癌症研究。作者手稿；PMC 2010年4月1日提供。
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G-CSF在血管破裂剂急性动员内皮前体细胞中的作用
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尤瓦尔摇了摇
1以色列海法以色列理工学院Technion Rappaport医学院分子药理学系
特伦斯·唐
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
吉尔·沃洛斯齐内克（Jill Woloszynek）
三密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院
劳拉·戴恩
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
掸满
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
徐萍（Ping Xu）
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
杰弗里·阿尔贝特
三密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院
埃米尔·沃斯特
4荷兰乌得勒支大学医学中心肿瘤医学系
大卫·卓别林
5OXiGENE公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆
乔恩·斯迈思
6癌症研究英国牛津大学分子肿瘤学实验室，英国牛津约翰·拉德克利夫医院
阿德里安·哈里斯
6癌症研究英国牛津大学分子肿瘤学实验室，英国牛津约翰·拉德克利夫医院
伊恩·贾德森
7英国萨里郡萨顿皇家马斯登医院肿瘤内科
戈登·鲁斯汀
8英国米德尔塞克斯郡诺斯伍德弗农山庄癌症中心肿瘤医学部
弗朗西斯科·贝尔托里尼
9意大利米兰欧洲肿瘤研究所血液肿瘤科
罗伯特·S·科尔贝尔
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
1以色列海法以色列理工学院Technion Rappaport医学院分子药理学系
2加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克健康科学中心
三密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院
4荷兰乌得勒支大学医学中心肿瘤医学系
5OXiGENE公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆
6癌症研究英国牛津大学分子肿瘤学实验室，英国牛津约翰·拉德克利夫医院
7英国萨里郡萨顿皇家马斯登医院肿瘤内科
8英国米德尔塞克斯郡诺思伍德弗农山癌症中心肿瘤内科
9意大利米兰欧洲肿瘤研究所血液肿瘤科
- 补充材料
1
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2
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摘要
血管阻断剂（VDAs）会导致异常肿瘤血管系统的急性关闭，继而导致肿瘤内大量缺氧和坏死。然而，肿瘤组织总是有一个活的边缘，肿瘤从那里快速再生。我们最近发现，骨髓源性循环内皮前体细胞（CEPs）的急性全身动员和归巢可以在VDA或某些化疗药物治疗后促进肿瘤再生。这种全身反应性宿主过程的分子介质尚不清楚。在这里，我们发现，在用OXi-4503（一种第二代强效的前药衍生物）治疗小鼠后，检测到循环血浆VEGF、SDF-1和G-CSF水平迅速升高。为了确定G-CSF是否参与VDA诱导的CEP动员，用OXI-4503处理突变的G-CSF-R−/-小鼠。我们发现，与野生型对照组相比，G-CSF-R−/−小鼠未能动员CEP或诱导SDF-1血浆水平。此外，与野生型小鼠的肿瘤相比，OXi-4503治疗的此类小鼠中生长的Lewis肺癌显示出更高的坏死水平。在VDA（CA4P）治疗的癌症患者中也观察到循环血浆G-CSF、VEGF和SDF-1快速升高的证据。这些结果强调了药物诱导的G-CSF对某些细胞毒药物治疗后肿瘤再生长的可能影响，在本例中使用VDA，因此G-CSF可能是一个治疗靶点。
简介
肿瘤中新血管毛细血管的生长——治疗性抑制现已成为临床验证的策略——似乎不仅由预先存在的分化血管内皮细胞的局部分裂（“新生血管生成”）介导(1)而且还通过涉及动员和归巢各种骨髓源细胞（BMDC）种群的系统过程(2). 其中包括循环内皮祖细胞（CEP），CEP可并入生长血管的管腔并分化为内皮细胞(2,三).
