT公司 | CTGACTTTGAGTGTACGCAA公司 |
| K（K） | TAAATATTGTTCGTGGCTGAT公司 | AAGTCCGCATTAAAGCAGGGC公司 |
| L（左） | CGCAATCTTACCTTACAAATG公司 | 全球气候变化大会 |
| M（M） | CAAATGAGAACAATAAGAGC公司 | CATTTGTAAGGTACAGATTGCG公司 |
要创建trop>FoxA:：en研发构造lacZ公司序列是从含有1.8-kb的结构中删除的的碎片顺式肌球蛋白样顺调节区(迪格雷戈里奥和莱文，1999年)通过消化不是我和Blp公司一、 和质粒重排存在退火寡聚物Not。阿帕。Spe.linker公司。F类（5′-GGCCGGAGGAGGGCCCGGAGAACTAGTGAGGAG-3′）和不是。阿帕。Spe.linker。R（5′-TCAGCTCCTCCACTAGTCCTCCGGGCCCTCTCCG-3′）生成向量pFB1.8trop.link。GFPci(玻璃海鞘密码优化）编码区(Zeller等人2006年)用引物GFPci扩增。F.规格（5′-AGGAACTAGTGGAGGAGGAGAGATGCAAAGGAGAACT-3′）和GFPci。R.Blp公司（5′-TTTTATTGCTCAGTCTTTATTACAGCTCATCCAT-3′）并克隆到Spe公司我/Blp公司pFB1.8trop.link的I站点使pFB1.8转。GFP中间载体。对DNA绑定进行编码的序列用引物FoxDBD扩增了Ci-FoxA-a的结构域。F.阿帕（5′-GGGCCCATGGCTCATGTTAAACAGAGGACCG-3′）和FoxDBD。R.斯佩（5′-TCCTCACTAGTCCAGCGCCCCCCCTGGATTTC-3′）并克隆到阿帕我/Spe公司pFB1.8trop的I位点。GFP将pFB1.8转。福克斯汽车公司。GFP克隆中间产物。编码抑制的序列的域（RD）雕刻果蝇基因用引物En。F.非（5′-AGCTGGCGGCCTATGGCCCTGGAGGATCGTGCAG-3′）和英语。R.Apa（5′-GAGCGCCCATGGGCCCTCCTCCTCCCCAGGA-3′）。结果片段被克隆到不是我/阿帕的I个站点pFB1.8转。福克斯汽车公司。GFP生产trop>FoxA:：en研发构造。
要生成Sna>FoxA-a错误表达结构，整个开放式阅读框Ci公司-福克斯汽车公司-一被放大了引物CiFoxA-a.F.Nco（5′-GTGCCATGGTTGTCGTCTCCACCGTC-3′）和CiFoxA-a.R.EcoRI（5′-AGCTGGAATTCTTTACTGTACATTAGCT-3′）。这个合成的片段被克隆到Nco公司我/生态RI站点pSP72-1.27-GFP载体(Corbo等人。，1997)生成质粒pSP72-1.27-FoxAa。737 bp片段的Ci公司-蜗牛启动子是从Sna>eGFP向量(Rhee等人。，2005)使用引物CiSna737.F.Xho（5′-GAACTCGAGCGTGAAGCTTGCATGCCTGC-3′）和CiSna737.R.Nco（5′-CAACACCATGGGTACCCGGGGATCCGTAA-3′）并克隆到Xho公司我/Nco公司pSP72-1.27-FoxAa的I位点生成Sna>FoxA-a构造。
所有结构在间距和方向上发生突变或改变通过PCR扩增产生。包含位点的基因组片段在中找到词调155-bp CRM，使用GUFEE程序（见下文），PCR-扩增自玻璃海鞘基因组DNA作为131-bp片段克隆到pFBΔSP6中。The sequences of the所使用的寡核苷酸显示在.质粒纯化如前所述进行电穿孔(Oda-Ishii和Di Gregorio，2007).
