不同来源一氧化氮介导猫外侧膝状体核内的神经血管偶联

摘要

介绍

大脑血流和神经活动之间的关系是复杂的，而且决不能完全理解。fMRI等非侵入性光学技术可以将神经元活动与血流动力学信号的变化联系起来（Kwong等人。，1992; 小川等人。，1993; Drake和Iadecola，2007). 传统上，fMRI测量血氧水平依赖性信号，并假设神经元和代谢反应之间存在线性关系（Logothetis，2002). 然而，这种假定的线性关系现在开始受到挑战（劳里森，2001; 尼尔森和劳里森，2001; 谢斯，2004; 李和弗里曼，2007; 拉斯穆森等人。，2008). 例如，血流动力学耦合已被证明很好地符合幂律函数（Li和Freeman，2007，使用与此处所述类似的准备）。然而，正如之前在大鼠大脑皮层中所证明的那样，这与刺激强度呈线性耦合（Lauritzen，2001; 尼尔森和劳里森，2001). 拉斯穆森等人（Rasmussen et al(2008)开发了一个通用的参数数学模型，该模型利用小脑的数据表征线性偏差，表明神经血管系统对低频和短时刺激的响应表现出线性行为。在这里，我们利用新技术的组合，在一个特征明确的中枢神经系统中，研究猫视觉丘脑中的外侧膝状体核（LGN）之间的关系。

如上所述，神经血管耦合的机制仍在争论中，但包括几种可能性（不一定相互排斥），包括神经元的直接控制（Krimer等人。，1998; 帕斯卡拉斯和帕帕佐普洛斯，1998; Yang等人。，2000; Cauli等人。，2004)，K的变化⁺活性增强导致的浓度（法拉奇和海斯塔德，1998)，NMDA突触后活动后NO介导的血管扩张（Iadecola等人。，1993)NO介导的血管舒张作用与组织纤溶酶原激活物有关（Park等人。，2008)、腺苷和环氧碳三烯酸介导（Peng等人。，2002; Shi等人。，2008)与星形胶质细胞活性有关（Zonta等人。，2003; 伊德科拉和内德加德，2007). 为了进一步阐明偶联的机制以及代谢信号预测神经元活动的能力（反之亦然），我们使用了细胞外棘突活动的记录体内结合分光光度法测量氧合血红蛋白（OxyHb），作为血流指标（Devor等人。，2003). 此外，我们能够同时测量高铁血红蛋白（MetHb），这反映了局部一氧化氮水平（Kelm等人。，1997; González-Mora等人。，2002)并通过药物操纵实验改变NO环境。

鉴于目前成像技术在临床和实验研究中的相关性，对该领域的任何进一步了解都可能在解释功能磁共振成像数据等方面产生重大影响，并可能在神经化学到成像等领域开辟新的研究领域，还有助于我们对中枢神经系统功能的基本理解，尤其是视觉系统。

材料和方法

在九只成年猫的LGN（霍斯利-克拉克坐标A5.5/L8.5-9）中，用光谱光学测量法同时记录了氧合血红蛋白和甲基汞的细胞外单单位记录。用一氧化氮（70%）和氧气（30%）中的异氟醚（诱导用异氟醚-5%，手术用异氟烷2-3%，维持用0.5%-1%）对动物进行麻醉，并用没食子酸三硫醚（负荷剂量40 mg，维持用10 mg kg/h IV，见de Labra等人。，2007). 所有程序都符合西班牙生理学会、国际实验动物科学理事会和欧盟的指导方针，并得到了大学动物护理和使用委员会的批准。

