基因工程小鼠模型在化学预防研究中尚未开发的潜力：机遇与挑战

总结

引言：基因工程突变小鼠的癌症预防模型

尽管最近取得了许多进展，但癌症仍是美国死亡的主要原因。虽然许多患者受益于新的诊断和治疗方法的发展；最终，最成功的根除癌症战略将需要发现更有效的预防、早期检测和早期干预手段。虽然人类癌症的基因工程小鼠（GEM）模型可以大大增强预防研究，但迄今为止，这些模型尚未广泛用于预防研究。在这里，我们考虑了在预防研究中使用创业板模型的进展、潜力和陷阱，最后讨论了如何在未来最好地利用这些模型。对于GEM模型在癌症预防中的更深入的讨论，读者可以参考(1).

人类癌症的GEM模型是指基因组被操纵以分别获得或失去癌基因或抑癌基因功能的小鼠菌株，其后果表现在肿瘤表型中(2). 与化学诱导啮齿动物模型类似，GEM模型在历史上广泛用于预防研究，它为研究整个生物体的致癌作用提供了机会。然而，GEM模型不同于化学诱导的啮齿动物模型，因为它们的肿瘤表型是通过操纵特定的基因或遗传途径诱导的，而不是通过致癌物和/或其他促癌剂诱导的。因此，GEM模型能够在整个生物体的背景下评估肿瘤发生的特定分子途径。

GEM模型也不同于异种移植模型，异种移植通常基于人类肿瘤和/或免疫缺乏小鼠细胞系的增殖。虽然异种移植模型具有从人类癌细胞发展而来的明显优势，但它们通常来源于已建立的肿瘤或癌细胞系（并且经常来自晚期肿瘤或转移瘤），因此不太可能精确模拟致癌的早期事件。此外，由于异种移植物是在免疫缺陷小鼠体内繁殖的，因此它们不能再现肿瘤微环境、细菌菌群或宿主免疫系统对致癌的作用，这是一个值得关注的问题，因为越来越明显，这些在致癌中起着关键作用，尤其是在疾病早期(三——5).

然而，GEM模型的批评者认为，它们与人类癌症的相关性尚未确定(6)，并列举了一些在小鼠模型中进行的研究尚未被证实适用于人类癌症的例子（见下文）。另一方面，GEM模型的支持者认为，问题不是模型不相关，而是实验参数的设计方式无法有效地将研究从小鼠转化为人类癌症(7——9). 事实上，在GEM人类癌症模型中进行的预防研究的适用性将始终取决于选择模型的设计以及许多其他后勤问题。最终，为了使GEM模型的研究适用于人类，需要适当选择模型，使其生物和病理特性与所提出的实验问题相关，相反，研究的实验设计应类似于人类预防研究的设计。

因此，必须建立标准，以评估特定创业板模型对给定实验范式的相关性。此类标准应包括：（1）病理学分析-该模型是否显示了与人类癌症或其子类型相同的组织学和病理学特征？(2)疾病演变-该模型是否概括了人类疾病发展的各个阶段？(3)肿瘤微环境-该模型是否有效地概括了包括肿瘤基质、细菌菌群和免疫反应在内的宿主因素对癌症进展的贡献？(4)分子途径-该模型是否显示了与人类对应物相关的遗传、基因组、表观遗传和/或蛋白质组改变？(5)环境因素-激素、饮食或其他因素对小鼠模型疾病进展的影响与对人类的影响相似吗？

值得注意的是，在描述创业板模型的这些标准的过程中，经常会出现与理解人类疾病的分子和生物特性相关的新见解。因此，对GEM小鼠的分析阐明了肿瘤发生的关键生物学机制，为人类癌症提供了新的见解，包括端粒长度在疾病发病机制中的关键作用(10)以及最近细胞衰老在肿瘤抑制中的作用体内(11). 同样，对小鼠和人类肿瘤的分子特性进行比较分析，可以全面分析基因组途径的全球变化(12)以及作为人类疾病结局新生物标志物的特定基因的鉴定(13,14).