表2。
| GUFEE构造 | 正向引物序列（5′-3′） | 反向引物序列（5′-3′） |
|---|
| G3（G3） | GTTACCACATTTAAATATA公司 | GTGGTTGAAAAATGTTAGGC公司 |
| G2级 | AGGTCCGTATCGGAA公司 | TATAGCAATCAACCAAAAAG公司 |
| 八国集团 | GTAGCAATACCTTGTTGT公司 | CATAAGTCATAAGTGAAC公司 |
| 第九集团 | TTGCATGAGTAAGCTTAT公司 | CAAATCGACATT公司 |
| 七国集团 | TCACTATCATACACA公司 | CAGCTTCACTTTGATTGTGAT公司 |
| G1号 | ttttggtcaaacaacataa公司 | TACCTGTAAAAATTGACTGT公司 |
| 六国集团 | TTGATCAGTTTGTAAACTAC公司 | CACTACTTAAATAAATCC公司 |
| 第四集团 | AGCAAATTGTTAAGACACGA公司 | ACACGTGTTCTGATTGTTAA公司 |
| 第五集团 | ACACACTACTCACTCAAAAAAAAAT公司 | GTAAAGGCAGATTTGTTTAT公司 |
| 十二国集团 | TACGTTAATTCCAGAGCGC公司 | ATGTGCAATCTAGTTGCACAAAA公司 |
电泳迁移率变化分析（EMSA）
我们使用了前面描述的GST-Ci-Bra(迪格雷戈里奥和莱文，1999年)和GST-Ci-FoxA-a(Dunn和Di Gregorio，2009)融合蛋白和以下放射性标记双链寡核苷酸（只有5′-3′链报告，突变体下划线）：
164T1，5′-TGTTCCATTTGCACTCAGAGAGAG-3′；
164T1米，5′-TGTTCTCATTTGACA公司TCAGACGAG-3′；
164Fox，5′-CGAACAATATTTACTGACTTG-3′；和
164Foxm，5′-CGAACCAATAGGGCAG公司GACTTTGAG-3′。
蛋白质-DNA复合物在室温下形成30分钟，然后如前所述，在聚丙烯酰胺凝胶上溶解(Dunn和Di Gregorio，2009年).对于竞争实验，未标记的浓度双链寡核苷酸分别为1μM和5μM浓度。
结果
XPA16474序列是一个真正的转录增强子玻璃海鞘基因ci0100137819
1655-bp XPA16474序列()通过随机基因组片段筛选分离出顺式调节活性，基本上如前所述(Harafuji等人，2002年). 这个XPA16474质粒可直接表达脊索和内胚层在大多数转染的胚胎中()因此选择用于进一步分析。BLAST搜索(Altschul等人，1990年)的肠蝉基因组(http://genome.jgi-psf.org/Cioin2/Cioin2.home.html)(Dehal等人，2002年)显示XPA16474序列跨越两个相邻的基因模型，染色体9q上的ci0100137797和ci01001370819(Shoguchi等人，2006年). 这个XPA16474序列包含ci0100137797，编码一种推测的锌金属蛋白酶，以及ci0100137819的5′-侧翼区域和第一外显子的一部分，短（共934bp）未标记基因模型().
XPA16474序列的顺调控活性概括了其侧翼基因的表达。(A类)XPA16474的映射序列（顶部的绿色矩形）肠蝉基因组显示该片段覆盖了最后三个外显子（矩形）和插入的内含子（细线）顺锌金属蛋白酶基因（ci0100137797），以及a的基因间区域和第一外显子我们命名的相邻基因顺时针方向（ci0100137819）。位置最小155-bp CRM（详见补充材料图S2）图中还显示了（较小的绿色矩形）。VISTA系统发育足迹(http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2)该地区的肠蝉和海鞘是采用以下参数执行：计算窗口，100bp；最小保护宽度，100bp；保护身份，50%。已保存编码区被描述为蓝峰，保守的非编码序列被描述为粉红色山峰。(B类)晚尾芽的X-Gal染色玻璃海鞘胚胎在单细胞期用1655 bp XPA16474序列电穿孔。(C-E公司)检测顺时针方向WMISH的记录显示在脊索和躯干内胚层的表达（C）早期尾芽，（D）中尾芽期和（E）晚尾芽期。在B、D和E中，胚胎是定向的左前方，背向上；C是腹视图，位于左侧。黄色箭头表示内胚层细胞；红色箭头、脊索细胞。Ci公司,肠蝉;铯,玻璃海鞘萨维尼.比例尺：50μm。
对于锌金属蛋白酶基因，原位全山Ghost数据库提供的杂交（WMISH）数据(http://ghost.zool.kyoto-u.ac.jp)据报道，尾芽胚胎的全身都有弱表达，尤其是脊索、乳头和间充质细胞(Satou等人，2001年). 在对于ci0100137819的病例，我们的WMISH没有现场数据对不同发育阶段的胚胎进行的实验显示从神经胚期开始在脊索和内胚层的表达(). 这种模式是XPA16474转基因如实再现(). 我们已将与该位点对应的基因Ci公司-曲调(被膜的脊索和内胚层)，因为它的表达模式。我们表演了5′-RACE（cDNA末端快速扩增）实验验证了预测基因模型(弗罗曼，1993)，编码长度没有显著差异观察区域（数据未显示）。推测的蛋白质产品顺时针方向跨越116个氨基酸残基，不含任何明显的保守结构域，但它被暂定为假定结构域公共可用预测软件的分泌途径组成（信号3.0；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站/)(伊曼纽尔森等人。，2007).