潮汐末CO₂在整个实验过程中，连续监测心电图、脑电图、体温和血压（血压、毫米汞柱）。一旦达到稳定状态，监测参数中与麻醉深度变化相称的任何变化都将通过异氟醚水平的变化进行补偿。伤口边缘用皮下注射肾上腺素的盐酸利多卡因进行治疗。耳塞上涂有利多卡因凝胶。用甲硝酸阿托品和盐酸苯肾上腺素对眼睛进行治疗，用零功率隐形眼镜进行保护，并使用辅助镜片聚焦57厘米远的半透明切线屏幕。视觉刺激通过3mm人工瞳孔单眼观察。为了进一步减少可能的眼球运动伪影，将固定在立体定向框架上的柱子固定在巩膜上。实验结束时，所有动物都被过量麻醉剂无痛杀死。

结果

一般调查结果

总共完成了72次录制。图中显示了自发活动和视觉驱动活动期间氧血红蛋白和甲基汞分光光度信号的典型示例​图1A。1A.视觉刺激的呈现（全场正弦漂移光栅-在本例中为最大对比度）引起吸光度增加，如方框内区域所示。在视觉刺激呈现期间，信号强度相对恒定。插入框显示了同时记录的单个单元格的视觉诱发响应。图中的图形​图1B1B示出了在所有记录会话的刺激呈现期间OxyHb和MetHb的平均增加（两者都显著升高，第页 < 0.05），表明在视觉刺激期间，血流和NO生成均显著增加。

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图1

视觉刺激对OxyHb和MetHb水平的调节.（A）视觉刺激对代谢标记物影响的典型示例。每个记录都显示了一段自发活动的时间，在此之前的一段视觉刺激（盒子内的区域）会产生氧血红蛋白和甲基汞水平的增加（同时记录）。两张图中的虚线表示平均未刺激活动加上2 SD。因此，视觉诱发活动将被视为显著增加。插入框显示视觉刺激（漂移正弦光栅）诱发的神经元活动。（B）OxyHb和MetHb水平的平均变化。

与刺激强度的关系

NR、OxyHb和MetHb测量值随刺激强度变化。图​图22显示了在呈现视觉刺激期间测得的变化，而在所有记录（即人口数据）中，视觉刺激的变化是不同的。0%表示控制，非模拟条件。对于NR（顶部），有可测量的自发活动，如Y（Y）-轴。对于OxyHb和MetHb，每个值都以基础值的百分比变化形式给出。所有参数都显示出明显的对比度增量，但只有神经元信号在较高的对比度下显示出饱和的迹象。为了更深入地了解被测变量之间的相互作用，我们应用了多重多项式回归模型。成功收集所有四个变量（NR、OxyHb、MetHb和对比度）的观察数为56。检测到一个异常值。以下回归分析是在样本中排除该值的情况下进行的。

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图2

代谢和神经元反应与刺激强度的关系.（A）对比度响应曲线显示，对比度从0%（背景细胞活性）到100%（相对于神经元反应）不等。氧合血红蛋白（B）和MetHb（C）获得的水平与不同的对比度值。所有数据点均为平均人口数据。

（i） NR可以通过两个协变量（MetHb和OxyHb）的线性模型进行部分解释。这个第页-完整模型中的ST值为第页 = 0.3622. 解释神经元反应的线性双协变量回归模型为NR=7.9073+1.52353·OxyHb+28.6009·MetHb，解释了约36%的NR变异性(R（右）² = 0.36001). 该拟合预测的相对均方根误差为0.3704。这意味着使用该模型可以预测NR，相对误差约为37%（图​（图3A）。三A） ●●●●。这并不意味着NR不受刺激强度的影响，但刺激强度不会为模型提供任何附加值。

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图3

从模型中获得的预测（I）对于ST的每个固定值，重复实验几次，获得不同的OxyHb（基线的%）、MetHb（基线的%）和神经元反应值。神经元反应的预测观察图（A），氧血红蛋白（B）和MetHb（C）使用上述多元多项式回归模型。水平轴表示预测值，而垂直轴表示观测值。直线是完美预测的对角线。