在接下来的讨论中，我们首先对可用于预防研究的创业板模型类型提供了历史观点(表1). 接下来，我们讨论过去在预防研究中使用小鼠模型的经验，并考虑这些过去的经验如何影响未来研究的设计。最后，我们考虑了使用创业板模型的机会以及需要克服的障碍，以有效利用其应用于预防研究。

第一代：肿块

历史上，人类癌症的第一个GEM模型是转基因模型，即所谓的“瘤小鼠”，其中特定基因（通常是癌基因，在许多情况下是SV40T抗原）通过组织特异性启动子在小鼠基因组中表达，导致癌症表型（在(15)) (表1). 这些肿块为胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和脑癌提供了一些最早的GEM模型，过去二十年来的分析为许多癌症机制的研究奠定了基础，并已用于预防和实验治疗的临床前研究。

正如所有模型系统的情况一样，转基因模型既有一定的优势，也有一定的局限性。转基因模型保持流行的主要原因之一是其设计和繁殖相对简单；这些模型为评估特定基因功能丧失对肿瘤发生的影响提供了一种直接的方法。然而，疾病的演变可能与大多数人类癌症不同，因为它是由外源基因的表达启动的，通常不是静止的。此外，根据定义，转基因模型的生成取决于合适启动子的可用性，该启动子被定义为在适当的细胞类型和适当的时空域中实现靶向表达的启动子，从而产生的癌症表型与人类对应物相似。虽然这似乎是一个很高的门槛，但在实践中，一些启动子已被有效地用于开发转基因模型，以重现其对应人类癌症的进展和表型特征(15).

第二代：肿瘤抑制剂功能丧失

GEM癌症模型进化的下一阶段是基于种系中肿瘤抑制基因的靶向性缺失(表1). 第一个这样的模型是那些导致靶向删除Trp53基因和1卢比发展了癌症表型谱(2). 值得注意的是，他们的肿瘤谱被发现与人类癌症中这些抑癌基因突变的后果不同，这是对这些GEM小鼠模型与人类癌症缺乏相关性的控诉。然而，随后的研究表明Trp53基因与零突变相反，导致与人类癌症更相似的肿瘤表型(16,17)，并且也表明视网膜母细胞瘤表型在1卢比突变小鼠依赖于其他基因的改变(18). 有趣的是，尽管这些和其他种系突变小鼠等位基因已被广泛用于研究癌症机制，但迄今为止，它们尚未被广泛用于癌症预防研究。

生殖系突变等位基因的另一个潜在局限性是，它们与遗传形式的癌症更为相似，而非在人类中更为普遍的散发形式。然而，操纵小鼠基因组的改进技术导致了更复杂的基因靶向方法，其中所选感兴趣的基因在空间和时间限制域中被条件灭活（或条件激活）。这些条件模型包括基于肿瘤抑制基因功能丧失的模型，例如Trp53基因和铂族以及癌基因的获得功能，如喀斯特（在中审查(2)). 与传统的生殖系基因靶向相比，条件基因靶向具有许多优势，例如克服了胚胎致死的问题，这通常排除了对肿瘤抑制基因纯合生殖系缺失的分析，例如1卢比和铂族此外，针对特定细胞/组织隔室的选择性基因靶向通常会产生肿瘤表型谱更有限的GEM模型，更适合临床前研究。

“下一代”癌症小鼠模型

条件模型依赖于在空间和时间限制域中实现靶向基因删除/激活的合适方法。因此，近年来，使用转基因或“敲入”方法在组织特异性隔间实现Cre重组酶的高度限制表达方面取得了巨大进展，这真正改变了此类模型在人类癌症中的应用，以及使用三苯氧胺或其他化合物激活的衍生物选择性调节Cre活性的潜力(7,19) (表1). 此外，技术进步使Cre重组酶能够通过腺病毒或慢病毒方法引入特定组织部位。例如，通过腺病毒将含有条件活化Kras等位基因的小鼠等位基因选择性地输送到肺部，从而产生了肺癌小鼠模型，为人类肺癌患者分层提供了新的见解，已导致肺祖细胞的鉴定，并已有效用于实验治疗和预防研究的临床前研究(20——23).

其他重要的技术方法包括利用系统，在该系统中，可以使用影响驱动感兴趣基因转录的响应性启动子的四环素调节激活剂来打开或关闭基因表达(24)已应用于包括肺、淋巴和乳腺在内的多个器官系统，以研究癌基因在肿瘤维持中的作用和肿瘤复发的机制(25,26). 其他操纵基因表达的方法包括在特定小鼠组织中靶向表达TVA鸡病毒受体，从而提供了一种将表达特定基因的病毒转染目标组织的方法(27)从而产生了有价值的CNS和其他组织模型(28). 此外，作为基因靶向方法的替代，稳定“敲除”基因表达的新技术体内通过传递RNAi部分被证明对建立小鼠癌症模型有效(29,30). 最后，小动物成像方法的主要技术进步，现在可以有效地可视化肿瘤体内对创业板模型的有效利用产生了巨大影响，必将成为其应用于癌症预防的资产(31).

