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细胞科学杂志。2009年10月15日；122(20): 3729–3737.
2009年9月22日在线发布。 doi（操作界面）：10.1242/jcs.052555
PMCID公司：项目经理2758804
PMID：19773359

胚胎干细胞的核外围是一个转录允许和抑制隔间

李洛,1,2,* 凯瑟琳·加斯曼,1,* 莉迪亚·佩特尔,1 克里斯蒂安·威尔逊,1,三 乔尔格·贝尔斯多夫,1和林赛·S·肖普兰1,‡
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补充资料

总结

染色质在胚胎中适应独特的结构和表观遗传状态干细胞（ESCs），但染色质是如何在其中三维组织的对ESC核的了解甚少。因为核位置会影响基因表达，我们用key检测染色质的核分布ESC细胞核中的表观遗传标记。我们关注的是细胞核的染色质外围，一个抑制部分但不是所有相关基因和在分化细胞中积累兼性异染色质。使用定量、细胞学方法，我们测量了未分化小鼠ESCs中的基因根据表观遗传状态和转录活性。我们发现三甲基组蛋白H3赖氨酸27（H3K27-Me三)标记被抑制的基因启动子，在ESC核外围。此外，该隔间包含10-15%的染色质具有活性的表观遗传标记和数百个转录位点。令人惊讶的是，与分化细胞类型的比较显示出类似的结果活性染色质的核分布。相比之下，H3K27-Me三在分化细胞的核周较少集中。这些发现表明，核外围是一个表观遗传学多能性ESCs中可能明显标记的动态隔室。在此外，我们的数据表明，多细胞的核外围类型可以包含活跃和抑制的重要部分基因。

关键词：染色质、胚胎干细胞、表观遗传学、细胞核

介绍

特异转录因子和表观遗传标记共同调控基因并对控制ESC的多能状态至关重要(斯皮瓦科夫和费舍尔，2007年;Lunyak和Rosenfeld，2008年).此外，基因在细胞核内的位置也起着重要作用在基因活动中的作用，尽管探索基因组是如何在空间上的在ESC核内组织只是刚刚开始(Akhtar和Gasser，2007年;弗雷泽和比克莫尔，2007年;Lanctot等人，2007年). 一键式核内的位置是核外围，即亚核隔间已经证明可以改变相关基因的表达(Andrulis等人，1998年;Finlan等人，2008年;Reddy等人，2008年). 这个核隔室可以抑制基因活性，通常会累积兼性异染色质在哺乳动物细胞分化中的作用(Francastel等人，2000年;Akhtar和Gasser，2007年).然而，最近对酵母和哺乳动物细胞的研究表明，至少一些活性基因也与这个隔间有关(Brickner和Walter，2004年;Casolari等人，2004年;Akhtar和Gasser，2007年;Finlan等人，2008年). 因此，核外周与基因控制的关系仍然很差理解，尤其是在未分化细胞中。

一个长期存在的证据表明基因中的核外围镇压。对哺乳动物细胞系的研究表明转录和乙酰化组蛋白，标记转录活性染色质在核内比在核内更丰富外围(Jackson等人。，1993;Sadoni等人。，1999;Bartova等人。，2005). 更直接地说，将基因与核外周表明，这个隔室可以引起转录压制(Andrulis等人。，1998;Finlan等人。，2008;Reddy等人。，2008). 然而，我们注意到，有些人受到了压抑，但并非所有人都受到了束缚基因(Finlan等人，2008年;Kumaran和Spector，2008年). 在此外，某些酵母基因被激活后会移向核外围，在哺乳动物细胞中，一些“未捆绑”的基因也优先表达与此隔间关联(砖工和Walter，2004年;卡索拉里等人al.，2004年;休伊特等人。，2004;Ragoczy等人。，2006;Shopland等人。，2006;Brown等人。，2008;米伯恩和米斯特利，2008). 基因转录可以在给定范围内上下“闪烁”细胞和核外周转录的直接演示只显示了这些哺乳动物外周基因中的少数(Shopland等人，2001年;列夫斯基等人，2002年;Ragoczy等人，2006年;Finlan等人，2008年). 这个转录活跃的哺乳动物基因组比例目前尚不清楚核周边地区。

对几种哺乳动物细胞类型的研究提供了一些全基因组的观点核外周染色质的类型。这些序列是典型的晚期复制，对应于上的Geimsa染色（G）带有丝分裂染色体，发现于富含抑制基因和胚胎发育过程中表达的基因(费雷拉等人，1997年;Sadoni等人，1999年;Kupper等人，2007年;Brown等人，2008年;Guelen等人，2008年;Hiratani等人，2008年).然而，基因的补体和兼性异染色质的数量在核外围，不同细胞类型和不同的细胞微分(Francastel等人。，2000;Akhtar和Gasser，2007). 一些基因进出这个隔间，根据细胞类型，已经确定，但这些基因的全基因组视图染色质动力学尚未建立(Kosak等人，2002年;Zink等人，2004年;Wiblin等人，2005年;Ragoczy等人，2006年;Williams等人，2006年;Hiratani等人，2008年;米伯恩和米斯特利，2008).

