对单个重塑核小体的分析显示hSWI/SNF导致组蛋白-DNA接触减少

摘要

简介

染色质包裹核DNA，从而控制真核基因组的功能。将DNA包装成核小体阵列，核小体可以折叠成高阶结构，为细胞在细胞核中组织基因组提供了一种方法。这些结构还提供了一种方法来严格控制对DNA序列的访问。许多序列特异性DNA结合因子和一般转录因子不能与核小体DNA结合(1,2). 因此，它们需要酶活性来暴露其结合位点以实现其功能。

不同类型的活动作用于染色质模板，并导致DNA可及性的变化。各种酶共价修饰组蛋白或DNA(三,4)而其他人则使用ATP水解来改变组蛋白与DNA的接触。后者被称为染色质或核小体重塑因子。这些酶几乎参与了所有基于DNA的过程，包括复制、DNA损伤修复和转录。因此，染色质重塑是细胞活力、体内平衡和后生动物正常发育所必需的(5,6).

迄今为止研究的所有依赖ATP的染色质重塑物都属于ATP酶SNF2超家族。根据其主要蛋白质序列，它们被分为亚科(7,8). 来自众多实验室的大量工作表明，这些亚家族在核小体结合和重塑特性方面既有相似之处，也有差异(6,9). ISWI-和SWI/SNF型酶是两类丰富的重塑因子，显示出这种差异。例如模拟开关（ISWI）-与核小体家族成员相比，该家族可以定期间隔核小体阵列开关/蔗糖-非发酵（SWI/SNF）-系列(10,11). 此外，ISWI家族重塑复合物需要相邻的裸DNA有效重塑，而SWI/SNF复合物则不需要。然而，这两个重塑复合物家族在平移核小体的能力上相似（这种机制称为“滑动”）。

SWI/SNF酶是否产生与基于ISWI的因子不同性质的产品，以实现其体内监管职能仍然是一个有争议的问题。与ISWI相关酶不同，SWI/SNF类型的因子能够有效地将整个核小体DNA暴露于核酸酶，促进转录因子以ATP依赖的方式与核小体DNA结合(12–18). SWI/SNF复合物形成改变的拓扑结构、不寻常的双核体物种，并能转移八聚体(19–22)这些特性导致人们提出，它们可能通过与其他重塑复合物不同的机制，严重破坏组蛋白与DNA的接触。

有两个突出的假设可以解释为什么SWI/SNF重塑器可以执行其他人无法执行的功能。第一种认为SWI/SNF重塑剂具有特别强大的移动核小体的能力，可以将核小体从DNA片段末端移走或移到相邻的核小体中(21,23–27). 第二个假设提出SWI/SNF家族重塑物诱导DNA环(28–31)这个环允许进入核小体起始位置内部的位点(20,32–34)

这些机械问题尚未解决，部分原因是技术限制。事实上，大多数研究核小体重塑的方法都依赖核酸酶和/或核小体电泳迁移率的变化(6,35)因此仅限于观察核小体的数量。重塑因子很少产生单个重塑产物，而是产生一组重塑核小体，因此这些技术着眼于产品光谱的平均分布。为了避免这些问题，光学或磁阱被用于测量单分子重塑的能量学。这些分析揭示了重塑过程的许多物理特征，如破坏核小体所需的力、DNA追踪的参与和过程以及DNA环的形成(36). 在另一项研究中，Wang和他的同事探索了ySWI/SNF通过解压缩DNA双螺旋来重塑的单个核小体上的组蛋白-DNA接触，并将其“断裂特征”与核小体底物的“破坏特征”进行了比较。然而，这种方法一次只能监测大约一半的核小体，因为核小体被分析破坏了稳定性(37). 因此，迄今为止，尽管非常有价值，但之前的研究并未提供关于单个DNA分子在整个重塑核小体长度上的可及性的信息。