TBLASTN搜索(Altschul等人。，1990)公开的基因组和表达序列标签（EST）确定了Ci公司-曲调在姐姐身上物种海鞘（E值=1×10-38)和a被膜匍匐枝的假定直系结晶莫拉菌（E值=3×10-5). 文昌鱼数据集的BLAST搜索(文昌鱼)、海胆(Strongylocentrotus类紫癜的)而其他的后肠吻合术无法识别任何序列被囊动物以外的相似性。
XPA16474增强器由Ci-Bra和Ci-FoxA-a通过紧密结合位点簇
确定脊索所需的最小顺调控序列1655-bp XPA16474序列的活性，我们创建了10个序列截短并在电穿孔后测试其活性玻璃海鞘胚胎（参见补充材料中的图S1）。这些实验将活动序列缩小到155-bp CRM直接强烈和一致的脊索染色，无论其方向（补充材料中的图S1），因此选择用于进一步分析。155-bp CRM的顺序检查()显示了存在两个方向相反的相同T盒半衰期（TTGCAC）和一个假定的Fox结合位点（TATTTAC）。我们重点分析了这些T-boxFox网站，因为Ci-Bra和Ci-FoxA-a在海鞘中脊索的形成，我们对这些序列进行突变以评估他们各自对CRM活动的贡献。任一基因突变最远端的T形箱站点（“T形箱位置1”；)或者假定的狐狸场地()导致了脊索活动完全丧失。相反，近端突变T-box站点（“T-box站点2”）没有任何影响(). 量化这些突变的影响如所示.
T-box和Fox转录因子结合位点的要求脊索活动。(A-D公司)晚尾巴玻璃海鞘胚胎在单细胞阶段用155-bp的不同变体电穿孔最小脊索CRM和β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。不全是40脊索细胞被染色，因为马赛克掺入转基因。（A） 155-bp野生脊索电穿孔胚胎客户关系管理。下面的示意图描述了155-bp序列，预测了两个T-box转录因子结合位点（红色矩形）和一个推测的Fox转录因子结合位点（蓝色椭圆形），克隆于Ci-FoxA-a公司基本启动子（红线和箭头）和lacZ公司报告基因（蓝色方框；未按比例绘制）。（B） 胚胎用携带远端T盒突变的155bp CRM电穿孔站点（T-box站点1）。（C） 用155-bp CRM电穿孔胚胎，其中近端T-box位点（T-box位点2）发生突变。（D） 胚胎用携带突变Fox位点的155bp CRM电穿孔。(E类)脊索和间充质染色的胚胎百分比用野生型或突变质粒进行电穿孔。一切正常对有染色和无染色的发育胚胎进行评分；胚胎展示间质和脊索的染色分别进行评分组织。
Ci-FoxA-a和Ci-Bra与其假定靶位点的结合是通过电泳迁移率变化分析（EMSA）进行测试。如所示，一个无线电标签，含有假定Ci-FoxA-a位点的双链寡核苷酸（`Fox探针’）被GST-Ci-FoxA-a融合蛋白有效结合，而带有相同突变的突变探针（“Foxm”）体内脊索活动（如所示)没有被同样数量的蛋白质识别。同样，在竞争分析中，只有越来越多的未标记野生型Ci-FoxA-a位点抑制了Ci-FoxA-a对放射性标记探针的结合，而未标记的突变体竞争对手福克斯并未干扰蛋白质-DNA复合物。先前发布的高亲和力Ci-FoxA-A结合位点CIF1有效地与野生型Fox探针竞争，而未标记、无关的竞争对手Sna Cryp，是已知的绑定站点顺钉子(Di Gregorio等人。，2001)，没有。如所示，T-box1探针是通过GST-Ci-Bra融合蛋白在体外有效结合。此绑定是在含有越来越多未标记物质的反应中被消除T-box1寡核苷酸或包含以下其中一种的未标记寡核苷酸以前发布的Ci-Bra结合位点发现于顺式肌球蛋白样(Ci比喻)脊索CRM（Trop3，之前称为Ci-Bra#3）(蒂·格里古里奥和莱文，1999年). 含有可有可无的T-盒位点2的探针同样与GST-Ci-Bra融合蛋白结合（数据未显示）。
脊索活动所需序列的体外结合这个顺时针方向通过Ci-Bra和Ci-FoxA-a蛋白进行CRM。(A类)用放射性标记探针进行电泳迁移率变化分析（EMSA）包含预测的Ci-FoxA-a结合位点和GST-Ci-FoxA融合蛋白质。包含的通道：（1,2）放射性标记探针，包含预测的Ci-FoxA-a结合位点，（1）游离，（2）与GST-Ci-FoxA-a孵育融合蛋白；含有突变Ci-FoxA-a的（3,4）放射性标记探针结合位点，（3）游离，（4）与GST-Ci-FoxA-a孵育；(5-12)含有预测的Ci-FoxA-a结合位点和未标记竞争者，1μM（车道5、7、9、11）和5μM（道路6，8，10，12）浓度，与GST-Ci-FoxA-a一起孵育(B类)EMSA与放射性标记探针和GST-Ci-Bra融合蛋白。包含的车道：（13、14）含有预测的Ci-Bra结合位点T-box位点1的放射性标记探针，（13） 游离，（14）与GST-Ci-Bra融合蛋白孵育；(15-18)1μM（车道）处带有放射性标记的T型盒1号点探测器和未标记的竞争者15、17）和5μM（16、18道）浓度，用GST-Ci-Bra公司。
有趣的是，在玻璃海鞘肠枝和海鞘在155亿英镑的CRM中发现，对于T-box或Fox站点（参见补充文件中的图S2A材料）。然而，1655-bp XPA16474序列的电穿孔进入C.萨维尼在约30%的胚胎中产生染色；这个构造在内胚层和脊索中都很活跃，尽管脊索细胞染色C.萨维尼相当大低于年肠杆菌（参见补充材料）。与在C。肠枝，其中155-bp CRM作为一个特定于脊索的功能增强剂，当电穿孔时，这种CRM在这两种组织中都保持活性进入之内C.萨维尼胚胎（参见补充文件中的图S2E材料）。值得注意的是，序列检查表明C.萨维尼对应于的序列顺时针方向CRM还包含两个T形盒位点和一个Fox结合位点，尽管具有不同的核心和方向（在补充材料中的图S2中突出显示）。这些观察结果建议即使C.萨维尼序列不包含Brachyury和Fox结合位点与C。肠枝序列，是顺时针方向CRM在某种程度上是保守的。
