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生物化学杂志。2009年9月18日；284(38): 25576–25584.
2009年7月21日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M109.043133
预防性维修识别码：项目经理2757959
PMID：19622840

雄激素受体磷酸化和活性受蛋白磷酸酶1的调节*

陈绍勇,‡,1 克里斯蒂娜·T·凯斯勒,§ 布莱斯·帕斯卡尔,§,2和史蒂文·巴尔克‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

雄激素受体（AR）在多个位点被磷酸化以响应配体结合，但调节AR磷酸化的功能后果和机制尚待确定。我们最初观察到冈田酸，一种主要的购买力平价丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A和蛋白磷酸酶1（PP1）家族对AR表达具有细胞类型依赖性作用。PP2A（磷曲霉素）和PP1（牛磺酸霉素和抗PP1α催化亚基的siRNA）的更特异性抑制剂表明，PP1和蛋白磷酸酶2A对AR蛋白和转录活性具有相反的作用。PP1抑制增强蛋白酶体介导的AR降解，而PP1α过度表达增加AR表达并显著增强AR转录活性。共沉淀实验显示AR-PP1相互作用，而免疫荧光和核质分馏显示前列腺癌细胞中雄激素刺激的AR和PP1核移位。对磷酸特异性AR抗体的研究表明，PP1抑制显著增加了Ser-650的磷酸化，而Ser-650位于AR铰链区域，可以调节核输出。值得注意的是，PP1抑制导致野生型AR的核定位显著降低，但并没有改变S650A突变AR的总水平或核水平。这些发现揭示了PP1通过Ser-650去磷酸化在调节AR蛋白稳定性和核定位中的关键作用。此外，AR可能作为PP1调节亚单位发挥作用，并介导PP1向染色质的募集，从而调节转录和剪接。

雄激素受体（AR）三在前列腺癌（PCa）的发展和进展中起着核心作用，雄激素剥夺治疗是PCa的标准全身治疗(1). 无连锁AR与Hsp90伴侣复合物相关，并迅速降解。配体结合稳定AR，增强核进入，并允许AR向雄激素调节基因招募辅激活蛋白。在没有雄激素的情况下，AR在Ser-94和Ser-650处被磷酸化，雄激素治疗进一步刺激AR磷酸化，主要是在多个丝氨酸-脯氨酸位点(2–5). 与其他类固醇受体类似，AR转录活性和对低水平雄激素的敏感性可以通过多种激酶或激酶信号通路增强，这可能有助于雄激素剥夺治疗后的肿瘤进展。然而，在特定位点介导AR磷酸化的激酶，以及AR磷酸化在特定残基的功能重要性仍有待明确定义。

AR转录活性也可能被丝氨酸/苏氨酸磷酸酶直接或间接调节(6). 最近的一项研究表明SV40小T抗原依赖性蛋白磷酸酶2A（PP2A）在AR上的负载，随后AR去磷酸化(7,8). AR还与小C端结构域磷酸酶2（SCP2）相互作用，SCP2被AR募集到雄激素调节的PSA启动子，并可能通过RNA聚合酶II的去磷酸化负调节AR转录活性(9). 我们在此报告，蛋白磷酸酶1（PP1）增加AR蛋白的稳定性，并显著增强AR介导的转录。我们证明AR结合PP1、PP1α的催化亚单位，雄激素刺激PP1α与AR的核移位。此外，我们确定PP1选择性地去磷酸化AR上的一个特定位点Ser-650。最后，与最近一篇报道一致，Ser-650磷酸化介导AR核输出(10)这些发现表明，PP1是AR核表达和转录活性的直接正调控因子，并将AR-PP1相互作用确定为PCa药物开发的潜在治疗靶点。

实验程序

试剂

来源如下：类固醇、MG115、MG132、CHX和抗FLAG M2珠（Sigma）；罗氏应用科学；牛磺酸霉素和磷霉素（钙生物化学）；抗AR（PG21）、抗pAR-S81、抗PP1α、抗PP2A和微囊藻毒素琼脂糖（Upstate Biotechnology）；抗AR（N441）（实验室视觉）；抗PSA（生物设计）；抗β-微管蛋白（Chemicon）；正常小鼠血清（NMS）、正常兔血清（NRS）、蛋白G和NE-PER试剂盒（Pierce）；山羊抗兔Alexa 594（分子探针）；血清（FBS和CDS）（Hyclone）；PP1α质粒（Origene）；控制和AR RNAi（Dharmacon）。两个单独的PP1αRNAi来自Dharmacon（SMARTpool，M-008927-00）和Santa Cruz（sc-36299）。