为了更直接地解决改型产品的性质，我们开发了一个体外测量核小体重塑后单个分子上组蛋白-DNA接触的方法。我们比较了ISWI或SWI/SNF家族重塑复合体创造的数百种个体重塑产品。使用该方法获得的数据与之前的研究一致，这些研究表明，在大量人群中，SNF2H、人类ISWI同源物和含SNF2H的复合hACF重新定位核小体并保持其结构完整。数据也支持先前的观察结果，即BRG1和含BRG1的复合物hSWI/SNF在核小体上产生更高和更广泛的DNA可及性。然而，我们详细的单分子分析表明，这种整体可及性是平移核小体位置的异质性以及大量核小体的结果，这些核小体显示了延伸至DNA片段末端的减少的（亚核小体大小）DNA保护。这些数据排除了创建稳定环作为允许访问内部位点的机制的必要性，并支持SWI/SNF家族复合物在移动核小体位置时特别有效的假设。

材料和方法

限制性酶可及性分析

REA反应是通过添加50 nM的³²P标记的M601核小体到含有重塑酶（SNF2H:530 nM；hACF:160 nM；BRG1:690 nM和hSWI/SNF 68 nM）和25 U MfeI以及30°C下0、2.5或5 U M.SssI的混合物（如图2)和2 mM ATP。在不同时间取出等分试样，并在1.5体积的停止混合液中淬火（10%甘油、70 mM EDTA、20 mM Tris、pH 7.9、2%十二烷基硫酸钠和二甲苯-氰醇）。用20μg蛋白酶K（Novagen）在37℃脱蛋白至少1 h后，在4.5%天然聚丙烯酰胺凝胶（0.5×TBE）上从未切割DNA中分离切割DNA。使用ImageQuantTL软件（GE Healthcare Life Sciences）对数据进行量化。

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图2。

(A类)用SDS-PAGE分离核小体重塑分析中使用的蛋白质，并用考马斯蓝染色进行可视化。分子量显示在左侧，酶显示在顶部。(B类)M.SssI存在下的重塑活动分析。限制性内切酶可及性（REA）分析测量了在没有或存在M.SssI的情况下，重塑因子在bp位置108（距离第一个保护位点31bp）暴露MfeI限制性位点的能力。M601核小体（50 nM）与MfeI（25 U）在不存在（蓝色曲线）或存在（2.5 U，紫色曲线；5 U，红色曲线）M.SssI的情况下孵育。在没有或存在重塑酶的情况下的反应分别用菱形图或圆形图表示（如每块面板顶部所示）。有重塑剂但无ATP的反应以黑色绘制。酶的使用浓度如下：SNF2H:530 nM；hACF:160nM；BRG1:690 nM和hSWI/SNF 68 nM。利用KaleidaGraph软件，利用反应的明显终点，利用一级指数衰减，对数据（通过至少两个独立实验的平均值获得）进行曲线拟合。k个_{光突发事件}对于SNF2H=0.18±0.01分钟⁻¹无M.SssI，0.19±0.01分钟⁻¹+2.5 U M.SssI和0.15±0.01分钟⁻¹+美国密歇根州立大学。k个_{光突发事件}hACF=0.08±0.01分钟⁻¹无M.SssI，0.09±0.01分钟⁻¹+2.5 U M.SssI和0.09±0.01分钟⁻¹+美国密歇根州立大学。k个_{光突发事件}对于BRG1=0.02±0.001分钟⁻¹无M.SssI，0.019±0.001分钟⁻¹+2.5 U M.SssI和0.02±0.001分钟⁻¹+美国密歇根州立大学。k个_{光突发事件}对于hSWI/SNF=0.13±0.01分钟⁻¹无M.SssI，0.11±0.01分钟⁻¹+2.5 U M.SssI和0.1±0.005分钟⁻¹+美国密歇根州立大学。(C类)将核小体（50 nM）培养为图3，但省略了添加重塑剂。然后用M.SssI（5U）甲基化核小体，用天然凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色观察。切除并用于分析的凝胶区域由黑色边框分隔。(D类)单个DNA分子的示意图。用PCR扩增切下的凝胶切片（黑框，第1道）中的亚硫酸氢盐转化DNA，克隆并测序。每行代表单个DNA克隆的序列，圆圈代表CpG二核苷酸。甲基化和非甲基化CpG分别用填充（黑色）和开放圆圈表示。(E类)甲基化频率通过面板D中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定给定CpG位点的甲基化频率，并以百分比表示。CpG相对于DNA序列的位置显示在X（X）-轴和克隆号显示在Y（Y）-轴。