而细胞核外围的染色质在发育过程中丰富表达基因，并在一些分化细胞系中进行了检测，对未分化细胞的核外周知之甚少。有些兼性和结构性异染色质标记可能在早期胚胎和培养的多能干细胞的核外围，尽管没有对其进行定量分析或与活性物质进行比较染色质(Peters等人。，2003;Puschendorf等人。，2008;Terranova等人。，2008). 此外，在ESCs中，染色质结构相对截然不同。组蛋白交换更快，转录活性位点在ESCs中比在分化细胞中更丰富(Meshorer等人，2006年;Efroni等人，2008年). 电子稳定控制系统也有一组独特的所谓的二价基因，它们具有表观遗传包括激活和抑制共价组蛋白的特征修改(Azuara等人。，2006;Bernstein等人。，2006;Mikkelsen等人。，2007;Pan等人。，2007;Zhao等人。，2007;Mohn等人。，2008;雪松和伯格曼，2009). 许多这些基因在微分(Guenther等人。，2007;Stock等人。，2007). 此外，核膜的组成与染色质和细胞核相关的中间丝网络包膜不同于ESCs和分化细胞。在差异化中细胞，核膜通常包含B型和A型层粘连，而ESCs和早期小鼠胚胎中只存在B型层粘连蛋白(Sullivan等人，1999年;Constantinescu等人，2006年;Dechat等人，2008年;Butler等人，2009年).因此，染色质组成和转录量ESC核外围的活动可能与分化的细胞。

在这里，我们直接定量地研究了表观遗传特征和转录状态。我们专注于表现不佳的表观遗传标记具有原位特征，但定义了不同的基因表达程序多能性小鼠ESCs。精确测量放射性核素的核位置我们开发了一个三维图像分析工具根据核边缘的轮廓绘制基因组位点，包括核膜的内陷。这种方法使我们能够比较染色质在ESCs和更多分化细胞中的分布。我们发现小鼠胚胎干细胞的核外周和两种分化的细胞类型含有大量受抑制和活性基因。令人惊讶的是，这些细胞类型在活性基因，但组蛋白H3标记的抑制基因中的三甲基化赖氨酸27（H3K27-Me三)，在ESC中显著较高。我们的研究结果表明，核外围的活性基因在一些细胞类型，以及细胞核染色质的表观遗传特征外围是动态的。此外，他们还建议更高级别的功能哺乳动物细胞核外围的复杂性并指出多能干细胞的一种特殊功能。

结果

抑制性和活性表观遗传标记定位于ESC核外围

检测ESC核蛋白编码基因的表观遗传状态外围，我们用抗体对小鼠E14 ESCs进行免疫标记共价组蛋白修饰通常在转录活性和抑制基因(斯皮瓦科夫和费舍尔，2007;Lunyak和Rosenfeld，2008). 这些抗体识别三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4-Me三)或赖氨酸36（H3K36-Me三)，其中积累在活性基因的启动子和转录区，分别是。用抗体检测抑制基因启动子H3K27我三。此修改累积在沉默的启动子上基因和二价基因，也用H3K4-Me标记三(Azuara等人，2006年;Bernstein等人，2006年;Mikkelsen等人，2007年;Pan等人，2007年;Zhao等人，2007年;Mohn等人，2008年;Cedar和Bergman，2009年). 在一般来说，ESCs中的二价基因已准备好表达或在大大降低了级别，并且其编码区域不会累积H3K36-Me型三或RNA聚合酶II的伸长形式，即C末端结构域（POLI-Ser2）丝氨酸2磷酸化-P（P）)(Guenther等人，2007年;Stock等人，2007年). 西部竞争肽存在下的印迹和免疫荧光证明这些组蛋白修饰的抗体能够识别正确的目标（补充材料图S1）。此外，双色免疫荧光证实H3K4-Me的共定位作用更强三和H3K36-Me三与H3K27-Me相比三具有POLII-Ser2系列-P（P）（补充材料图S2；表S1）。

三种表观遗传标记的免疫染色ESCs均显示核内数百个集中病灶(图1A-F). 一般来说，H3K4-我三和H3K36-Me三信号在核内部，尽管在最外层或附近检测到一些病灶原子核边缘(图1A-D,箭头）。相比之下，H3K27-Me三平均信号更多集中在核仁周围和核外围(图1E、F). 在许多细胞中，H3K27-Me型三在细胞核边缘形成一个完整或部分的边缘(图1F，箭头）。这些观察表明，小鼠胚胎干细胞的核外周含有许多抑制基因（H3K27-Me三)以及活性基因（H3K4-Me三和H3K36-Me三). 确定比例ESC核外围的活性和抑制基因的平均值，我们修改了一个定制的三维图像分析程序，即侵蚀(Bewersdorf等人，2006年).侵蚀精确地绘制了核物体相对于核边缘，这里通过DNA复染和层粘连B1的存在来定义ESC核纤层与核包膜相关的部分(Gruenbaum等人，2005年).侵蚀会生成一系列嵌套的3D图像遮罩或外壳，缩小到距核边缘等间距(图。1G个). 这样的侵蚀类型分析特别好适用于测量物体与核边缘之间的距离(Ronneberger等人，2008年).这种方法还考虑了不规则的非球形核形状，如本文研究的ESC所示，并允许在不同的电池类型（补充材料图S3）。而二维分析是通常适用于球形核的测量，3D分析是需要精确测量这里研究的椭球形ESC核，其具有更大比例的“顶部”和“底部”的外围表面比“侧面”的外围曲面。这个这些独立于馈线的ESC的椭球形状不是由于扁平化在标记或安装过程中发现细胞，但更能反映其附着情况至培养表面（补充材料图S3）。虽然坚持，这些ESC表达多能干细胞的特征标记（补充材料图S3）(Knowles等人。，1978;Yuan等人。，1995). 此外，侵蚀面具在一定程度上是基于DNA反染色，但他们没有将DNA缺失的核仁定义为核外围(图1G).然而，侵蚀被修改为使用层粘连B1图像来合并核膜向图像掩模内陷(图1G，箭头）。这些内陷包含核孔，使其与细胞质连续和核外围隔间的骨质部分(Fricker等人，1997年).