（ii）OxyHb可以通过NR中的二次多项式和ST中的一次多项式进行拟合。完整模型中的MetHb系数不显著(第页 = 0.2000），可以删除此变量。所得多项式回归模型为OxyHb=12.4368−0.280007·NR+0.00428137·NR² + 0.0547904·ST，捕获约46%的OxyHb变异性(R（右）² = 0.459758). 该拟合预测的相对均方根误差为0.2397。这意味着使用该模型可以预测OxyHb，相对误差约为24%（图​（图3三B） ●●●●。

（iii）MetHb：最后，ST中的二次多项式回归模型可用于解释MetHb:MetHb=0.0547871+0.0128768·ST−0.0000824903·ST²约占MetHb变异性的37%(R（右）² = 0.372125). 氧血红蛋白(第页 = 0.2292）和NR(第页 = 0.0941）在添加到模型中时并不显著。该拟合预测的相对均方根误差为0.6154。这意味着使用该模型可以预测MetHb，相对误差约为62%（图​（图3三C） ●●●●。

在我们的第二种方法中，再次将多元多项式回归模型应用于每只动物不同刺激强度下获得的OxyHb、MetHb和NR的平均值。这样做是为了消除每个受试者体内MetHb、OxyHb和NR的采样可变性。因此，以下模型无法解释受试者内部的可变性。完全收集了所有四个变量的观察数为19，没有发现异常值。

（iv）NR可以通过具有两个协变量的线性模型进行部分解释：MetHb和OxyHb。这个第页-完整模型中的ST值为第页 = 0.5628之间。解释神经元反应的线性双协变量回归模型为NR=10.6949+0.559294·OxyHb+52.3099·MetHb，这解释了约84%的NR变异性(R（右）²= 0.8430). 该拟合预测的相对均方根误差为0.1806。这意味着使用该模型可以预测NR，相对误差约为18%（图​（图44A） ●●●●。

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图4

模型预测（二）对每只动物采样神经元的平均值再次应用多元多项式回归模型。神经元反应的预测观察图（A），氧血红蛋白（B）和MetHb（C）水平轴表示预测值，垂直轴表示观测值。直线是完美预测的对角线。

（v） OxyHb可以通过ST中的线性模型进行拟合。完整模型中的MetHb系数不显著(第页 = 0.7668），该变量可以从模型中删除。NR也是如此(第页 = 0.7399). 得到的多项式回归模型为OxyHb=4.06831+0.279548·ST，它捕获了约28%的OxyHb变异性(R（右）² = 0.2837). 该拟合预测的相对均方根误差为0.6968。这意味着使用该模型可以预测OxyHb，相对误差约为70%（图​（图44B） ●●●●。

（vi）MetHb：ST中的线性回归模型可用于解释MetHb:MetHb=0.110922+0.00563275·ST，约占MetHb变异性的78%(R（右）²= 0.7819). 氧血红蛋白(第页=0.7668）和NR(第页=0.3322）添加到模型中时不显著。该拟合预测的相对均方根误差为0.2713。这意味着使用该模型可以预测MetHb，相对误差约为27%（图​（图44C） ●●●●。

与NO源的关系

上述结果显示了氧血红蛋白和甲基汞之间的关系，这就提出了一个关于NO生成是如何控制的问题。在视觉丘脑中，NO有两个主要来源：（i）内皮NO，通过神经元和/或星形胶质细胞介导的调节；（ii）从脑干臂旁区的传入胆碱能-氮能纤维释放的神经元NO，猫的臂旁区是LGN中神经元NO的唯一来源（Bickford等人。，1993，但请参阅第节“讨论”和Bickford等人。，1999). 一个似是而非的解释是，这两种NO来源在不同的神经活动水平上发挥作用。我们通过比较特定nNOS阻滞剂和非特异性阻滞剂的作用来验证这个假设。

注入我-NOArg使血压升高（平均值±SEM:123±9/86±4至136±8/103±3第页 ≤ 0.05,t吨-测试）。注射后约14分钟检测到。与公布的数据一致（Schulz等人。，1995; Cholet等人。，1997; 科斯和余，2000; Jiang等人。，2002)，7-NI没有显著改变血压。