结果

一本小说体外ATP依赖性核小体重构分析

为了描述单个核小体上ATP依赖性重塑是如何发生的，我们用M.SssI DNA甲基转移酶甲基化暴露的CpG位点上的重塑模板，凝胶纯化并测序单个样本。这种方法是基于Kladde和Simpson的研究，他们最初开发了一种使用M.SssI监测酵母中平均DNA可及性的方法(42,43). 蛋白质与DNA的高亲和力结合保护DNA不被甲基化。因此，M.SssI可用于探测核小体或重塑核小体中哪里存在可访问的CpG碱基对（bp）。为了实现单分子分辨率，该方法被扩展到使用常规亚硫酸氢盐处理、PCR、克隆和测序单个DNA片段来分析甲基化模式(44,45).我们和其他人已经应用这项技术来绘制核小体位置和转录因子的结合体内(45–48). 在这里，我们开发了一个体外系统研究重塑后重组单核小体发生的稳定变化。

典型核小体的形成使得组蛋白相关DNA无法通过M.SssI在CpG位点甲基化(42,43). 重塑改变核小体的位置，并可能改变DNA在核小体表面的构象。通过研究单个重塑产品上CpG位点甲基化的可及性，我们能够比较这些产品与起始材料的差异以及不同的重塑酶如何生成不同类型的产品。

为了提高分析的分辨率，我们修改了“601”核小体定位序列(38)因此它含有更多的CpG二核苷酸，并以此为模板组装核小体(图1). 我们将此修改后的模板称为M601（修改后的601）。使用从HeLa细胞纯化的组蛋白，通过盐透析将M601 DNA组装成单核小体。在我们的组装条件下形成的主要核小体物种是在甘油梯度上分离出来的，根据甲基化模式判断，发现其与之前在601序列中观察到的核小体位置相同(图2C和D，见“材料和方法”部分）。

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图1。

(A类)M601 DNA序列用于重塑分析。位于DNA结构侧翼的GRP78基因引物序列下划线，CpG二核苷酸以灰色突出显示。粗体的残基表示组蛋白八聚体在核小体底物上引起保护的大致位置。(B类)用于对重塑产品进行单分子分析的程序示意图。使用M601 DNA组装核小体。在与（或不与）核小体重塑因子孵育后，用M.SssI CpG甲基转移酶将重塑的核小体甲基化，以创建DNA可接近性的足迹（DNA甲基转移酶仅甲基化不与组蛋白结合的胞嘧啶残基）。在自然电泳、切除和凝胶洗脱后，核小体被脱蛋白，核小体DNA分子接受常规亚硫酸氢处理以揭示其甲基化模式。将这些模式的变化与输入的核小体进行比较，以评估因重塑因子的作用而引起的组蛋白-DNA接触的变化。

SNF2H重塑产物与典型核小体的比较

ISWI家族因子如SNF2H已被证明在重塑后保持核小体的典型结构。这些酶主要通过滑动核小体来改变DNA通路(49–51). 为了确定SNF2H生成产物的光谱，我们对100个由重塑反应产生的核小体进行了表征。在有无SNF2H的条件下培养单核小体，并用ADP终止反应。然后用M.SssI将重塑产物甲基化。添加竞争DNA后，使用自然电泳分离核小体(图2C、 车道1和3A，车道2-5）。在进行标准亚硫酸氢盐处理以脱除非甲基化胞嘧啶残基之前，切除主要带，将其内容物从凝胶中洗脱，核小体DNA脱蛋白。使用PCR扩增分子，克隆并测序以揭示哪些胞嘧啶残基被甲基化。据此推断单分子上的DNA可及性。结果显示通过填充圆指示可接近的残留物(图2D） ●●●●。为了反映重塑反应后形成的物种的比例，我们调整了每个物种相对于该物种在天然凝胶上的强度显示的序列数(图3B–F）。由于最初对这些物种的克隆数量进行了相似的分析，我们随机排除了代表性不足的物种的克隆；我们在补充信息（图S1和S2）.