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ESC核外周包含两种被抑制的表观遗传特征和活性基因。H3K4-Me的（A-D）免疫检测三（A中的红色，白色（B）或H3K36-Me三（C为红色，D为白色）,建立在活性基因上，表明整个ESC细胞核中有数百个病灶，包括与核层相关的信号（箭头）（抗层粘连B1，绿色）。（东、西）H3K27-Me三（E为红色，F为白色）,在上找到受抑制的启动子集中在核外围和一些核内部区域。箭头表示的部分边缘H3K27-Me型三在核外围。细胞核被复染DAPI（蓝色）。显示了单个共焦光学部分。（G） 对于侵蚀分析，ESCs用抗层粘连B1（绿色，左侧）和DAPI（蓝色，左）标记核边缘和核膜内陷（箭头）。带有嵌套“壳”的3D图像遮罩，该“壳”跟随核边缘是由侵蚀计划（红-白，右）生成的以200nm的间隔侵蚀核边缘掩模。光学X（X）-Y（Y）截面（顶部）和相应的截面X（X）-Z投影（底部）如图所示。比例尺：1>m（H）信号腐蚀分析密度（每壳体积的相对信号强度）表示H3K27-Me型三（红色）最集中在ESC核外围，由层粘连蛋白B1信号峰值指示（外壳0）(n个=108).H3K4-我三（浅绿色）和H3K36-Me三（深绿色）是更集中在核内部(n个=113和105，分别）。为了进行比较，大量染色质的密度分布（蓝色）通过Sytox绿色复染进行测量，与DAPI不同不优先突出显示鼠标色心。（一） 测量每个核壳中的信号比例显示H3K4-Me的15%三和H3K36-Me三染色质位于层粘连蛋白B1峰400 nm范围内。相对壳体体积如补充材料图S4所示。拉明B1绘制相对密度（任意单位）；显示密度值的轴为隐藏。误差线为标准误差线，包括所有壳体体积的变化密度图。

对ESCs进行免疫染色以检测三种组蛋白修饰中的一种和具有不同荧光标记的层粘连蛋白B1。DNA复染后，细胞通过3D共焦显微镜成像，并通过侵蚀进行评估程序。在我们的研究中，贝壳膨胀，然后从以200-nm的间隔屏蔽核外围。与我们的定性一致观察，侵蚀分析表明H3K27-Me型三-ESC核外周的标记染色质核内部(图1H).此外，我们发现H3K27-Me总量的24%三200以内的信号层粘连峰的nm（壳层0和1）和400nm范围内的38%（壳层0~2），表观遗传标记最集中的位置(图1I). 相比之下H3K4-Me的分布三染色质与之显著不同H3K27-Me的三[P（P）<0.001，Kolmogorov-Smirnov（KS）测试]，在更内部的核壳中具有峰值密度。H3K4-我三相对于核外周的总DNA，染色质也被耗尽，与H3K27-Me不同三(图。1小时，I). 尽管如此，H3K4-Me总量的8%三信号是在峰值层压板外壳的200 nm范围内，以及在400 nm范围内的17%(图1I)，外壳，其中H3K27-Me型三染色质最集中。此外H3K36-Me的实测分布三染色质与H3K4-我三(P（P）>0.5，KS试验），进一步表明外周含有积极转录和抑制的基因(图1H，I).

ESC检测到的特定表达基因和“沙漠”基因核外围

因为在细胞核中检测到大量活性染色质病灶外围有点出乎意料，我们试图验证这些表观遗传标记确实代表活性基因。我们首先使用荧光原位杂交（FISH）检测已知基因的核位置以ESCs表示。小鼠染色体4.3 Mb基因贫困区（4个基因/Mb）14（MMU14）包含多个在ESCs和NIH-3T3中表达的基因成纤维细胞(图2A)(Shopland等人，2006年). 这个MMU14区在ESC核内的位置未知。然而，这之前发现该区域在NIH-3T3的核外围富集细胞，使其成为我们研究的良好候选者(Shopland等人，2006年). 我们绘制了ESC细胞核中两个活性MMU14区基因座的位置。一个轨迹包括表达的基因被杀1和第1阶段和另一个包括Ndfip2型和26卢比(图2A). 这些基因座是在同一ESC中用双色FISH进行差异标记，以比较它们直接定位。杂交细胞随后用抗层粘连蛋白B1抗体，DAPI复染，3D共焦成像显微镜检查。3D图像表明两个位点都位于或在大多数细胞中靠近核膜(图2B、C). 尽管这些MMU14上的基因座间距为1.5 Mb，它们在因此不一定相互约束以定位到同一核隔间(图。2B型，箭头）(劳伦斯等人。，1990;Shopland等人。，2006).