总之，一代稳健的GEM模型现在已经可用或正在酝酿中，这些模型基于高度选择性组织特异性隔室中基因表达的有限丧失或获得功能，并具有精确的时间动力学。其中一些模型已经被验证适用于他们模拟的人类癌症，通常适用于特定的疾病亚型，目前正在学术和工业环境中开发新的治疗方法。然而，值得注意的是，使用这种“下一代”更复杂的人类癌症GEM模型进行的癌症预防研究相对较少。因此，GEM模型用于癌症预防研究的潜在前景在很大程度上仍有待探索。

过去的教训：成功还是失败？

尽管GEM模型在预防研究中的应用相对不足，但从以往研究中获得的经验教训可以帮助评估其在未来研究中对癌症预防的潜在价值。特别是，结肠是预防研究中研究最深入的领域之一，其中小鼠模型已被广泛应用(32,33). 这在一定程度上反映了结肠癌预防研究的悠久传统，以及化学诱导的可用性亚太区^分钟基于突变性功能丧失的（多发性肠道肿瘤）小鼠疾病模型亚太区在家族性腺瘤性息肉病综合征和许多人类结肠癌中也发生突变的（大肠腺瘤息肉病）基因(32,33). 值得注意的是，虽然亚太区^分钟模型已被广泛用于深入了解结肠癌的发生机制和预防研究，其表型主要发生在小肠，是非侵入性的，而发展结肠癌的新一代GEM模型应为结肠癌预防研究提供改进的模型(33,34).

广泛的流行病学证据表明，食用高脂肪“西式”饮食的人患多种癌症的几率较高，维生素D等药物对癌症有保护作用。在亚太区^分钟研究西式饮食（包括减少钙和维生素D以及增加脂肪）对结肠癌发生的影响的模型，导致突变小鼠的癌症发生率升高，这与流行病学数据一致(32,33). 然而，随后的一些前瞻性临床试验并没有证实改变饮食因素可以预防结肠癌(35)，这引发了人们对这些在小鼠中进行的临床前研究与人类结肠癌的相关性的担忧。对使用小鼠模型预防癌症持怀疑态度的人提供了这些数据，指责这些模型与人类癌症的相关性有限。

然而，小鼠模型的支持者注意到，临床试验的试验设计和终点与流行病学和临床前研究有很大不同，并指出，这些发现之间的差异可能反映了实验设计的差异，而不是小鼠和人类情况之间的实际差异。事实上，在息肉预防试验中对分层组的检查表明，最顺从的四分之一显示晚期腺瘤风险降低了三倍(36). 所以，小鼠模型的数据本质上更加同质，几乎100%符合，可能会重现人类患者的一个子组。这表明，当进行适当的比较时，小鼠模型中的发现可能是相关的。

的确，虽然习惯上考虑最佳标准模型，考虑最适合的模型实验问题; 当然，如果没有在适当的上下文框架中使用，任何模型，无论多么相关，都可以被视为非预测性的。重要的是，由于任何模型无疑都有一定的局限性，问题不在于给定的模型是否概括了人类疾病的各个方面（这几乎是不可能的！）而是它是否为正在解决的实验问题提供了可靠的信息，以及实验设计是否最终将带来适用于人类癌症的见解。

使用创业板模型预防癌症的挑战

那么，为什么到目前为止，创业板模型在癌症预防中没有得到充分利用？一个重要原因是需要对模型进行改进；事实上，可能对预防研究最有效的创业板模型是最近才上市的。如上所述，这些“下一代”模型更紧密地概括了癌症进展的演变，更有效地使我们能够查询最早的疾病阶段，并为临床前评估提供了有价值的模型。然而，此外，还有一些重要的实际和科学问题阻碍了创业板模型在癌症预防研究中的应用，如果不加以解决，这些问题将继续存在。

一个关键问题是，预防研究需要综合多种科学观点。改进将流行病学家、基础科学家、小鼠建模师、遗传学家、生物信息学家和临床医生聚集在一起的方式，将是癌症预防取得真正进展的当务之急。不幸的是，这些多个研究领域之间的交流受到了限制，尤其是在GEM模型在预防研究中的潜在应用方面。弥合这一差距的有效战略可能是建立预防研究人员联合会，包括具有上述各种补充专业知识的人员。