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图3。

(A类)SNF2H重塑产物的自然电泳。将核小体（～100 nM）与递增浓度的SNF2H（车道2:6 nM；车道3:19 nM；通道4和5：57 nM）在存在（车道2-4）或不存在（车道5）ATP（1 mM）的情况下培养，如顶部所示，在30°C下培养1小时。通过添加ADP（10 mM）停止反应，并在冰上孵育10分钟。重塑产物的甲基化如下。添加M.SssI（5U）和S-腺苷蛋氨酸（160μM）后，在37°C下培养反应15分钟。加入竞争质粒DNA后，用天然凝胶电泳分离重构反应，并用溴化乙锭染色观察。切除并用于分析的凝胶区域由黑色框架界定。当凝胶切片组合在一起时，后框架用虚线连接。(B–F类)SNF2H重塑的单个DNA分子的示意图。凝胶切片（黑框，3-5道）中的亚硫酸氢转化DNA通过PCR扩增、克隆和测序。单个DNA克隆如所述图2D.所示重塑分子的数量与在酶浓度下重塑后产生的条带的平均强度成正比，允许在三个独立实验中实现最大重塑。(G公司)给定CpG位点的甲基化频率。上面板：甲基化频率通过面板F中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（无ATP反应）。下面板：甲基化频率通过面板B–E中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（与ATP的反应）。在上面板和下面板中，在没有重塑物的情况下从核小体底物获得的频率(图2E） 以灰色显示以供比较。

与单独的核小体相比，在没有ATP的情况下向反应中添加重组SNF2H导致CpG#5甲基化适度增加（约12%）(图3F和G，上部面板）。否则，无重塑剂的核小体和无ATP的反应都显示出M601序列上核小体的保护作用。SNF2H和ATP的添加导致大多数分子的DNA可及性发生变化(图3A、 车道2–4和面板B–E）。组蛋白八聚体引起的保护作用被转移到DNA的两端。有趣的是，SNF2H以明显的序列偏差改变了核小体保护(图3，面板B–E，注意本图中碎片“右侧”的移动增加）。平均单个CpG位点的甲基化变化证实，总的SNF2H优先将组蛋白八聚体定位在CpG#11（bp：134）和CpG#23（bp：252）之间，暴露CpG#6和#10之间的DNA（bp：77和116）；图3C–E和G下面板）。量化所有分析分子的甲基化位点可及性表明，总体SNF2H重塑增加了约14%的DNA可及性。

这些结果与以前的研究基本一致，这些研究表明通过ISWI型重塑剂动员核小体不会产生具有非规范结构的核小体(49–51). 然而，一些单个分子显示出的模式不容易与规范结构相协调。考虑到整个片段中CpG间距的不规则性，我们通过记录甲基化发生位置的限制来计算每个分子上保护DNA的上限。虽然近90%的输入核小体显示出保护模式，最大大小在146到170 bp之间，但在SNF2H重塑后，<40%的核小体仍保持这种大小分布。令人惊讶的是，超过20%的重塑核小体显示出比预期的标准核小体更小的保护作用（121到145-bp），而其他核小体的保护作用大于171-bp（参见图7A） ●●●●。

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图7。

(A类)无（Nuc）或有（如X（X）-轴）重塑因子。条形图表示序列显示保护的百分比，大小范围如下：0-45、46-70、71-95、96-120、121-145、146-170、171-195、196-220和221-245-bp，如右侧色码所示。(B类)直接比较核小体重塑因子产生的平均DNA可及性（如右侧色码所示）。核小体在给定CpG下的甲基化平均值(图2E） ，SNF2H(图3G、 下部面板），hACF(图4F、 下部面板），BRG1(图5G、 下部面板）和hSWI/SNF(图6F、 下部面板）显示为曲线以清晰显示。

hACF改造产物的分析

ISWI运动蛋白与非催化亚基结合后的重塑特性变化(10,49,50,52–56). 因此，我们研究了SNF2H与hACF1蛋白的关联对核小体重构结果的影响。在这些条件下，用不含ATP的核小体孵育这种复合物，可及性变化很小(图4E和F，上部面板）。根据REA测定，该复合物具有活性(图2B） 然而，当ATP被添加到反应中时，这种复合物对核小体电泳迁移率的影响有限（但值得注意）(图4A、 将泳道9与泳道6-8进行比较）。这是意料之中的，因为这种复合物已被证明有利于大多数重塑的单核小体位于中央的稳定状态(57)与本实验中的起始基板类似。