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MMU14基因座的转录与核外周密切相关。（A）MMU14区域的基因图（黑条，左）和基因“沙漠”研究。Sce1、Sla1、Rbm26和Ndfip2型在E14中表示电子稳定控制系统(Shopland等人，2006年).用于FISH探针的BAC显示在右侧。（B，C）双色FISH检测第1阶段和被杀1（绿色）和缅甸26和Ndfip2型（红色）靠近ESCs叶片（蓝色）。B中的单元格显示这四个位点中的三个（箭头）与叶片接触（插图，白色）。地点来自同一染色体的距离约为1>mX（X）-Y（Y）光学部分和来自的部分X（X）-Z显示了投影。对于C中的单元格X（X）-Z投影和单个X（X）-Z和Y（Y）-Z部分如图所示。（D） 的三维分布第1阶段和被杀1（绿色），26卢比和Ndfip2型（红色）和LMNB1（黑色）通过97个ESC的侵蚀。两个活性位点通常距离峰值200-400 nm层粘连信号。（E） MMU14基因位置（绿色）与活性Sox2系统MMU3上的（红色）(n个=93). （F，G）MMU14基因位置（绿色）与两个MMU14基因沙漠（红色；n个=97和分别为99）。在D-G中，相对于总核的平均壳体积显示体积（灰色，任意单位）。（H，I）RNA-FISH检测缅甸26和Ndfip2型核附近的转录本（红色）两个ESC细胞核中的薄层（抗LMNB1，绿色）。单个X（X）-是的，X（X）-Z和Y（Y）-Z两个FISH信号的部分每个单元格如图所示。比例尺：1>m。（J）侵蚀分析93个ESC显示峰值为26卢比和Ndfip2型转录信号距叶片400 nm，类似于DNA-FISH（D）探测的位置。错误钢筋，s.e.m。

3D图像的侵蚀分析证实，表达的MMU14基因座经常位于ESC核周围(图2D). 两个基因座最多通常在与层粘连B1峰相邻的第一或第二层中发现信号，其中H3K27-Me三也是峰值(图1J、K). 此外，大约15%的MMU14基因座映射到含有最多浓缩层粘连蛋白B1信号，表明它们可以非常靠近（<200 nm）至核膜。

两个表达的MMU14基因座具有相似的核分布(P（P）>0.5，KS试验）。相比之下，活性MMU3的分布轨迹Sox2系统之前已映射到ESC核内部，与MMU14位点显著不同杀戮1/等级1(P（P）<0.001，KS测试）(图。第二版) (Williams等人。，2006). 这些发现表明，并非所有的活性基因都有平等进入核外围隔间ESC核周边的活性染色质不仅仅是由于染色质流动性。表达的MMU14基因座也与附近的两个MMU14进行了比较基因“desets”中的序列，其注释外显子和人类细胞富含层粘连蛋白相关染色质(Ovcharenko等人，2005年;Shopland等人，2006年;Guelen等人，2008年). 我们发现MMU14基因沙漠的核分布与此处检测的活性MMU14基因(P（P）>0.5，KS试验）(图2F、G). 因此，基因沙漠以及一些表达基因定位在小鼠核边缘附近电子稳定控制系统。

MMU14基因在核外围转录

侵蚀测量表明，大约55%的信号来自所检测的表达MMU14基因座靠近ESC核外围（外壳–2至2）(图2D). A类NIH-3T3成纤维细胞也有类似的外周部分(Shopland等人，2006年).然而，这些数据可能表明，当在核外周，许多活性基因没有连续转录。相反，当检测时，转录可以在给定的位点上下“闪烁”在逐个单元的基础上(Shopland等人。，2001;列夫斯基等人。，2002). 因此，尚不清楚MMU14基因是否是当它们定位于核外围或仅在更多时转录细胞核的内部。

为了确定MMU14基因在ESC细胞核中转录的位置，我们使用RNA-FISH检测转录Ndfip2型/26卢比轨迹(图2H-J). 我们通常观察到两次震源堆积Ndfip2型/26卢比转录本，其中许多位于ESC核膜附近(图2H，I). 侵蚀分析的RNA-FISH样本证实了这些发现，显示信号峰值在400nm，约10%的信号出现在峰值层粘连中外壳(图2J). 因此，这些基因在转录时可能位于核外周。此外RNA-FISH信号的分布与DNA-FISH信号的分布相似(P（P）>0.5，KS检验），表明定位到外围是不受处于闪烁状态的基因座的青睐，而是这些基因在任何一种状态下都有类似的访问此隔间的权限。

数百个活性转录位点定位于ESC核外围

作为ESC转录活性的另一个更全基因组测量核外周，我们检测了RNA伸长形式的位置聚合酶II，在其C末端结构域的丝氨酸2上磷酸化（POLII-Ser2）-P（P）) (Kobor和格林布拉特，2002). POLII-Ser2系列-P（P）转录位点是然后通过3D成像和侵蚀分析绘制(图3). POLII-Ser2系列-P（P）在整个ESC核中检测到，在核内部(图3A-F),与其他细胞类型的先前观察结果一致(Jackson等人，1993年;Sadoni等人，1999年). 然而，多个POLII-Ser2-P（P）近距离检测到转录位点与核膜的联系(图。3A-F型，箭头）(Wansink等人。，1993). 这些转录位点分布在核外围隔间，因此可能代表活跃多染色体上的基因。