Ci-Bra和Ci-FoxA-a的阻遏物形式可消除155-bp顺时针方向客户关系管理
Ci-FoxA-a和Ci-Bra与这个顺时针方向CRM通过EMSA进行体外验证，我们测试了每个转录因子的合成阻遏物形式对的活动词调客户关系管理。当155亿英镑的CRM共同电穿孔成玻璃海鞘合子和文胸>文胸：：en研发表达阻遏物形式的质粒脊索细胞中的Ci-Bra(库格勒等人al.，2008年)，仅在间充质细胞中检测到染色(). 这与当空的父载体转染（数据未显示）。
对脊索活动的抑制顺时针方向客户关系管理Ci-Bra和Ci-FoxA-a的阻遏物形式。(A类)晚尾芽胚胎与155-bp脊索CRM和文胸>文胸：：en研发构造，用于引导脊索Ci-Bra的表达融合到果蝇属Engrailed公司(英语研发); β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。(B类)与155-bp共电穿孔的晚尾芽期胚胎脊索CRM和Ci公司-福克斯a-a在控制顺式肌球蛋白样(顺式运输)脊索发起人(trop>FoxA-a:：en研发); 为…染色β-半乳糖苷酶（蓝色）。紫色箭头表示间充质细胞。
为了评估Ci-FoxA-a阻遏物的作用，我们融合了编码Ci-FoxA-a DNA结合结构域的序列这个果蝇属嵌入抑制域(英语研发). 因为这种阻遏物的早期表达控制Ci-Bra公司启动子总体上受到不利影响形态发生（数据未显示），我们替换了Ci-Bra公司发起人这个顺式运输发起人。这个顺式运输启动子是Ci-Bra，因此它比Ci-Bra公司发起人；这个顺式运输促进剂已用于以前的研究延迟和减轻其他转录的影响因素(Di Gregorio等人。，2002). 正如预期的那样trop>FoxAa:：en研发质粒产生了较温和的表型，并使抑制155-bp CRM的脊索活动(). 这个Ci-FoxA-a阻遏物形式的脊索特异性作用被证实载体的背景间充质活性仍然存在可检测（紫色箭头).
Ci-FoxA-a和Ci-Bra对激活顺时针方向客户关系管理
证明了Ci-Bra和Ci-FoxA-a对155-bp CRM的脊索活动，我们接下来测试这些活动的充分性异位激活的转录因子顺时针方向客户关系管理错误表达分析。我们选择了不当表达Ci-Bra公司和Ci-FoxA-a公司在肌肉细胞中，因为肌肉代表了一种可牵引的转录因子均不正常表达的区域。为了这个最后，我们克隆了它们的编码区域顺钉子(Ci-Sna公司)启动子区域，在肌肉前体中由原肠胚形成开始(Erives等人。，1998). 因为Ci-Bra和Ci-FoxA-a在肌肉中的错误表达细胞引起的形态发生扰动使其复杂化鉴定后，我们对那些卵裂在110细胞期被阻止()，或在早期原肠期，用细胞松弛素B治疗。
Ci-Bra和Ci-FoxA-a对异位激活155-bp脊索CRM。(A类)简化的植物谱系图一半的玻璃海鞘110细胞期的胚胎。诺托福德前体标记为红色，肌肉前体标记为橙色，躯干间质标记为紫色和浅蓝色的神经前体。两个不同谱系的前体是用两种颜色标记。(B-H公司)单细胞电穿孔胚胎在每个面板下面指示构造。绑定站点已变异的被“X”覆盖。胚胎卵裂被阻止细胞松弛素B在110细胞期的表达及β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。在所有面板中，右下角的插图显示了经过处理的胚胎细胞松弛素B在原肠胚早期。（B） 155-bp的活动顺时针方向客户关系管理。左下插图显示了未经处理的对照胚胎同一个离合器，与图中显示的阻止分裂的胚胎平行生长所有面板。（C） 的活动Ci公司-斯纳发起人用于导致的错误表达Ci公司-运动内衣和Ci公司-福克斯a-a（D）155-bp CRM的三重电穿孔错误表达构造Ci公司-运动内衣(Sna>文胸)和Ci公司-福克斯a-a(Sna>FoxA-a)显示异位由于马赛克合并，仅一侧肌肉染色。左下角插图描绘了同一实验中的另一个胚胎，显示了双侧肌肉染色。（E） 155-bp CRM与Sna>文胸错误表达结构。（F） 共电穿孔155亿英镑客户关系管理Sna>FoxA-a错误表达结构。(我)图中显示了在脊索（红色条）、肌肉（橙色条）或两种组织（绿色条）。使用的转基因显示在x个-轴。
在单细胞阶段用155-bp电穿孔的胚胎顺时针方向CRM和解理在110细胞阶段被阻止脊索前体的染色()而胚胎是用737-bp电穿孔的Ci-Sna公司启动子上游lacZ公司(Erives等人，1998年)有仅在肌肉和间充质谱系中染色(). 三倍的155-bp CRM的电穿孔斯纳>运动内衣(Oda-Ishii和Di Gregorio，2007)和斯纳>福克斯a-a错误表达结构导致肌肉前体异位染色，此外当单用155-bp CRM时观察到脊索和间充质染色电穿孔的(). 收件人验证155-bp CRM的异位激活依赖于伴随表达Ci-Bra公司和Ci-FoxA-a公司，我们将其与每个错误表达结构单独电穿孔。在胚胎仅与155-bp CRM和斯纳>运动内衣错误表达结构，染色出现在脊索，但肌肉中未观察到异位染色(). 同样，当155-bp CRM与斯纳>FoxA-a公司构造，染色仍然局限于脊索().