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图4。

(A类)hACF重塑产物的天然电泳。如顶部所示，在存在（车道6-8）或不存在（车道9）ATP（1 mM）的情况下，将核小体（～100 nM）与浓度不断增加的hACF复合物（车道6:8 nM；车道7:24 nM；通道8:72 nM）一起孵育。反应的处理与图3. (B–E类)hACF重塑的单个DNA分子的示意图。用PCR扩增凝胶切片（黑框，6-9道）中的亚硫酸氢盐转化DNA，克隆并测序。单个DNA克隆如所述图3. (F类)给定CpG位点的甲基化频率。上面板：甲基化频率通过面板E中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（无ATP反应）。下面板：甲基化频率通过面板B–D中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（与ATP的反应）。在上部和下部面板中，在没有重塑器的情况下从核小体基底获得的频率(图2E） 以灰色显示以供比较。

从重塑后形成的最显著物种中分离出的核小体显示甲基化保护区主要位于中心位置，但这些位置比起始材料更异质（相比之下图2D至​至4B–D；4B–D；图4F、 下部面板）。从重塑反应后形成的小种中分离出的核小体显示出明显的远离中心位置的平移运动。这些数据表明，hACF反应的个别产物与分离的SNF2H催化的反应产物在位置上有很大不同，这证实了基于整个反应分析的先前结论。我们还注意到保护作用在121–145-bp之间的核小体数量略有增加（8%），尽管hACF比SNF2H（23%）发现的核小体小于标准大小。此外，存在将核小体移向片段“右侧”的偏向，这表明该复合物的序列偏向与分离SNF2H类似。

BRG1和hSWI/SNF产生广泛分布的保护模式，其大小可以是亚核小体

一些比较研究表明，ISWI和SWI/SNF亚家族在重塑核小体时发挥不同的功能(34,58–60). 具体来说，SWI/SNF家族复合物可以有效地进入起始核小体内部的位点。为了确定这是否是由于产生了DNA与组蛋白八聚体“环状”分离的产物，或产生了在片段上显著重新定位以打开中心区域的产物所致，我们检测了大约100个被BRG1或hSWI/SNF重塑的个体物种。

在这些条件下，用不含ATP的BRG1酶培养中心定位的M601核小体不会导致核小体迁移率或核小体DNA可及性的可检测变化(图5A、 通道13，F和G，上部面板）。当ATP存在时，大多数核小体被重塑，核小体保护作用从DNA片段的中心转移到两端(图5A、 将通道13与10–12进行比较，并将面板F与B–E进行比较）。有趣的是，与SNF2H观察到的不同，BRG1在核小体保护的重新定位方面没有显示出明显的方向性偏差（相比之下图3C–E至图5C–E）。因此，BRG1产生了相对一致的整体可及性，如整个核小体群体甲基化的量化所示(图5G、 下部面板）。这一观察结果与我们之前的研究一致，该研究表明，通过核酸酶消化测量，BRG1产生具有不同DNA序列的多种重塑产物(33). 然而，甲基转移酶的使用表明，与SNF2H等重塑剂相比，这种总的DNA可及性是由于产生了广泛的八聚体位置，而没有明显的环形成证据。

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图5。

(A类)BRG1重塑产物的天然电泳。如顶部所示，在存在（10–12道）或不存在（13道）ATP（1 mM）的情况下，将核小体（～100 nM）与BRG1浓度增加（10道：55 nM；11道：170 nM；12道和13道：500 nM）一起孵育。反应的处理与图3. (B–F类)BRG1重塑的单个DNA分子的示意图。用PCR扩增凝胶切片（黑框，10–13道）中的亚硫酸氢转化DNA，克隆并测序。单个DNA克隆如所述图3. (G公司)给定CpG位点的甲基化频率。上面板：甲基化频率通过面板F中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（无ATP反应）。下面板：甲基化频率通过面板B–E中显示的所有DNA分子的平均甲基化来确定（与ATP的反应）。在上部和下部面板中，在没有重塑器的情况下从核小体基底获得的频率(图2E） 以灰色显示以供比较。