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ESC核外周含有多个转录位点。（A-F）用抗POLII-Ser2染色的ESC的三个共焦切片-P（P）抗体（A、C、E为红色；B、D、F为白色）表示转录活性位点贯穿整个原子核。核纹层转录位点示例（绿色）由箭头指示。所示光学部分相隔800中的nmZ-轴。比例尺：1>m（G）102的侵蚀分析ESCs表示POLII-Ser2的峰值密度-P（P）（红色）1.0>m距离核膜（黑色）。（H） 16%的转录位点位于核纹400 nm。基于Sytox的总染色质分布显示绿色染色（蓝色）以进行比较。显示了相对外壳体积补充材料图S4。误差线，s.e.m。

侵蚀分析表明，POLII-Ser2的密度-P（P）ESC核外围的转录位点是核内部(图3G).尽管如此，我们在200个峰值层粘连壳的nm，以及400nm范围内的16%(图3H). 在外围200nm区域，我们计算出平均值为909±165POLII-Ser2系列-P（P）每个细胞的焦点。这些数据证实了我们的发现活性表观遗传标记(图。1)并表明许多活性转录位点出现在ESC核外围。

不同细胞类型的核周缘含有不同的表观遗传特征

确定激活和抑制的相对分布核外周的基因是ESCs独有的，我们检查了它们的位置在另外两种细胞类型中的不同组蛋白修饰。还有这些分化细胞包括胚胎来源的NIH-3T3成纤维细胞和成人初级神经元干/祖细胞（NPC）。NPC被确定为基于SOX2和NESTIN表达的干/祖细胞（补充材料图S3）。同样，本研究中使用的ESC为SOX2和SSEA1免疫染色证实处于未分化状态（补充材料图S3）(诺尔斯等人，1978年;Yuan等人。，1995;Zhao等人。，2004). 与ESCs相比，NIH-3T3细胞的DNA密度较低核内部的DNA密度相对较高围绕核边缘形成更明显的边缘(图4B、C). 在NPC中染色质在核外周也有明显的积聚添加到致密染色质边缘(图。4A级).

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ESCs染色质分布不同于NPC和NIH-3T3成纤维细胞。（A） Sytox染色的NPC、（B）ESCs和（C）NIH-3T3细胞绿色，一种不突出着丝粒异染色质的DNA染料。较少的在ESC细胞核中发现了密集的DNA浓度，特别是在与其他细胞类型相比，核外围。（D，E）免疫染色带抗H3K4-Me三抗体（D为红色，E为白色）显示信号整个NPC核（蓝色，DAPI），包括多个相关病灶核纹（绿色）。在中检测到类似的分布NIH-3T3细胞（H，I）。（F、G、J、K）与ESC不同，H3K27-Me三（F和中的红色J、 G和K中的白色）不集中在NPC的核外围（F，G）或NIH-3T3细胞（J，K）。显示了单个共焦光学部分。比例尺：1>m。（L-O）侵蚀测量表明类似分布H3K27甲基三和H3K4-Me三在NPC中(n个=105和分别为106个细胞）（L，M）和NIH-3T3细胞(n个=106和91细胞）（N，O），与H3K27-Me型三ESC核外围(图1J、K). 总DNA分布（蓝色）基于Sytox绿色染色。相对壳体积如补充材料图S4所示。误差线，s.e.m。

H3K4-Me的核分布三和H3K27-Me三在NPC和NIH-3T3细胞中测量。令人惊讶的是，我们发现两个细胞H3K4-Me的分布类型三与电子稳定控制系统(P（P）>0.5，KS试验）(图。4D-E、H-I、L-O). 此外，H3K27-Me三很明显与ESC相比，两种分化程度更高的细胞类型存在差异(P（P）<0.001) (图。4F-G、J-K、L-O). H3K27-Me型三被核燃料耗尽这两种细胞类型相对于ESC的外围，尽管出现了核外周的异色DNA浓度更高。H3K27-Me型三NPC的病灶越来越小，越来越大，进一步表明这种细胞类型的核内部聚集程度更高与ESC相比。此外，H3K27-Me的整体水平三可以在这些细胞类型中与ESCs相比更低。更少的基因组结合位点在一项研究中在鼻咽癌染色质中检测到，但在另一项研究没有检测到，因此悬而未决的问题(Mikkelsen等人。，2007;Mohn等人。，2008). 这些数据加在一起表示特定于细胞类型H3K27-Me的分布三染色质，最集中于ESC核外围。此外，它们还揭示了H3K4-Me三三种不同类型小鼠细胞核外周的染色质具有类似比例的活性表观遗传标记。

讨论

这里，我们展示了三种哺乳动物细胞类型的核外围包含大量转录活性基因以及被抑制的基因。我们测定了活性成分和抑制成分的相对分数通过开发定量、精确、细胞学的将染色质标签相对于核边缘。这种方法揭示了在未分化的小鼠ESC中核外围富含被抑制的基因，但也含有数百个转录活性基因。表观遗传标记的分数ESC核外围的活性染色质与两个类似受谱系限制的细胞类型，表明活性染色质不是分化后必然从核外围移位。由相反，抑制性组蛋白修饰H3K27-Me三已耗尽与ESCs相关的其他类型细胞的核外周，表明该区域内某些表观遗传标记的动态组成隔间。因此，与其简单地用作消声隔间哺乳动物细胞核外周具有复杂的组织特异性与基因活性的关系。我们的研究结果进一步表明核外周的表观遗传标记的组成可以区分来自更多谱系受限细胞的多功能基因组。