我们最近报道，将荷瘤小鼠暴露于细胞毒性样血管破坏剂（VDAs）可导致BMDCs快速（即在数小时内）动员，其中一些是CEP，然后将其归巢到肿瘤组织的活性边缘(4)其特征是在VDA治疗后仍然存在，并包围着有时巨大的坏死肿瘤中心(4,5). 这种急性反应性宿主反应有助于药物治疗肿瘤的快速再生，从而损害VDA治疗诱导的初始抗肿瘤作用的持久性。此外，我们最近报道了某些细胞毒性化疗药物（以最大耐受剂量给药），如紫杉烷或5-FU，也可以引起CEP的急性动员(6). 在这两种情况下，联合使用抗血管生成药物，例如DC101，一种VEGFR-2中和抗体(4,6,7)，阻止CEP动员，从而增强所用细胞毒疗法的抗肿瘤活性(4,6). 鉴于VDAs诱导的骨髓间充质干细胞反应的显著急性和强健性，以及其对肿瘤反应的影响和对治疗益处的影响，我们决定研究这种治疗诱导的促血管生成性骨髓间充质细胞动员的可能分子介体，包括CEP。为此，我们使用了一种有效的VDA，即微管抑制剂OXi-4503，这是VDA combretastain A4 phosphate（CA4P）的第二代前药衍生物(5).
材料和方法
人体血液样本
同意参与一项I期研究的晚期实体瘤患者，该研究评估了CA4P与贝伐单抗联合使用的递增剂量(8)参与本研究（n=15）。患者作为3个队列中的一个进入，并接受45mg/m2，54毫克/米2或63mg/m2在不使用贝伐单抗的第一个治疗周期中静脉注射CA4P。为了本研究的目的，在基线（预处理）和CA4P治疗后4小时采集血液。该方案得到了道德委员会的批准。
肿瘤和动物模型
所有动物研究均按照Sunnybrook Health Sciences Centre（加拿大多伦多）和Washington University（密苏里州圣路易斯）的动物护理指南进行，并在补充在线材料。
流式细胞术评价循环内皮前体细胞
通过逆行窦出血从麻醉小鼠中获取血液。如前所述，使用流式细胞术对活性CEP进行定量(三)中的、和补充在线材料。
组织处理和成像
如前所述进行组织处理和免疫组织化学(4,9)中的、和补充在线材料。
ELISA评价循环G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平
无瘤或500mm三用100mg/kg OXi-4503或PBS腹腔注射治疗MeWo人黑色素瘤裸鼠以及无瘤G-CSF-R−/−和wt对照小鼠。四小时后，处死小鼠，通过心脏穿刺抽血。在患者中，通过静脉穿刺获得血液样本。使用肝素分离血浆，然后将其储存在−70°C下，直到进行分析。使用商用夹心ELISA（研发系统）评估小鼠或人类VEGF、SDF-1和G-CSF的水平。
统计分析
数据表示为平均值±S.D.，平均值差异的统计显著性通过双尾学生t检验进行评估。与对照组或基线（预处理）组（除非另有说明）相比，实验组/治疗组的平均值之间的差异在P<0.01（**）或0.05（P<0.01（*）的数值下被认为是显著的。
结果
OXi-4503诱导血浆中主要来源于宿主的G-CSF、VEGF和SDF-1水平快速升高
为了研究某些生长因子的诱导是否参与VDA治疗对CEP的急性动员，我们分析了非肿瘤或500mm的血浆三MeWo人黑色素瘤荷瘤裸鼠在使用OXi-4503治疗人类和小鼠G-CSF、VEGF和SDF-1 4小时后，使用特定ELISA获得。重点放在这些特殊因素上，因为众所周知，所有这些因素都会导致CEP动员(10–12). 中的结果正常小鼠和荷瘤小鼠的G-CSF、VEGF和SDF-1均出现急性增加（分别增加10–20、4–5、2倍）。有趣的是，OXi-4503治疗4小时后，人G-CSF水平显著降低。在未经治疗的荷瘤小鼠中未检测到人类VEGF水平，但在OXi-4503治疗4小时后，在5只小鼠中的20只中检测到相对少量的VEGF（15–18.32pg/ml）。值得注意的是，我们最近报道了使用最大耐受剂量紫杉醇治疗的非肿瘤小鼠的血浆SDF-1显著升高，这有助于观察到与VDA诱导效应类似的快速CEP峰值(6). 总的来说，这些结果表明，OXi-4503治疗使已知介导CEPs动员的几个因素急剧增加，并且主要来源于宿主。
OXi-4503治疗4小时后无瘤和MeWo荷瘤裸鼠的循环G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平用OXi-4503治疗4小时后，从无瘤小鼠（开放栏）或荷瘤小鼠（填充栏）中获得小鼠和人类（A）G-CSF、（B）VEGF和（C）SDF-1的血浆水平。