最后，我们测试了异位CRM激活与先前通过联合电穿孔鉴定出的Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合位点斯纳>运动内衣和斯纳>福克斯a-a带有突变体155-bp CRM的版本缺少T-box站点1或Fox站点。T-box位点1突变的三重电穿孔未产生染色(); 三人组Fox位点突变的电穿孔导致其中一个或两个脊索和/或肌肉细胞(). 对于所有的错误表达实验，可比较的结果是在原肠胚早期用细胞松弛素B处理的胚胎中获得，显示了大量染色的脊索和/或肌肉前体（插入).这些实验的定量数据如图所示和低倍放大补充材料中的图S3显示了群体显微照片。
结合突变分析获得的数据，这些结果提供证据证明Ci-Bra和Ci-FoxA-a既必要又充分激活由顺时针方向客户关系管理。
Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合方向变化的影响脊索活动的地点顺时针方向客户关系管理
观察到155-bp中只有一个T盒位点最小脊索CRM，即T-box站点1()脊索动物活动所需的调查这些站点的组织结构变化对顺调节活性。因为两个T-box站点具有相同的核心序列，但排列方向相反()，我们首先测试了回文排列变化的影响。与直系同源相似来自其他模型系统的蛋白质Ci-Bra能够结合回文位点，可能以二聚体的形式(迪格雷戈里奥和莱文，1999年)，二聚体可能是由其内进化保守的PDSPNF氨基酸基序介导T域(Kusch等人，2002年).产生6 bp核心序列反向补体的突变T盒位置1，从而破坏了T盒的回文排列部位，完全消除脊索染色(). 相比之下，撤销T-box站点2，CRM功能不需要该站点()，未减少脊索活动().然而，T形盒位置2的反转足以补偿T-box位点1突变并部分恢复脊索活性(). 一个变种人顺时针方向CRM以相反的方向承载两个T-box站点保留了脊索活性，尽管染色胚胎的百分比染色的定性强度低于野生型CRM(;另请参见补充材料中的图S4E）。这些结果表明不需要T盒位置的回文排列。
Ci-Bra和Ci-FoxA-a定向变化的影响脊索活动的结合位点顺时针方向客户关系管理。在单细胞阶段，用野生型155-bp顺时针方向CRM或其突变版本之一，在每张显微照片下方示意。黑色箭头表示本地站点的方向，红色箭头表示由创建的新方向诱变。对胚胎进行β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。(A类)野生型顺时针方向CRM、T-box站点1和T-box的核心站点2相同，但方向相反。(B类)T型箱位置1的反转。(C类)T-box站点2的反转。(D类)T-box位点2逆转，同时T-box位点1突变。(E类)两个T-box站点的反转。(F类)反转Ci-FoxA-a场地。(G公司)脊索和间充质染色的定量使用野生型155-bp CRM及其衍生物进行电穿孔其中Ci-Bra和Ci-FoxA-a位点被逆转和/或突变。胚胎是得分为.T1r，T形箱站点1反转；T1m，T-box位点1突变；T2r、T-box 2位点逆转；Foxr、，福克斯网站颠倒了。
福克斯网站的倒置()脊索动物的活动也减少了，但没有消除无法挽救T-box位点1的突变或反转（参见补充材料中的图S4A、B）。同样Fox位点对突变或T盒位置2的反演（补充材料中的图S4C、D）；然而，当Fox位点在两个T-box位点都颠倒的构造中颠倒（参见补充材料中的图S4E、F）。包含CRM的构造在其中之一同步（5′→3′）或反对的相对于基底启动子的（3′→5′）定向，产生了等效的脊索染色（补充资料中的图S1材料）。
为了评估绑定站点间距对CRM功能的作用，我们引入了155-bp序列中的一系列插入或删除，以改变CRM功能所需的Ci-Bra和Ci-FoxA-a站点之间的距离。在野生型155-bp CRM，核心T盒结合位点间隔14 bpT-box位点2与Fox位点相隔26 bp(). 删除5个基点两个Ci-Bra位点之间序列的片段消除脊索活动(). 当5 bp（未显示数据）或10 bp时，CRM功能也会丢失bp被插入这些位点之间(). 同样，Ci-Bra和Ci-FoxA-a之间5 bp的缺失消融脊索活动()在这个区域插入10个bp的基因大大减少活动().