核外周染色质的定量分析

核外围可能也是基因表达的关键位置作为镇压。除了提供直接进入核孔的通道外可以促进RNA输出，酵母的核外围(酵母菌属大脑)与转录激活和抑制有关，染色质表观遗传状态的改变(布洛贝尔，1985年;Hutchinson和Weintraub，1985;Akhtar和Gasser，2007). 同样，被抑制的基因和一些活性基因局限于哺乳动物细胞的核外围。然而，如何这些外周活性和抑制基因相对于单细胞和多细胞生物的其余基因组之前未知。需要一种定量的细胞学方法来测量全基因组不同类型的染色质并比较它们不同细胞类型之间的核分布。

我们开发了一个3D图像分析工具，即侵蚀，用于比较核ESCs和其他细胞类型中活性和抑制染色质的分布(Bewersdorf等人，2006年).因为侵蚀使用核边缘的完整轮廓作为参考，我们能够直接比较不同核形状的细胞。我们的比较显示H3K4-Me的比例相似三染色质，但不同比例的H3K27-Me三在核边缘不同的单元格类型。对于这些研究，我们改进了之前的研究通过调整我们的程序来考虑侵蚀类型分析核膜的内陷。如前所述，我们发现核膜数量的细胞类型特异性差异内陷，NIH-3T3细胞含有最多，NPC最少(Fricker等人，1997年).在腐蚀口罩中不包括核膜内陷，我们会低估核包络附近信号的分数NIH-3T3成纤维细胞相对于其他检测的细胞类型。因此，这种侵蚀特征对我们的研究至关重要。

因为本研究中使用的标记方法需要固定染色质原位，由此产生的侵蚀测量值代表平均值细胞群体中不同基因组位点的核位置。这些平均位置必然反映每个个体的运动范围检查轨迹。然而，染色质的流动性并没有在本研究中直接评估研究表明，染色质的流动性是否类似于more分化的哺乳动物细胞(列维等人al.，2005年;Chuang等人。，2006). 值得注意的是，活性成分和抑制成分的平均分数我们在细胞核外围测量的染色质可能低于过度估计，因为侵蚀使用基于强度的阈值（材料和方法）。此方法过度表示较亮荧光信号相对于较弱的信号，如较弱的H3K4-我三核外围和H3K27-Me三在中ESCs的核内部。

除了相对分布外，还提供了侵蚀分析测量到核外围的绝对距离，对于确定核位置是否与高分子鳞片(劳伦斯和克莱姆森，2008). 抑制基因和活性基因都存在于ESC核层200 nm。这个距离接近大跨度高分子复合物。例如，它的长度大约是核孔篮(Kiseleva等人。，2004). 事实上，表观遗传活跃和受抑制的基因组位点最近有研究表明，标记与一个人的核孔蛋白相互作用细胞系(Brown等人。，2008). 我们对ESCs和其他两种小鼠细胞系的测量支持这些发现，并强烈建议许多哺乳动物的细胞类型都含有转录活性和抑制性基因。

ESC核外周的转录活性染色质

我们的测量结果表明H3K4-Me的浓度更高三,H3K36-Me型三，和POLII-Ser2-P（P）在核内部与转录位点和活性染色质的其他标记一致以前在非诱变性细胞系中检测过(Jackson等人，1993年;Sadoni等人，1999年;Bartova等人，2005年). 然而，由于我们使用了定量方法，我们还发现转录活性染色质定位于ESCs的核外周，以及其他两种细胞系。在ESC中，此分数表示上百个基因，可能更多，因为共焦显微镜无法解析位置非常接近的基因(Iborra等人1996年). 我们进一步发现，这个活跃的外围设备ESCs中的染色质包括MMU14的基因缺陷区域，该区域富含发育基因。有趣的是，MMU14基因座被杀1是在小鼠ESCs中表达，但在NIH-3T3细胞中受到抑制，而该区域在两种细胞类型中都与核外周有关(Shopland等人，2006年). 这些研究结果表明，这些基因的发育调控激活和抑制可能与此相关隔间。

与我们的发现一致，转录活性染色质在之前的几项研究中，在核外围检测到。早期电子大鼠肝细胞核的显微镜显示新生转录物位于外周染色质，尽管其丰度尚未量化(Nash等人，1975年;法坎，1994年). 出席者溴UTP标记的两人核外周转录位点细胞系也被发现(Wansink等人1993年). 类似地，少数人和老鼠表达FISH检测到的基因在核外围富集(休伊特等人，2004年;Ragoczy等人，2006年;Shopland等人，2006年;Brown等人，2008年;Meaburn和Misteli，2008年). 在此外，“系绳”实验表明，并非所有基因都针对对核周边的影响受到抑制(Finlan等人，2008年;Kumaran和Spector，2008年).然而，这些基因中很少有直接被转录的与此隔间关联时(Ragoczy等人，2006年;Finlan等人，2008年;Kumaran和Spector，2008年).因此，我们的数据通过直接证明核外周特异性天然（未捆绑）基因的转录。此外，早期的研究没有提供测量基因组中转录活性染色质与核外围。全基因组标记活性位点的方法通过基于荧光的3D方法在现场进行了此类测量可能。