G-CSF升高有助于VDA治疗诱导的CEP快速动员
G-CSF是造血干细胞（HSC）和CEP的动员因子(12,13). 鉴于OXi-4503诱导的G-CSF显著升高，我们询问它是否对VDA治疗后CEP动员有直接影响。为此，向无瘤BALB/c小鼠输注5μg/kg人重组g-CSF，并在4小时和24小时后抽血以评估CEP。中的结果补充图1显示G-CSF诱导CEPs水平增加3-4倍，与我们使用OXi-4503观察到的情况类似。使用C57Bl/6小鼠获得了类似的结果（数据未显示）。接下来，我们通过突变G-CSF受体的坏死来评估CEP水平和相对肿瘤反应(G-CSF-R公司−/−)老鼠(14)OXi-4503处理后。和补充图2显示CEP水平G-CSF-R公司−/−与野生型对照组相比，小鼠在头24小时内没有显著变化。此外，G-CSFR−/−小鼠或野生型对照小鼠中生长的移植LLC肿瘤可以生长到肿瘤达到500mm三，此时小鼠接受OXi-4503治疗。三天后切除肿瘤，并通过测量坏死来评估肿瘤反应。中的结果研究表明，野生型小鼠的肿瘤生长在肿瘤总面积的~15%以上，而野生型小鼠肿瘤的坏死中心明显G-CSF-R公司−/−小鼠肿瘤坏死程度显著增加（约35%）。这些结果表明，G-CSF对促进CEP动员有直接作用，这至少在一定程度上有助于VDA治疗后活瘤边缘肿瘤的快速再生长。
G-CSF-R中WBC和CEP水平及相关肿瘤坏死的检测−/−OXi-4503治疗后的小鼠（A） 在基线检查时、OXi-4503治疗后4小时和24小时，对非肿瘤性G-CSF-R患者的CEP水平和（B）WBC计数进行评估−/−小鼠（填充条）和它们各自的wt控件（开放条）。（C） G-CSF-R肿瘤切片中的相对坏死−/−OXi-4503（bar=100μm）治疗后的体重控制小鼠。（D） 所有肿瘤区域坏死面积百分比的定量数据。
为了进一步评估G-CSF对CEP动员的贡献，在G-CSF-R−/−小鼠接受OXi-4503治疗4小时后，对其血浆SDF-1、VEGF和G-CSF水平进行评估。中的结果显示VEGF和G-CSF血浆水平均显著升高，尽管G-CSF-R-/-小鼠的G-CSF基线水平显著高于野生型对照小鼠的水平。有趣的是，在G-CSF-R−/−小鼠中，SDF-1水平下调，这表明SDF-1可能也间接参与了OXi-4503治疗后G-CSF诱导的CEP动员。
G-CSF-R−/−小鼠的循环G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平及其OXi-4503治疗后的体重控制在基线检查时和OXi-4503治疗4小时后，从G-CSF-R−/−（填充棒）或wt对照小鼠（开放棒）获得的血浆样本应用于ELISA，以评估小鼠G-CSF、VEGF和SDF-1水平。
VDA治疗癌症患者循环G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平的增加
为了评估我们的一些临床前结果是否可以在临床环境中重现，我们从一期临床研究中登记的晚期实体瘤患者采集血液(8)基线（预处理）和用CA4P治疗4小时后。使用特定ELISA分离血浆以评估G-CSF、VEGF和SDF-1水平。中的结果显示所有三种细胞因子的水平在CA4P治疗的4小时内显著增加，类似于我们在使用OXi-4503的小鼠中观察到的结果。总的来说，这些初步的临床结果与各自的临床前发现非常一致。
VDA（CA4P）治疗癌症患者循环G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平的评估对15名癌症患者在基线检查时和CA4P治疗后4小时采集的血液进行G-CSF（n=12）、VEGF（n=1）和SDF-1（n=6）血浆水平评估。所得结果绘制为每名患者的基线水平的倍数增加。
讨论
细胞毒性抗癌药物或治疗，包括化疗、放疗和VDA扫描，通常会引起主要的肿瘤反应，表现为肿瘤细胞死亡，随后导致不同程度的肿瘤缩小。然而，这种反应的益处，至少在延长生存时间方面是有限的，因为肿瘤的快速再生(15). 因此，开发和优化策略来减缓这种快速的肿瘤再生具有相当大的治疗意义(15). 一些可能的策略包括缩短细胞毒性治疗的间隔，如“剂量密集”化疗或过度分割放射(15)或在连续细胞毒治疗周期之间的无治疗间隔期内，联合使用靶向细胞增殖机制的生物治疗，包括抗血管生成药物(4,6,15–17).