结果如图所示​图5。5.图​图5A5A表明，两种抑制剂在高强度（对比度=100%）和低强度刺激（对比度=10%）下都能显著降低NRs我-NOArg在这两种情况下都更明显，正如非特异性抑制剂所预期的那样。有趣的是，虽然我-NOArg对NO和OxyHb水平的影响类似（图​（图5B、C、，5B、 7-NI在所有刺激强度下均表现出刺激特异性效应，仅在高强度刺激下起作用，在低对比度刺激期间不影响诱发NO和OxyHb。数据支持这样的观点，即nNOS可以减少高对比度和低对比度时的放电，但会对血流产生不同的影响。我们在图中以另一种方式研究了这种现象​图6：。6该图比较了7-NI作用前后低对比度和高对比度刺激下的血流变化百分比（氧血红蛋白水平）和神经反应。而在高对比度刺激下，这两个参数均显著降低（细胞放电27%：55±16至40±10；氧合血红蛋白45%：31±10至14±4.7），即使神经元活动水平显著降低（64%，19.5±5至7±1），在低对比度刺激呈现期间，对血流也没有明显影响（8.7%，从6.9±1.8至7.5±0.5）。这表明在这两种刺激强度下，血流和神经反应显著脱钩。

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图5

一氧化氮合酶阻断对神经元和代谢信号的影响。7-NI（特定nNOS阻断剂）后获得的效果或我-静脉注射NOArg（非特异性NOS阻滞剂）对神经元反应的影响（A），甲血红蛋白（B）和氧血红蛋白（C）用于高对比度刺激（100%，图形左侧的条形图）和低对比度刺激的条形图（10%）*代表显著差异(t吨-测试；第页 < 0.05）。

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图6

刺激强度对血流与神经反应耦合的影响在两种刺激条件下（高对比度（100%）和低对比度（10%）），通过血氧血红蛋白水平测量的血流值直接与对照组和7-NI条件下的神经反应进行比较。当nNOS被阻断时，即使神经元活动水平显著降低，在低对比度刺激呈现期间，对血流也没有显著影响*代表显著差异(t吨-测试；第页 < 0.05).

讨论

我们的结果证明了NO生成、血流和NRs之间的关系，表明NO能够调节大脑活动区域的血流，不同来源的一氧化氮在不同水平的反应中起着特殊作用。维持较高神经元活性和保证较高OxyHb可用性所必需的NO的产生似乎来自nNOS。在这种情况下，在低强度刺激下，血流的初始增加是通过一种机制实现的，这种机制需要基础NO浓度的小幅度增加。我们的数据无法解释低水平的视觉活动能够产生少量NO增量的机制，但强烈表明与eNOS激活有关。在基础条件下，补剂释放NO是静息脑血流量的重要调节器。已经证明，eNOS是NO的重要来源，有助于大脑动脉的基调（Tanaka等人。，1991; Wang等人。，1995; Atochin等人。，2003)然而，众所周知，神经刺激后会发生脑血管扩张（Cox等人。，1993; Iadecola等人。，1997). 在我们的案例中，对我们数据的一个简单解释是，NO的初始变化来自星形胶质细胞中NOS的内皮亚型（Wiencken和Casagrande，1999)响应视网膜谷氨酸能输入LGN细胞。众所周知，谷氨酸能调动钙²⁺储存在星形细胞端足中，这导致局部脑小动脉扩张（Zonta等人。，2003). 一些介质与这些血管变化有关，但明显包括星形细胞eNOS激活产生的NO（参见Iadecola和Nedergaard，2007用于最近的审查）。另一方面，高强度刺激（在我们的例子中，使用高对比度）会激活脑干系统。现有证据表明，在猫的丘脑中，nNOS特别位于胆碱能脑干-丘脑轴突（猫LGN中神经元来源NO的主要来源，见Bickford等人。，1993，但另请参见Bickford等人。，1999，表明在一小部分内在抑制性中间神经元中存在局部NOS），并且众所周知，由于脑干激活系统的活动，LGN中的NO生成与视觉处理直接相关（有关综述，请参阅Cudeiro和Rivadulla，1999). 根据我们提供的数据，我们可以认为脑干输入似乎能够通过释放NO来调节神经元活动，NO不仅作用于神经元，也作用于血管，调节神经反应所需的氧气储存。虽然MetHb水平（NO标记物）的变化相对较小，但重要的是要强调，这些变化具有统计学意义，并且与视觉反应的程度明显相关。到目前为止，很少有研究使用分光光度法作为评估NO水平变化的技术；然而我们的数据与其他人的观察结果非常吻合（Kelm等人。，1997; González-Mora等人。，2002).