核抑制基因的动态表观遗传特征外围

除了转录活性染色质的表观遗传标记外，我们还测量了受抑制基因的表观遗传标记的核分布基因，迄今为止已在原位进行了最低限度的表征(Peters等人，2003年;Shumaker等人，2006年;Puschendorf等人，2008年;Terranova等人，2008年). 由基于H3K27-Me的抑制基因启动子鉴定三表观遗传标记，我们发现这些基因在细胞核中富集ESC外围。这些发现与H3K27-Me型三关于小鼠受精卵和早期胚胎的报道(Puschendorf等人，2008年;Terranova等人，2008年).有趣的是，在这里检测的分化程度较高的细胞中，我们发现H3K27-Me型三在核外围不富集。这些数据建议H3K27-Me三基因座移出这个隔间分化期间，或H3K27-Me三已从中删除外周染色体位点。事实上，现有证据支持这两种观点机制。研究表明，哺乳动物的特定基因向或从分化ESCs和其他细胞类型的核外周可能在我们这里报道的表观遗传标记的重新分布中发挥作用(Kosak等人，2002年;Zink等人，2004年;Wiblin等人，2005年;Ragoczy等人，2006年;Williams等人，2006年;Hiratani等人，2008年;Meaburn和Misteli，2008年). 在此外，已知个别基因上的表观遗传标记也会发生变化。基因ESC中带有二价标记的人往往会失去H3K27-Me三或H3K4Me型三在分化程度更高的谱系承诺细胞中，例如此处检查的NPC(Azuara等人。，2006;Mikkelsen等人。，2007;Mohn等人。，2008;雪松和伯格曼，2009).

H3K27-Me的明显积累三在核外围ESC的数量增加了这个隔间对多能性基因组的表观遗传状态。事实上，酵母的成分核外周在基因表达和抑制中起着直接作用，其中一些核孔蛋白相关基因适应表观遗传状态为未来的激活做好准备；使人联想到哺乳动物双价基因的状态(Akhtar和Gasser，2007年;Brickner等人，2007年;Stock等人，2007年). 在ESC中，H3K27-Me型三主要在二价基因上发现(Mikkelsen等人，2007年;Pan等人，2007年;Zhao等人，2007年;Mohn等人，2008年). 是否二价基因确实在核边缘富集和调控小鼠ESC等待未来的直接调查。

核外围是一个复杂但有组织的隔间

特定酵母基因与不同核膜之间的关联蛋白质表明基因组序列是有组织的在内部这个核外围隔间。有人提出酵母基因座形成靠近核孔和其他核膜的不同微区根据转录活性或表观遗传状态的结构(Akhtar和Gasser，2007年). 我们的哺乳动物细胞的数据与该模型一致；激活和受抑制的表观遗传标记位于核外围，看起来很小，离散焦点。通过双色免疫染色，我们检测到小规模结构域主要散布于POL II-Ser2的受抑制基因座-P（P）（补充材料图S2）。此外，使用FISH，我们之前已经发现小的基因簇和散布的基因MMU14上的沙漠可能同时与核膜有关(Shopland等人，2006年).这些不同的区域是否与核孔或其他核膜中的结构目前尚不清楚。然而，他们与核膜的紧密接触为这十年提供了新的支持假设核外围与细胞质，可能是细胞核中某些基因的主要位置(布洛贝尔，1985年;Hutchinson和Weintraub，1985).

材料和方法

细胞培养

饲养依赖小鼠E14 ESCs在明胶涂层板上培养37°C，8%一氧化碳2格拉斯哥最低必需培养基（GMEM；Sigma-Aldrich）加10%胎牛血清（FBS；BioWhittaker Lonza），青霉素/链霉素（Invitrogen）、非必需氨基酸（Invitro）、，丙酮酸钠（Invitrogen）和1000 U/ml白血病抑制因子（LIF）；TJL蛋白质化学服务）。NIH-3T3成纤维细胞在37℃下培养，5%一氧化碳2在Dulbecco改良的Eagle培养基中（DMEM；Invitrogen）加上10%的FBS和青霉素/链霉素。固定前一天，细胞在玻璃盖玻片（1.5号金封条）上以50%的汇合度进行电镀为ESCs涂上EHS层粘连蛋白（Invitrogen）。神经干细胞从出生后（P0-P8）C57BL6/J端脑室下区分离（SVZ）。简言之，SVZ区在Accutase中被微区分离，并研磨成单细胞悬浮液。分离的细胞在改良DMEM:F12中培养，补充B27、青霉素/链霉素，10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和20 ng/ml表皮生长因子（EGF）形成神经球。固定前一天，将神经球分散在玻璃盖玻片上，并在50%的汇合处进行电镀（1.5号金封）涂有聚D-赖氨酸（BD Bioscience）。