瞬时转染报告试验和实时RT-PCR

已描述AR表达和报告质粒、报告分析和实时RT-PCR分析(12). 细胞在含有10%FBS（LNCaP和C4-2）的RPMI 1640或含有5%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基中生长。对于雄激素饥饿，细胞在含有5%木炭葡聚糖剥离FBS（CDS）的培养基中培养。为了进行转染，质粒DNA或RNAi被脂质体2000转染。空pCDNA3.1载体（Invitrogen）用于均衡，CMV-雷尼利亚荧光素酶报告员（Promega）是一名内部控制人员。使用双荧光素酶分析试剂盒（Promega）测量荧光素素酶。萤火虫和雷尼利亚荧光素酶是相对光单位（RLU），其结果是三份样品的平均值和标准偏差。

DNA突变与稳定系的产生

使用定点突变试剂盒（Stratagene）生成Flag-AR-S650A突变体。通过选择在含有10%FBS和1μg/ml嘌呤霉素的RPMI 1640中生长的细胞，建立表达Flag-AR或Flag-AR-S650A的LNCaP细胞稳定系。

免疫印迹、核分离、共沉淀和免疫荧光

用2%SDS分离总蛋白，用BCA试剂（Pierce）定量，并在预处理的凝胶（Invitrogen）上分析等量的蛋白质。使用NE-PER试剂盒（Pierce）进行细胞质-核分馏。为了进行共沉淀，在Triton裂解缓冲液（0.5%Triton X-100，20 m）中收集细胞米三氯化氢，150米米氯化钠，5米米EDTA和2 m米二硫苏糖醇）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂。上清液与40μl微囊藻毒素琼脂糖、抗Flag M2或抗AR（N441）孵育与NMS交联到蛋白G珠。

为了评估AR磷酸化，首先用抗AR（N441）沉淀AR，用一组磷酸特异性AR抗体免疫印迹等量的总AR(7,10). 对于免疫荧光，细胞在3.7%甲醛中固定10分钟，在PBS中洗涤，并在0.1%Triton X-100中渗透3分钟。在PBS洗涤后，细胞在1%牛血清白蛋白中封闭30分钟，并在一抗（1:200）中培养2小时。在PBS洗涤后，将细胞在山羊抗兔Alexa 594（1:400）中培养2小时，在PBS中洗涤，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:2000）染色5分钟。在PBS洗涤后，将细胞安装在载玻片上，并用蔡司ApoTome-HAL100显微镜观察。

结果

蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸对AR蛋白表达的细胞类型特异性影响

我们最初检测了用冈田酸（OA）（一种包括PP1和PP2A在内的多种磷酸酶的非特异性抑制剂）处理后一系列细胞系中转染AR的蛋白质水平(11). OA增加了转染293T、CV1和PC3细胞中AR蛋白的水平，同时伴随着Ser-81磷酸化的显著增加（如pS81抗体检测到的那样）(图1A类). Ser-81位点被磷酸化，以响应脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶（包括Cdk1）对雄激素的刺激，并与AR稳定和转录活性相关(4,12). 这些结果与之前的报告一致，该报告显示PP2A可以去磷酸化AR N末端结构域（包括Ser-81）中的几个脯氨酸定向丝氨酸位点，尽管在之前的研究中PP2A与AR的相互作用依赖于SV40小T抗原的负载(7,8). 然而，OA对AR转染的HeLa细胞中AR蛋白表达和Ser-81磷酸化具有相反的作用，其中雄激素（DHT）刺激的AR蛋白表达增加和Ser-81磷酸化都因OA而显著降低(图1B类). 值得注意的是，OA同样导致LNCaP和CWR22Rv1 PCa细胞系内源性AR表达的剂量依赖性降低(图1B类). MG115/132阻断了OA诱导的内源性AR蛋白的减少，表明其是蛋白酶体介导的(图1C类). MG115/132解救AR的流动性降低与磷酸化增加一致。

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抑制PP1而非PP2A会导致AR蛋白表达减少。 A类用100 ng pCIneo-hAR质粒转染293T、CV1和PC3细胞，并在10 n的CDS培养基中生长米如图所示，DHT和不同剂量的OA持续24小时。在所有实验中，在2%SDS中收集细胞，并对等量的总蛋白进行免疫印迹。B类如上所述，HeLa细胞被AR转染，同时在LNCaP和CWR22Rv1细胞中监测内源性AR。C类和D类CDS培养基中的LNCaP细胞用10 n处理24 h米DHT，20牛顿米OA、蛋白酶体抑制剂MG（MG115/132，5μ米或磷曲霉素，如图所示。E类在CDS培养基中培养内源性（LNCaP）或转染（293T和HeLa）AR的细胞米DHT（LNCaP）或在FBS培养基（LNCa P，293T，HeLa）中加入牛磺酸霉素（TAU），持续24小时。