虽然BRG1单独能够重塑核小体，但整个hSWI/SNF复合物的重塑效率明显更高(61). 因此，我们有兴趣确定hSWI/SNF创造的重塑物种的光谱，并确定其与BRG1创造的产品的差异。与未反应核小体相比，在没有ATP的情况下向核小体中添加hSWI/SNF可显著增加CpG位点#6和#7的甲基化（分别增加16%和21%）。在核小体的另一个入口/出口点，即CpG#21，也出现了类似的增加（从34%增加到53%；图6A、 通道17、6E和F，上部面板）。有趣的是，在同一核小体的一侧或两侧观察到可及性的增加(图6E） ●●●●。

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图6。

(A类)hSWI/SNF重塑产物的自然电泳。如顶部所示，在存在（14–16道）或不存在（17道）ATP（1 mM）的情况下，将核小体（～100 nM）与不断增加的hSWI/SNF复合物浓度（14道：6 nM；15道：19 nM；16道和17道：56 nM）一起孵育。反应的处理与图3. (B–E类)hSWI/SNF重塑的单个DNA分子的示意图。用PCR扩增凝胶切片（黑框，14-17道）中的亚硫酸氢转化DNA，克隆并测序。单个DNA克隆如所述图3. (F类)给定CpG位点的甲基化频率。上图：甲基化的频率是通过对图E中显示的所有DNA分子的甲基化进行平均来确定的（无ATP的反应）。下面板：甲基化的频率是通过对面板B–D中显示的所有DNA分子（与ATP的反应）的甲基化进行平均来确定的。在上部和下部面板中，在没有重塑器的情况下从核小体基底获得的频率(图2E） 以灰色显示以供比较。

添加ATP后，hSWI/SNF复合物产生了DNA保护的广泛再分配(图6A、 车道14–16和面板B–D）。值得注意的是，保护装置的尺寸分布与SNF2H和hACF改造产品的分布形成了对比。超过60%的分子表现出小于146-bp的保护作用（96-120 bp之间为17%，121-145 bp之间为45%，图7A） ●●●●。很明显，hSWI/SNF在暴露起始定位核小体的伪并矢轴周围的位点方面特别有效(图6F、 下部面板和7B）。这是由于hSWI/SNF倾向于将核小体移向DNA片段的末端，并创建比标准核小体观察到的更小的保护区域。有趣的是，我们注意到BRG1和hSWI/SNF的重塑活性之间存在质的差异，因为ATPase本身不能产生与复合体一样多的最小大小核小体。事实上，只有大约30%的BRG1产品具有小于146-bp的保护，而hSWI/SNF产生的保护是这些产品的两倍（相比之下图5E和​和6D，6D、 并参阅中的摘要图7A） ●●●●。除了创造更大的产品谱外，hSWI/SNF还使游离DNA增加了约3-4%(图6A、 总之，通过减少组蛋白产生的保护作用的大小并导致其广泛分布(图6C和D），hSWI/SNF复合物显著增加了整个核小体DNA片段的总DNA可及性，当可及性在平均群体上确定时(图6F、 下部面板和7B）。电泳前对整个反应进行分析时也得到了类似的结果（数据未显示），这表明我们将分析重点放在天然凝胶上的主要产物上，没有遗漏显著的重塑产物。总之，这些数据表明，在组蛋白八聚体表面不产生稳定的环的情况下，可以实现广泛的核小体DNA可及性。

讨论

检测ATP依赖的染色质重塑蛋白产生的多个单一产物的能力是有用的，因为这些复合物产生异质重塑产物。这种异质性阻碍了对重塑反应产物性质的明确解释。先前对重组反应体产物的表征得出了几个重要结论：许多重组子可以改变核小体的平移位置；ISWI家族重塑复合物倾向于产生具有标准核小体特征的产物；SWI/SNF家族重塑复合物可以从DNA中移除核小体，并可以创建具有改变特征和拓扑结构的核小体结构。通过表征两个主要重塑因子家族的数百个重塑反应产物，我们能够检索到有关核小体重新定位的方向性和序列偏差、重塑核小体引起的保护大小、，单个分子和人群中的DNA可及性。SWI/SNF家族的个别产品被发现具有受组蛋白保护的异常短的DNA区域。虽然ISWI复合体主要产生具有重新定位的典型核小体特征的物种，但它们也能够产生比典型核小体短的受保护DNA延伸的物种。