脊索结合位点间距变化的影响的活动顺时针方向客户关系管理。电穿孔晚幼胚在单细胞阶段，野生型155-bp顺时针方向CRM或包含插入或删除内容的版本，以图表形式显示在的左侧每一张显微照片。对胚胎进行β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。(A类)野生型顺时针方向具有两个Ci-Bra绑定站点的CRM具有14 bp间隔的相同核心序列，Ci-FoxA-a结合位点与T-box位点2分离26 bp。(B类)删除5个基点Ci-Bra结合位点之间的14-bp间隔区。(C类)插入10 bp在14bp的间隔区中。(D类)删除T-box站点2和之间的5 bpCi-FoxA-a结合位点。(E类)在T形盒之间插入10 bp位点2和Ci-FoxA-a结合位点几乎消除脊索活动，在～9%的转基因胚胎的少数细胞中检测到。
为了确定Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合位点的存在是否作为一类共同监管脊索CRM的重复特征，我们试图确定包含与155-bp中确定的Ci-Bra和Ci-FoxA-a位点核心序列Ci公司-曲调客户关系管理。为了缩小结果范围，我们将从每个T盒的5′端查询额外的核苷酸站点，使Ci-FoxA-a站点保持不变，并且我们缩小了目标间隔为70 bp。这次搜索检索到14次点击，其中4次是重复，其中一个正如预期的那样词调CRM，其中因此为我们的软件提供了内部控制。序列包含其余9个点击的片段分别经PCR-扩增、克隆和体内试验。在这九种构造中，没有一种被发现有脊索活动（参见补充材料中的图S5）。此外包含Ci-Bra场地的建筑，其方向和间距与这个顺时针方向CRM，但具有不同间距的Ci-FoxA-a站点有脊索活动（补充材料中图S5中的G12）。然而，搜索集中于已知Ci-Bra靶基因的基因组位点表明推测的Ci-Bra和Ci-FoxA-a结合位点经常相关短序列间隔内（未显示数据），表明这些基因可能受这两种转录因子的控制。
讨论
组合控制玻璃海鞘FoxA-a和Brachyury公司
这个顺时针方向我们描述的脊索CRM已确定通过位置无偏的全基因组屏幕玻璃海鞘CRM（例如。Harafuji等人，2002年). 收件人验证该序列在在基因组背景下，我们分析了其区域之间的相似性活性及其邻近基因的表达模式。我们的数据显示我们命名的3′邻基因的表达模式顺时针方向该CRM如实地概述了`全长型活跃于脊索和内胚层，尽管我们没有排除此CRM也可能控制脊索表达的可能性它的5′邻居，顺式锌金属蛋白酶，可能是作为远程调节模块。
155-bp的CRM被发现是带有脊索的最小功能序列活动。对该序列进行突变分析，发现其活性需要一个T盒位点和一个假定的Fox结合位点。Ci-Bra和Ci-FoxA-a对这些位点的特异性结合分别为体外经EMSA验证，Ci-Bra与该序列的结合为通过初步染色质免疫沉淀试验确认（数据不显示）；CRM脊索对两种转录因子的需求活性在体内通过与显性负离子的共电穿孔得到证实每个转录因子的形式。最后，我们使用错误表达分析验证Ci-FoxA-a公司和Ci-Bra公司是激活155-bp CRM的必要性和充分性结果表明，Ci-FoxA-a和Ci-Bra都结合155-bp中的位点这两种转录因子的组合效应是脊索活动所必需的。
我们对脊索CRM异位激活的观察非脊索谱系补体先前公布的结果显示联合注射mRNA福克斯2和腕表海鞘的海鞘非脊索卵裂球的直系生物H.罗雷齐足以下调非脊索分化标记体外诱发脊索样特征(Yasuo和Satoh，1998年;Shimauchi等人，2001年).