PP1增强AR蛋白表达，与细胞类型无关

OA的细胞特异性作用使我们研究了PP1和PP2A的选择性抑制剂，这是OA抑制的主要细胞磷酸酶。磷曲霉素（PP2A特异性抑制剂）增加LNCaP细胞内源性AR蛋白表达(图1D类)并增加HeLa、COS1和293T细胞中转染AR的表达（数据未显示），表明PP2A对不表达SV40 T抗原的细胞中AR的表达进行负调控。与磷曲霉素相比，PP1抑制剂牛磺霉素在含有类固醇脱除血清（碳右旋糖酐脱除，CDS）、含有或不含DHT的培养基或含有未脱除血清的培养基（FBS）中培养的LNCaP细胞内内源性AR蛋白表达呈剂量依赖性降低(图1E类). 牛磺酸霉素同样降低293T和HeLa细胞中转染AR的表达(图1E类).

为了证实牛磺酸霉素对LNCaP细胞内源性AR的影响是由于PP1抑制所致，我们使用siRNA下调内源性PP1活性。哺乳动物细胞有三个编码PP1催化亚单位的同源基因，PPP1CA基因,PPP1CB（PPP1CB）、和PPP1CC公司，它们是牛磺霉素的直接靶点(13,14). Affymetrix寡核苷酸微阵列研究表明，LNCaP细胞表达所有三个催化亚基PPP1CA公司和PPP1CC公司大于PPP1CB（PPP1CB）（未显示数据）。通过免疫印迹法，我们可以很容易地检测到PPP1CA公司，PP1α。因此，我们使用了两种不同的siRNA池来对抗PPP1CA基因确定内源性PP1α是否增强LNCaP细胞中AR的表达。两者都有PPP1CA公司siRNA（而非对照siRNA或AR siRNA）降低LNCaP细胞和LNCaP-衍生C4-2B细胞系内源性PP1α的水平(图2A类). 值得注意的是，这种PP1α下调也导致在有或无DHT培养的LNCaP细胞和C4-2B细胞中AR水平降低。

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PP1增加AR蛋白表达。 A类，10牛顿米非特异性RNAi对照(C车道)、AR RNAi(车道AR)，或两个单独的PP1αRNAi(车道a和b条)转染LNCaP或C4-2B细胞3天。B类用100 ng pCIneo-hAR质粒转染HeLa和PC3细胞，用100 ng Flag表位标记的AR转染LNCaP细胞(标记-AR)质粒，以及0、50或200 ng PP1α载体。然后将培养基换成CDS培养基，加入10n米DHT 24小时。

作为进一步的方法，我们确定PP1α的过度表达是否会增加AR蛋白的表达。事实上，PP1α的联合转染显著增加了HeLa和PC3细胞中AR的表达，并且在没有DHT和存在DHT的情况下都可以观察到AR的表达增加(图2B类和数据未显示）。为了研究PP1对表达内源性AR的PCa细胞AR表达的影响，用PP1α和Flag表位标记AR（Flag-AR）共转染LNCaP细胞，以区分未转染细胞中外源性AR和内源性AR。如所示图2B类，PP1α也增加了LNCaP细胞中的Flag AR，尽管其作用不如在HeLa和PC3细胞中显著（可能反映了LNCaP细胞中内源性PP1活性的较高水平）。综上所述，这些结果证实了PP1正在增强AR的表达，并表明PP1α在这一作用中起着主要作用。

PP1抑制通过蛋白酶体依赖途径增加AR蛋白降解

以前的研究表明，未连接的AR迅速降解，而连接的AR更稳定，但半衰期相对较短(15). 与这些先前的研究一致，环己酰亚胺阻断AR转染的HeLa细胞中新蛋白合成的处理导致AR蛋白水平在4小时内大幅下降，在缺乏雄激素的情况下下降更快(图3A类). 蛋白酶体抑制剂（MG115/132）在无配体和有配体的情况下增加转染AR蛋白的表达(图3B类)与之前的研究一致，研究表明AR通过蛋白酶体依赖性途径降解(16).