此处观察到的重塑产物的特征证实了先前的观察结果，即ISWI和SWI/SNF家族中的复合物在重塑核小体时产生不同的结果，并扩展了这些差异的性质。这两个复合体家族都产生了比起始核小体大小更为异质的DNA保护。完整的hSWI/SNF复合物产生的产品异质性最大，而hACF的异质性较小。此外，与hSWI/SNF重塑反应相比，ISWI家族反应在核小体移动的方向上显示出明显的偏差。已知ISWI相关酶显示出方向偏差，这取决于核小体两侧DNA的长度。然而，起始底物两侧有77和80-bp，而SNF2H和hACF只能区分分别短于40和60-bp的DNA长度(57). 因此，如前所述(62)ISWI酶可能表现出对特定DNA特征的偏好，某些模板上的hSWI/SNF也可能表现出这种偏好(63). 总之，这些结果进一步证明了这两个重塑蛋白家族对ATP水解能量的利用方式不同。

我们的数据证实，在单个产品的水平上，先前的研究表明，ISWI家族因子滑动核小体，同时保持其结构完整(49–51). 然而，我们发现，单个SNF2H重塑核小体的比例比预期的典型核小体表现出更小的保护作用。对这一观察结果的一个潜在解释是，SNF2H可能会破坏DNA与H3-αN′-和可能的H2A C末端尾部之间的相互作用，并影响核小体的DNA进入/退出角度。因此，组蛋白引起的保护作用可能会降低。以前的研究表明，典型核小体在2-10%的时间内部分被打开(64)这可能与我们的发现有关。然而，在我们的测定条件下，在没有重塑因子的情况下，我们没有观察到DNA保护的显著缩短。也有可能是重塑改变了CpG二核苷酸的相位，使其更容易接触DNA甲基转移酶。在某些情况下，重塑可能已经足够有效，可以将组蛋白八聚体从DNA末端移开，这是之前为SWI/SNF功能提出的模型。

hSWI/SNF重塑主要产生的分子中，DNA保护局限于DNA的两端，大多数分子的保护大小小于典型核小体的保护大小。典型核小体核心粒子是由约146-bp的DNA包裹在左手超螺旋中的组蛋白八聚体上定义的(65). 这种DNA超螺旋在14个位点与组蛋白八聚体相互作用，称为核小体一侧的超螺旋位置（SHL）为-0.5至-6.5，另一侧为0.5至6.5。在我们的实验中，大多数起始单核小体显示保护作用在146到170-bp之间，而60%以上的SWI/SNF重塑产品仅保护作用在96到145-bp之间(图7A） ●●●●。因此，我们的数据表明，hSWI/SNF可以产生组蛋白-DNA接触显著少于典型结构的产品。

这种非规范结构解释了SWI/SNF如何在核小体中广泛获取DNA。先前的研究表明，BRG1重塑后会产生较小的MNase抗性片段，有人提出这可能是由于组蛋白八聚体表面的稳定DNA环所致(33,34). 如果这种环是常见的，那么许多八聚体将在两个或更多的延伸中庇护DNA的受保护区域。相反，对单个物种的可视化显示，这些重塑物种中的大多数几乎没有受保护的DNA，并且表明没有形成环的证据，因为我们没有观察到额外的保护补丁。重要的是，我们注意到，我们获得的甲基化模式的平均值概括了之前观察到的重塑产品的总体DNA可及性。这为我们的过程不会导致缺少可访问结构的概念提供了支持。此外，对单个hSWI/SNF重塑单核小体上DNA可及性的量化解释了为什么在重构后使用核酸酶在这些先前的研究中观察到广泛的可及性。重要的是，数据排除了允许访问内部站点的循环必要性(图7B） ●●●●。