肿瘤细胞重新增殖/再生通常被视为一种固有的肿瘤细胞驱动特性(15). 然而，我们以前的研究表明，一些细胞毒药物可以迅速激活各种宿主过程，这些宿主过程可以显著促进肿瘤的再增殖，其中之一涉及促血管生成BMDCs（包括CEPs）的急性动员和肿瘤归巢(4,6). 在我们最近的研究中，我们报道了SDF-1是紫杉醇治疗后CEP动员的分子介质之一，因为中和抗SDF-1抗体与化疗联合使用导致CEP尖峰诱导失败(6). 在这里，使用VDA作为细胞毒（类）试剂，我们牵涉到另一种负责CEP动员的分子介质。循环G-CSF显著增加，在一个数量级范围内，而且在VDA治疗后4小时内出现。然而，G-CSF-R−/−小鼠未能诱导CEP和SDF-1水平升高。Eash等人报告称，G-CSF可能通过直接下调CXCR4表达，在数小时内动员中性粒细胞(18). 此外，还发现CXCR4拮抗剂AMD3100在4小时内动员CEP和其他HSC(19). G-CSF是否通过下调CEP上CXCR4的表达，以与AMD-3100类似的方式发挥作用，尚待进一步研究确定。此外，我们还观察到，在使用OXi-4503治疗后，G-CSF-R−/−小鼠的白细胞计数水平显著快速下降，但在体重对照组中没有，这与Petit等人的最新发现一致(20)VDAs对造血细胞的直接影响。然而，在VDA治疗后，G-CSF如何维持wt小鼠的正常白细胞计数尚不清楚。
我们的结果还值得注意的是，在接受CA4P治疗的癌症患者外周血中观察到G-CSF、VEGF和SDF-1血浆水平的快速升高，其结果在某些方面与我们临床前研究中三种细胞因子的快速升高明显相似。我们注意到，尽管我们没有评估临床样本中CEP的水平，但最近的研究表明，接受MTD紫杉醇化疗或VDA（称为AVE8062）联合顺铂治疗的癌症患者，CEP水平迅速升高(6,21).
我们研究结果的一个意义与细胞毒性“剂量密集”化疗方案的结果有关，这些方案通过使用重组G-CSF生长因子支持物加速宿主从骨髓抑制中恢复而成为可能。虽然目前没有临床证据表明使用重组G-CSF会恶化临床结果，但可以想象的是，使用这种剂量密集（因此更密集）的化疗方案所获得的抗肿瘤益处比其他情况下要少。此外，关于G-CSF诱导的BMDC动员可能促进肿瘤血管生成的可能性，我们还注意到Shojaei等人的最新发现，他们报告说，G-CSF可以通过上调Bv8/前激动素间接诱导促血管生成Gr1+CD11b+髓样抑制细胞的动员(22).
总之，我们的研究结果表明，在使用VDA进行细胞毒性抗癌药物治疗后，宿主反应性分子机制有助于肿瘤的快速再生长，并表明G-CSF可以在选定的情况下被短暂地用作治疗靶点，例如作为增强VDA治疗疗效的手段。这种靶向性可能特别适用于细胞毒药物治疗与骨髓抑制无关的情况。在这方面，VDA与高度骨髓抑制无关(5,8,21).
致谢
我们感谢Cassandra Cheng出色的秘书协助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、加拿大国立癌症研究所和加拿大卫生研究院对RSK的资助；NIH（R01 HL073762）至DCL；国家癌症研究所（NCI R01 CA 90722）向JMA提交；意大利癌症协会（AIRC）、卫生研究所（ISS）和第六个欧盟框架计划（“血管靶向”综合项目合同号504743），涉及“生命科学、基因组学和生物技术促进健康”领域；并赞助了与ImClone Systems New York和OXiGENE Inc，Boston（对RSK）的研究协议；英国癌症研究中心至AH；以及Saal van Zwanenberg Stichting博士对LD的奖学金。这项人体研究由OXiGENE公司赞助和全额资助。
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