我们必须质疑我们的数据在多大程度上与“外周”变化相关，例如血压变化？已经证明，7-NI的系统应用不会影响BP（Schulz等人。，1995; Cholet等人。，1997; 科斯和余，2000; Jiang等人。，2002). 因此，对我们的数据最简单的解释是7-NI抑制NO合成，从而降低NO水平。另一方面，我-NOArg已被证明会增加血压。我们的结果与现有数据一致，这些数据表明，猫的平均血压在我-NOArg应用（IV），约10分钟后恢复到控制值（Yabe等人。，1998). 然而，有几个理由相信这种变化与我们的发现无关：（i）我们在以下实验中获得的效果我-NOArg给药在性质上与7-NI给药相似（尽管更强，因为推测nNOS和eNOS都受到影响）。（ii）在我们的实验中，我们在2分钟后开始数据收集我-NOArg给药，我们持续了20-30分钟。因为我们早在4岁时就观察到细胞放电、氧血红蛋白和MetHb水平的显著变化用药后min，观察到的效应不太可能是由于外周变化引起的，（iii）为了减少这种副作用，我们选择了次最大剂量的NOS阻滞剂，从而减少但不消除NO生成，以及（iv）观察到的对细胞反应的影响与局部应用NOS抑制剂的影响相似（Cudeiro等人。，1994,1996). 因此，我们确信，我们报告的影响是NOS抑制的直接结果，而不是次要影响。

我们的数据证实了这样一种观点，即在我们的制备过程中，至少存在两种NO来源：臂旁神经支配的nNOS（或局部中间神经元亚群，见上文）和与血管系统和相关组织相关的局部衍生eNOS。它们对神经放电和血管反应的相对贡献似乎与（视觉）刺激的强度有关。有趣的是，最近的证据表明，在大鼠体感皮层中，脑血流增加需要一定数量的神经元活动增加，并且在有限的刺激强度和频率范围内，血流和神经元活动之间存在线性耦合（尼尔森和劳里森，2001). 通过应用于大鼠小脑的通用数学模型（Rasmussen等人。，2008). 在我们手中，在使用的强度（对比度）范围内，光谱信号也呈线性变化。然而，重要的是要记住，在我们的实验中，除了对比度之外，我们没有系统地改变刺激的参数，而是总是为每个采样细胞选择其他参数（空间和时间频率等）的“最佳集”。参数空间中的这种限制可能很好地解释了为什么我们没有检测到线性偏差，这表明对于最佳（或接近最佳）刺激，LGN细胞表现出线性行为——我们将在下面回到这一点。然而，基本上，我们的数据表明，在低强度刺激下，OxyHb水平的初始增加是通过一种可能与eNOS激活相关的NO小幅度增加的机制实现的。随着刺激强度的增加，NO的生成量也随之增加，但现在是通过利用神经源从eNOS转变为nNOS而来的。因此，在某种意义上，人们可以将eNOS激活视为基础激活或低通激活范围的一部分，而nNOS激活作为高通开关或增强，随着“刺激”的增加而激活（无论是通过增强对比度，如我们的情况，还是其他刺激衍生的转移，其中可能包括注意力等）。另一方面，以前曾报道过fMRI信号中的非线性行为（Yang等人。，2000; Logothetis等人。，2001; 谢斯，2004). 尽管模型、fMRI研究中清醒的人类或麻醉动物之间存在生理差异，但我们认为此处描述的双重NO介导机制可能是神经血管耦合中某些非线性的基础。下面我们将回到这些非线性。