有两种主要的变化可以解释为什么与典型核小体相比，hSWI/SNF重塑产物中的DNA受到较少的保护。首先，组蛋白八聚体的构象或完整性（或两者）可能会改变，导致DNA超螺旋围绕组蛋白的路径不同。其次，八聚体可能会随着DNA路径的改变或移动而保持不变，从而降低保护作用。关于第一种可能性，很少有人知道组蛋白八聚体在与DNA结合时是否可以采用替代（非规范）构象。最近的一项研究表明，在扭转应力作用下，核小体可以从左手构象转换为右手构象[这些粒子被称为“反转体”](66)]. 虽然已知SWI/SNF重塑会导致染色质的显著拓扑变化，但尚不清楚该复合物是否能催化这种手性转变。在之前的研究中，Allfrey和同事们假设核小体可以转化为一种称为“lexosome”的U形结构，以促进转录。该模型基于两个组蛋白H3半胱氨酸残基（位于核小体中通常无法到达的位置110）被发现与转录rDNA基因中的巯基试剂反应的观察结果。然而，这种结构后来被证明导致组蛋白丢失(67,68). 需要进行进一步的调查，以解决此类改变结构的重要性及其与重塑的相关性。

组蛋白八聚体的变化会减少组蛋白接触，包括一个或两个（H2A–H2B）二聚体的离解，以产生六聚体或四聚体。早期研究表明，SWI/SNF家族酶不需要八聚体破坏来改变核小体DNA的可及性，组蛋白八聚体结构的分离不是重塑的必然结果(23,28,69). 然而，（H2A–H2B）二聚体在重塑时会丢失(23,70)尽管它可能依赖于DNA序列或需要组蛋白伴侣(71–73). 使用601 DNA序列尚未观察到组蛋白二聚体损失，我们从该序列中获得了研究中使用的构建体(37). 我们研究中产生的重塑产品似乎在使用的低离子强度（50 mM NaCl）下保持了完整的八聚体（根据组蛋白染色判断，数据未显示）。

如果组蛋白八聚体保持完整，并且在重塑产物中处于正常配置，先前的研究表明DNA必须与每个核心组蛋白保持接触，以保持这种稳定性；否则，（H2A–H2B）二聚体预计不会与（H3–H4）稳定结合₂这些离子条件下的四聚体(74). 已经提出了几种改变DNA路径的模型。由于我们主要观察到位于DNA片段末端的较小保护区，我们的数据与典型组蛋白八聚体被“推”离DNA末端的模型一致(23,24,27,75). 这些模型表明，组蛋白八聚体上的带电表面在重塑后暴露出来。它们可以与游离DNA片段结合顺式（分子内）或反式（分子间）。如果DNA与这些暴露的表面结合顺式DNA会循环回来，而如果DNA结合在反式，结合将促进核小体二聚体的形成(17,18,21,23,75). 在后一种情况下，如果该DNA已经与组蛋白相关，则观察到的保护作用不会在此处检测的单个分子上发生改变。否则，回环可能会在核小体所在位置对面的DNA端产生保护作用。我们的数据表明，这要么是罕见的、短暂的，要么是环备份DNA与组蛋白结合的长度小于40bp（距离DNA末端最近的甲基化位点）。因为94-bp（但不是90-bp）的DNA足以组装稳定的亚核小体颗粒(76)，很容易推测，如果八聚体的另一半与DNA结合，核小体一侧约47-bp的DNA就足以保持八聚体结构。后一种考虑表明，八聚体可以从DNA末端“推离”到SHL−4.5或+4.5，而不会丢失组蛋白二聚体。

为了进一步解决这些问题，使用甲基化来研究核小体阵列上的DNA可及性将是有用的。这将有助于探索SWI/SNF有可能迫使核小体相互入侵(77)或导致包含一个以上八聚体的新物种的形成(22). 我们使用定义的三核体模板研究了这种方法的可行性。定义的三核小体依赖ATP重塑后获得的初步结果表明，在这些较长的单个分子上可以检测到可接近性模式的变化（数据未显示）。解释这些模式需要大量工作。然而，这里描述的技术可以用于单核小体或扩展到更长的核小体阵列。这种方法在进一步研究影响核小体结构的所有类型复合物的机制时应该是有用的，而不仅仅是那些涉及重塑的复合物。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

基金

美国癌症学会博士后奖学金（至T.B.M.）；美国国立卫生研究院拨款CA82422号（致P.A.J.）；美国国立卫生研究院拨款GM48045公司（对R.E.K.说）。开放存取费资金：GM48045。

利益冲突声明。未声明。

补充材料

致谢

参考文献