脊索基因协同激活的工作模型Ci-FoxA-a和Ci-Bra表达
一个简化模型，概括了海鞘脊索中单个CRM水平的Ci-FoxA-a和Ci-Bra发展情况如所示.Ci-FoxA-a公司转录物在细胞质中开始可见16细胞期(Di Gregorio等人。，2001); 随着成熟的Ci-FoxA-a蛋白的积累通过与发现于这个Ci-FoxA-a公司顺调节区(Di Gregorio等人，2001年). 在此外，在脊索细胞中，Ci-FoxA-a对转录Ci-Bra公司，正如Ci-Bra公司在胚胎中表达Ci-FoxA-a公司已经是被击倒(Imai等人。，2006)以及通过Ci-FoxA-a在体外结合位点的存在这个Ci-Bra公司5′-侧翼区域（A.D.G.，未出版）。
Ci-FoxA-a和Ci-Bra在海鞘脊索发育。相互作用模型腹水过程中单个脊索CRMs水平的Ci-FoxA-a和Ci-Bra发展。左侧是胚胎的示意图64细胞（顶部）、原肠胚（中部）和早期尾芽（底部）阶段。诺特科德细胞及其前体呈红色。脊索的主要活动编队（蓝色字体）根据发展时间表（黑色）绘制垂直箭头）玻璃海鞘胚胎温度为18°C。两个由Ci-FoxA-a和Ci-Bra控制的CRM，Ci-leprecan公司(Dunn和Di Gregorio，2009年)和顺时针方向，表示为水平彩色条。红色矩形表示Ci-Bra在体外结合的位点，蓝色椭圆表示结合的位点Ci-FoxA-a体外试验。褪色的颜色用于指示发挥次要或在脊索活动中没有作用。圆形箭头表示自动调节回路在转录因子启动子上，证明（连续线）或推断（虚线）。为了简单起见Ci-FoxA-a公司和Ci-Bra公司省略了CRM。
在海鞘中H.罗雷齐，Brachyury已经被证明可以进行监管通过在其最小启动子中发现的结合位点进行自身转录顺序(高桥等人。，1999年b). 假定T盒结合位点的存在最小值Ci-Bra公司CRM（未显示数据）表明Brachyury公司转录也可能发生在玻璃海鞘.Ci-Bra输入turn激活至少50个脊索基因的转录(高桥等人，1999a;Di Gregorio和Levine，1999年;Hotta等人，2000年;Hotta等人，2008年;Oda-Ishii和Di Gregorio，2007;Kugler等人。，2008)其中包括Ci-leprecan公司(Dunn和Di Gregorio，2009年)和顺时针方向（此处显示）。两者都是Ci-leprecan公司和顺时针方向脊索CRM包含有效绑定的站点Ci-FoxA-a和Ci-Bra体外试验(，分别用蓝色椭圆和红色矩形表示）。然而，在以下情况下Ci-leprecan公司，Ci-FoxA-a站点提供只有最低限度的脊索活动(，淡蓝色椭圆形）(邓恩和Di Gregorio，2009年); 在以下情况下词调，Ci-FoxA-a网站是不可或缺的(,深蓝色椭圆形）。中的Ci-Bra结合位点Ci-leprecan公司CRM是尽管在不同程度上都参与了脊索动物的活动(，深红色矩形），而其中一个Ci-Bra结合位点顺时针方向脊索CRM是可有可无的(，褪色红色矩形）。值得注意的是Ci leprecan公司CRM各不相同（即各不相同TNNCAC通用核心共识序列的排列）(Dunn和Di Gregorio，2009年)也不同于Ci-Bra结合位点的核心序列顺时针方向客户关系管理。类似地，Ci-FoxA-a结合位点的序列发现于Ci-leprecan公司CRM描述于10个人中有7个人与我们用作参考的扩展共识序列相匹配（WTRTTKRYTY）(钱和科斯塔，1995)（我们未发表的观察结果），而Ci-FoxA-a在中找到绑定站点词调CRM更符合共识严格（9/10场比赛）。这些观察结果表明Ci-FoxA-a和Ci-Bra结合位点的数量和组合不同的核心序列和结合亲和力可能会确保基因转录起始和总表达水平的控制这些因素所针对的基因。
建筑改造对顺时针方向反监管信息
发现的两个Ci-Bra结合位点顺时针方向CRM已经相同的磁芯（TTGCAC），但方向相反。尽管他们是一样的核心序列，这些站点的功能需求广泛不同，需要远端Ci-Bra结合位点（T-box位点1）活性，近端Ci-Bra结合位点（T-box位点2）为可有可无。这一观察表明，他们的方向可能是决定其活动的因素。
为了验证这个假设，我们准备了155-bp的变体顺时针方向CRM中，我们同时突变了T-box位点1和反转了T形盒位置2的方向。我们发现，在这种情况下T-box位点1的突变通过逆转T盒位点2，正如T盒位点1在构造中的反转一样，其中T-box站点2也反转。这些结果似乎表明，只要两个T形盒位置中的一个位于5′→3′方向CRM能够运行。根据反转和突变实验，这个方向可能独立于那个方向其他T型箱现场；后一个观察结果反过来排除了T-box位点1和T-box位点2的回文排列的可能性是它们的活性和Ci-Bra结合所必需的。