免疫荧光

细胞在4%甲醛、1×PBS中固定10分钟用0.5%Triton X-100，1×PBS渗透10分钟。细胞是用1:500稀释的兔抗H3K4-Me抗体染色三抗体（ActiveMotif），1:500稀释的小鼠抗H3K27-Me三（ActiveMotif），小鼠抗POLI-Ser2的1:500稀释液-P（P）（H5，Covance），1:200稀释的兔抗SOX2（Millipore），1:1000稀释小鼠抗SSEA1抗体（MC-480，发育研究杂交瘤库），或1:200小鼠抗NESTIN（rat-401，Millipore），在1×PBS中，37°C下1%BSA持续1小时。用于H3K36 Me三，提取细胞5分钟0.5%Triton X-100，在固定和1:500稀释的免疫染色之前兔抗H3K36-Me三（阿布卡姆）(Johnson等人，2000年;Tam等人，2002年). 主要用1:250罗丹明（TRITC）-驴抗兔、，TRITC-donkey抗鼠IgG、FITC-assel抗鼠Ig M或TRITC-donkey抗大鼠抗体（Jackson ImmunoResearch）在1×PBS，1%BSA中。标记核外周细胞也用1:250稀释的山羊染色抗层粘连蛋白B（M20，Santa Cruz Biotechnology），主要检测层粘连B1和Cy3-或Cy5-驴抗山羊（Jackson ImmunoResearch）或AlexaFluor-488-donkey抗山羊（Invitrogen）。细胞用1进行复染ug/ml DAPI（Sigma-Aldrich）或500 nM Sytox绿色（Invitrogen），如图所示，并安装在5 mM 1,4-苯二胺盐酸盐（Sigma-Aldrich）中，90%甘油，1×PBS。

蛋白质印迹

对从NIH-3T3细胞中提取的组蛋白酸进行蛋白质印迹检测使用1:1000稀释的抗H3K27-Me三，1:1000稀释抗H3K4-Me三，或1:1000稀释抗H3K36-Me三用1>M的指示阻断肽（Abcam）预孵育抗体根据制造商的说明，在4°C下过夜。

荧光原位杂交

探针是通过用Cy5-dUTP或Cy3-UTP（通用电气）。BAC报告于图。1安培除Rp24-174N24外，其余均来自Rp23文库。美国银行Rp23-129D12用于Sox2系统对于DNA-FISH，细胞被固定并且按说明渗透(Solovei等人al.，2002年)，然后碱水解去除RNA，热变性，并与每个探针50 ng和10>g小鼠C杂交o个T1 DNA（Invitrogen）、鲑鱼精子DNA（Sigma-Aldrich）和tRNA（Sigma）(Tam等人，2002年). 对于RNA-FISH，按照说明提取和固定细胞(Tam等人，2002年)，然后直接与探针杂交，省略碱水解和热变性专门检测转录物而非DNA的步骤(Xing等人，1993年).将杂交细胞在4%甲醛中后固定，并用山羊抗层粘连蛋白B，用DAPI复染，如上所示。

显微镜和图像分析

补充材料Figs S1-S3中的图像是用蔡司获得的Axioplan 200配备100×1.4 NA油物镜表明。对于所有其他分析，使用TCS SP5共焦成像仪对样品进行成像带有100×1.4 NA油物镜和2.0的电子变焦，导致X（X）-Y（Y）像素，共个75×75纳米。以200-nm的步长拍摄3D图像堆栈。图像是裁剪为单个单元格并在中重新采样Z-轴生成立方体使用半自动定制Python-program的体素，Crop。裁剪显示Z-用户可以手动定义的3D数据堆栈的投影概述单个单元格的感兴趣区域（ROI）。用户定义的跟踪是经过计算优化以实现最佳拟合，并且从所有起初的X（X）-Y（Y）数据的所有检测通道中的切片堆栈。裁剪的区域由零填充，以创建矩形ROI并组合成每个通道的3D数据堆栈使用。

3D数据堆栈表示每个单细胞都被加载到一个定制的C程序中，该程序名为“侵蚀”，是一个改进的以前使用的程序版本(Bewersdorf等人，2006年).侵蚀调整通道之间的色差，然后生成表示嵌套三维壳的一组遮罩，每个遮罩表示核与核边界保持恒定距离的体积。边界（包括核膜内陷）由自动定义将平滑DAPI通道的阈值体素与阈值相结合，将层粘连B1体素平滑为3D遮罩。面具在3D中展开，然后以200-nm的间隔收缩（“侵蚀”），直到完全消失，形成在该过程中，与核边界有一定距离的嵌套壳。测量核物体的位置并限制残留的离焦光，特别是在Z-轴，阈值级别被设置为仅包含中心图像平面中的体素染色较弱的物体。然后测量阈值以上的信号每个壳，以及壳体积和背景以上的体素分数阈值级别。对于高于和的阈值重复此过程低于原始阈值，这表明测量的分布相对阈值依赖。如有指示，信号密度为根据信号与外壳体积的比值确定。曲线表示信号在整个曲线上被标准化为1，每个外壳值因此表示该壳中的信号分数。因此，信号和密度值未校准。它们的绝对值不代表有意义的量，但归一化在每条曲线中是恒定的，允许定量相对测量来比较不同壳的值。为了便于显示，将层粘连蛋白B1密度曲线归一化以匹配其他显示曲线的曲线高度。获得的分配使用双侧KS测试对侵蚀进行比较。

补充材料

【补充资料】

笔记

补充材料在线提供http://jcs.biologists.org/cgi/content/full/122/20/3729/DC1

我们感谢玛丽安·汉德尔和罗伯特·伯吉斯对此的批判性解读手稿，Ana Pombo提供实验建议，Kyuson Yun提供NPC，TheESCs的Jackson实验室细胞生物学服务。SSEA1单克隆抗体是从根据由NICHD赞助，由爱荷华大学维护。这项工作由NSF EPScOR支持0132384，NSF小型断路器0817787，NIH NCRRINBRE公司5P20RR016463-08，以及NCI公司CA034196拨款。存放在PMC中，12年后发布月。

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