第二个主要问题是成本问题。突变小鼠的临床前研究费用昂贵，难以从标准的资助机制中恢复。尽管GEM模型现在越来越多地被制药行业用于实验治疗，但大多数预防研究都集中在学术环境中，几乎没有机会与行业分担成本。解决这些研究工作的高成本的一种方法是建立指定的中心，进行临床前预防研究，汇集动物处理、临床前设计和实施方面的大规模专业知识，体内影像学、病理学、基因组学和药理学。

几乎所有使用GEM癌症模型的研究的另一个主要障碍是缺乏足够数量的病理学家来批判性评估GEM模型相对于它们所代表的人类癌症的价值。虽然病理学家的参与将是成功建立将小鼠模型应用于癌症预防的协同努力的关键，但可用于此类协同努力的兽医和学术医学病理学家数量有限。此外，需要采用标准化的形态学命名法，以促进小鼠模型与人类癌症的比较(37,38). 兽医和医学病理学家之间的密切工作关系对于评估这些模型的实用性至关重要

最后，使用创业板模型的一个重大障碍是知识产权问题。特别是，在癌症研究中使用基因工程小鼠的广泛专利阻碍了在学术和工业环境中使用GEM模型对化合物进行临床前测试(9,15). 幸运的是，人们认识到GEM模型可能在识别更有可能在人体临床试验中成功的化合物方面发挥关键作用，这一认识已开始加速其在学术和工业环境中的应用(9).

使用创业板模型预防癌症的机会

尽管存在这些挑战，但用于癌症预防的创业板模型的未来非常有希望。现在是开发新一代高度复杂的小鼠模型以解决癌症预防关键问题的理想时机(图1). 然而，为了充分实现这一点，不仅需要仔细考虑模型的设计，还需要仔细考虑使用模型的实验范式的设计。此外，有必要认识到并克服模型系统的局限性，以及阻碍其有效用于癌症预防研究的实际局限性。

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图1

化学预防：从老鼠到人类

那么，使用创业板模型来加强预防研究的主要机会是什么(图1)? 首先，GEM模型提供了一个独特的机会来研究整个动物致癌的最早阶段。虽然癌前病变在人类中通常是不可接近的，但它们可以在GEM模型中进行研究，特别是利用新的成像方式。GEM模型中的此类研究可以帮助我们了解人类侵袭前病变中解除调控的分子途径，并提供模型来测试使用化学预防剂靶向此类途径的后果。事实上，考虑到人类癌症癌前病变或早期侵袭性病变的相对不易获得性、整体异质性以及无法研究随时间推移的进展情况，确定其相关途径将极为困难。然而，一旦在GEM模型中确定了途径和机制，就可以很容易地对其进行评估，以评估其与人类癌症的潜在相关性。

此外，由于大多数GEM模型是根据定义的遗传改变发展而来的，因此致癌过程相对一致，并且通常依赖于特定的去调节途径。因此，小鼠模型中的癌症表型往往是相对同源的，这有助于克服人类癌症研究中由于巨大的遗传多样性而导致的生物变异问题。因此，GEM模型可以为识别靶点验证和生物标记物检测的相关分子途径提供过滤器。最近一个令人兴奋的应用是使用GEM模型的血清特征来识别潜在的生物标记物，用于早期检测人类癌症（Hanash，S.和Depinho，R.，个人通信）(39). 此外，对小鼠遗传变异株的肿瘤表型分析有助于确定影响肿瘤表型的“风险”因素或“修饰”基因(40)在人类中很难识别。

最后，对GEM模型进行适当设计的临床前研究可以为研究新型化学预防剂的疗效以及饮食、化学、激素和/或环境影响对致癌的影响提供重要资源。特别是，对GEM模型的研究可以对单一药物进行初步测试，或评估具有潜在化学预防益处的药物组合的疗效，还可以对其毒性极限和作用机制提供初步见解体内(9,41). 此外，GEM模型为研究环境影响的后果提供了资源，例如饮食、肠道菌群或激素对致癌的影响(42——44).

总之，GEM模型提供了一个独特的机会，可以就影响癌症发生的遗传和环境因素之间的相互作用以及临床前模型提供生物学和机械学见解，以测试针对特定因素缓解致癌的后果。虽然对小鼠模型的分析永远不会成为人类临床研究的合适替代品，但如果在适当的实验范式中使用适当的模型，这种分析肯定可以帮助完善此类研究，使人类受益匪浅。

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