转录因子结合位点的定向已被证明是其他模型系统中确定的CRM的全部活动所必需的，尤其是在黑腹果蝇，其中的方向REL和GATA结合位点已经在控制免疫基因在脂肪体中的表达(Senger等人，2004年). 在这个在特殊情况下，结合位点的反转导致了2或3次折叠大多数研究的CRM的活性降低；这些影响是被两个地点的倒置所废除(Senger等人，2004年).当连接的结合位点的方向对于背侧肌，扭转和蜗牛在腹部活动的CRM内恢复早期苍蝇胚胎的神经原外胚层(Zinzen等人，2006年). 这个这里报告的结果表明，类似的语法规则适用于顺时针方向客户关系管理。
当我们测试通过改变在155bp的CRM中发现的结合位点之间的间距，我们发现当两个Ci-Bra位点之间的间距因任一插入而改变时5bp或10bp，或5bp缺失，脊索活动丧失。当在两个位点之间插入11 bp时，获得了类似的结果（未显示数据）。同样，删除5 bp和插入10 bp在Ci-Bra站点和Ci-FoxA-a站点之间都消除了脊索活动。这些发现表明，除了受5-bp插入/缺失干扰的结合位点预计通过插入10-11 bp的全螺旋旋转可以恢复(Makeev等人，2003年),其他架构约束可能会调整转录因子和核蛋白负责顺时针方向客户关系管理。
确定的几何约束的全基因组验证这个顺时针方向客户关系管理
一般认为，在相同的组织包含相关的结合位点星座转录激活物和/或阻遏物（例如。Levine和Tjian，2003年;Markstein等人，2002年;Berman等人，2002年). 这个这一假设导致了“顺式监管”概念的形成代码”（例如。Istrail和Davidson，2005)或者语法，这可以从共同监管中推断出来CRM并用于预测具有类似顺式调节的相关模块属性。我们使用了从顺时针方向CRM扫描玻璃海鞘基因组试图识别新的、相关的脊索CRM。然而，我们发现我们测试的Ci-FoxA-a和Ci-Bra结合位点的组合能够在实验条件下直接进行脊索活动。这些如果我们考虑到通用T-box和Fox结合，结果并不令人惊讶站点具有较短的核心序列，因此沿基因组，即使在短（<160bp）区域内。然而，这些发现显示所分析的激活剂的结合位点的相关组合这里，以及具有相同核心序列的站点，可以广泛展示不同的行为。这反过来表明机制，最可能的表观遗传修饰和/或转录阻遏物一定在调节这些结合的行为站点以上下文相关的方式运行，从而充当“外部操作员”(Istrail和Davidson，2005年)并进一步增加转录控制层。沿着这些路线值得注意的是，在其他系统中，Ci-FoxA-a正交Foxa2已被证明具有启动激活所必需的染色质开放活性其靶基因的(Lee等人。，2005). 总之，定向、间距和全基因组扫描实验表明顺时针方向客户关系管理作为一个相当独特的“增强体”，具有相对固定的几何结构要求(阿诺斯蒂和库尔卡尼，2005).
由FoxA和Brachyury主持的动物遗传回路发展与演变
与发育相关的相互作用在远缘动物中的FoxA和Brachyury具有强烈的暗示性它们在确保充分控制基因网络，如控制中胚层形成和区域化。在玻璃海鞘脊索，对Ci-Bra公司Ci-FoxA-a的转录可以被认为是一种高效的如何从早期建立稳健的前馈调节机制胚胎发育阶段。这种机制可以提供快速通过组合转录激活动员能够执行广泛多样功能和在相对较短的时间内协调执行复杂的形态发生运动时间量。
虽然FoxA和Brachyury在一级进行了合作互动单个CRM的来自腹水以及不同的模型系统（例如。O'Reilly等人，1995年;库什和路透社，1999年;Shimauchi等人，2001年)，的在顺式调节水平尚未分析。这里介绍的工作提供了这是对这种协同作用的顺调节机制的第一个案例研究。有趣的是，当这份手稿准备提交时在斑马鱼身上进行的研究表明，Brachyury瞄准了几个CRM正交无尾（Ntl）在含有TGTTT核心的基序中丰富Fox结合位点中发现的一致序列(Morley等人，2009年). 这些令人兴奋的结果表明我们的发现在玻璃海鞘并为未来的研究开辟了新的视角。
这个顺时针方向因此，CRM应提供易于操作的系统用于未来对CRM结构和功能的调查，以及潜在的Foxa2和Brachyury相互作用的晶体学分析蛋白质与它们的目标CRM建立联系，并且可能彼此建立联系。在一个从更广泛的角度来看，本研究提供的见解应该是适用的Brachyury和FoxA直系亲属拥有的其他组织和模型系统已被证明可以协同调节基因表达。
笔记
我们感谢Yutaka Nibu博士以及Di Gregorio和Nibu实验室的成员对手稿进行有益的讨论和评论。我们是感谢两位匿名评论员的宝贵意见和建议。我们感谢David N.Keys博士提供的XPA16474构造，Irina女士Pyatigorskaya寻求技术帮助，Nori Satoh博士负责cDNA收集。A.D.G.是Irma T.Hirschl学者。这项工作得到了拨款的支持NIH/NICHD医院R01HD050704和1-FY08-430来自Dimes出生缺陷基金会A.D.G.存放在PMC中，12个月后发布。
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