我们试图分析我们的方法和结果，以推导出测量参数之间可能的数学关系，以便开始推导一个预测空间，在该空间中，一个参数的生理测量值可以用来预测另一个参数，从而使直接测量变得不必要。鉴于所涉及的参数空间的范围，对我们研究中使用的模型所得结果的详细分析表明，OxyHb（和MetHb）水平只能部分解释NRs，相对误差在37%至18%之间，具体取决于所采用的聚集水平。我们必须承认，我们选择只记录单个神经元的活动，而且氧合血红蛋白水平可能会受到（大量）激活神经元的影响。实际上，作为一个例子，随着刺激强度的增加，活动神经元的数量可能会增加，因为较高的刺激强度“引入”了超出其首选刺激范围的神经元。除此之外，我们的数据可以支持一些工作人员的观点（Logothetis等人。，2001; Viswanathan和Freeman，2007,2008; Nir等人。，2008; 拉斯穆森等人。，2008)信号的很大一部分依赖于NR的其他成分，与尖峰活性不同。例如，与小脑皮层血流增加有关的数据发现，场电位的最大振幅与血流之间存在着强烈的相关性（Mathiesen等人。，1998,2000). 此外，使用数学模型，已经表明小脑神经细胞的活动与局部血流增加之间存在时间耦合，但增加的棘波活动并不是引起血流增加的条件（Mathiesen等人。，1998,2000). 根据我们的血流和一氧化氮替代标记物预测神经元活动的准确性如何？为了预测OxyHb、MetHb和NR的行为，我们在研究中考虑了两个不同的组合水平：测量水平，它试图为整个受试者群体水平的测量变量找到一个单一的模型；以及主题级别，这试图通过平均值来避免主题内的可变性。一般来说，第一种方法在准确预测三个变量（OxyHb、MetHb或NR）中任何一个的单个值方面似乎不太成功。然而，使用第二种方法时情况有所不同。仅使用MetHb和OxyHb数据即可准确预测NR（多次测量）的平均值，相对误差为18%。同样，ST可以很好地预测MetHb的平均值。在这种情况下，相对预测误差约为27%。这些结果，主要是关于从血红蛋白变化中估计神经元活性的结果，可能对功能磁共振成像等技术的解释具有重要意义。OxyHb的适用性远不是最佳的。只有28%的平均氧血红蛋白变异性（相对误差70%）可以通过上述回归模型进行解释。这在某种程度上是一个自相矛盾的结果，可能反映了模型在这种聚合水平上的弱点，因为NR或MetHb都没有添加相关信息，因此没有用于OxyHb预测。这可以解释为什么OxyHb预测结果如此糟糕。有更多涉及的统计技术可用于分析OxyHb、MetHb、NR和ST之间的关系，包括混合模型和非参数或半参数回归估计。然而，由于“维数灾难”，应用非参数方法所需的样本量非常大。因此，使用这些统计技术超出了本文的范围。

最后一个要解决的问题是直截了当的。尽管混淆了NO的来源，我们的数据，如图所示​图6，6，清楚地表明，当用no生成控制来剖析这种关系时，低强度和高强度刺激引起的血流和神经反应之间没有明显的线性耦合。我们认为，对这一建议最简单的解释是，神经系统可用的两种NOS同工酶形式的差异激活，用于在较低强度水平下控制生理状况，而不是需要增强神经激活（和伴随的血流）由高强度刺激诱导。我们建议这是一个丘脑功能模型，应该进一步研究，可能通过其他感觉方式和更高水平的认知参与。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

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