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PP1抑制通过蛋白酶体途径促进AR蛋白降解。 A–D，将100 ng pCIneo-hAR质粒转染HeLa细胞，然后将其置于10 n的CDS培养基中米DHT，如图所示，持续24小时。A类，环己酰亚胺(瑞士法郎，5μg/ml））。B类，毫克（MG115/132，5μ米在最后4小时或整个24小时内添加每个）。C类，用DHT和牛磺酸霉素处理细胞(TAU公司)如图所示（0.2或0.5μ米)持续24h，最后4h添加环己酰亚胺。D类，用DHT处理细胞24小时，在最后8小时内添加化合物。E类和F类，LNCaP细胞在CDS中培养2天，然后培养10天米24小时DHT环己酰亚胺，MG115/132（5μ米每个）和牛磺霉素（0.5或1.0μ米)然后按指示在最后8小时或24小时添加。G公司，LNCaP细胞在FBS、CDS或CDS+10 n中生长米DHT培养基2天，含MG115/132（5μ米每个）和牛磺霉素（0.5μ米)在最后4小时内添加。

为了确定牛磺霉素是否通过增加降解降低AR蛋白的表达，我们检测了环己酰亚胺阻断新蛋白合成后牛磺菌素的作用。如所示图3C类在用环己酰亚胺处理的细胞中添加牛磺酸霉素导致转染AR蛋白水平进一步降低，表明PP1抑制增加了AR蛋白的降解。为了确定这种降解是否是通过蛋白酶体进行的，将AR转染的HeLa细胞与MG115/132联合进行牛磺酸处理。如所示图3D类MG115/132可阻断牛磺酸霉素介导的AR表达下降，表明牛磺酸霉素正增加AR蛋白的蛋白酶体依赖性降解。

在LNCaP细胞中进行了类似的实验，以检查PP1抑制对内源性AR的影响。用放线菌酮处理LNCaP-细胞8或24小时后，AR蛋白表达显著降低，而MG115/132的加入阻止了AR蛋白表达，表明LNCaP中内源性AR的降解是通过蛋白酶体进行的(图3E类). 应注意，MG115/132单独导致24小时后AR下降，这反映AR消息水平下降（数据未显示）。如上所述，在HeLa细胞中观察到，牛磺酸霉素8小时和24小时后，环己酰亚胺处理的LNCaP细胞中AR水平进一步降低，表明PP1抑制增加了内源性AR蛋白的降解(图3F类). 在用MG115/132处理的LNCaP细胞中没有观察到这种托霉素诱导的AR降解，这表明托霉素增强了内源性AR的蛋白酶体依赖性降解(图3G公司). 在类固醇激素缺失培养基（煤焦-外激素剥离FBS培养基，CDS）、添加DHT的CDS培养基或FBS培养液中培养的LNCaP细胞也获得了类似的结果(图3G公司).

PP1与AR互动

为了评估PP1和AR之间的潜在直接相互作用，我们在共同转染Flag-AR和PP1α的293T细胞中进行了共沉淀实验。值得注意的是，在FBS或CDS培养基中培养的Flag AR转染细胞中，抗Flag特异性沉淀出大量的PP1α，但没有检测到PP2A(图4A类). 重要的是，PP1α也可以与LNCaP细胞的内源性AR共免疫沉淀(图4B类). 为了进一步验证内源性PP1α和AR之间的相互作用，我们使用了微囊藻毒素，该毒素与购买力平价家族磷酸酶，广泛用于沉淀PP1和PP2A及其相关蛋白(17). 在这些实验中，我们首先使用微囊藻毒素结合珠从FBS培养基中生长的LNCaP细胞中高效沉淀PP1。通过免疫印迹法，我们很容易检测到AR以及与微囊藻毒素珠相关的高水平PP1α(图4C类).

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AR与PP1α结合。 A类将293T细胞转染，不转染或转染2μg Flag-AR载体，然后在FBS或CDS培养基中培养24 h。用抗旗帜M2珠或正常小鼠血清（NMS）珠沉淀裂解液作为对照。B类用抗AR抗体（N441）或正常小鼠血清（NMS）沉淀FBS培养基中LNCaP细胞的裂解物，两者均与蛋白G珠交联。C类将LNCaP细胞在FBS培养基中的裂解物用微囊藻毒素-琼脂糖珠连续沉淀三次。输入为第一次沉淀前裂解液的2%(之前)第三次降水后(邮递).D类，在CDS培养基中LNCaP细胞的裂解物，不含或含10 n米DHT持续24小时，如C.E公司，如中所示A类用1μg PP1CA和2μg CMV-Flag载体或Flag-AR载体转染FBS培养基中的293T细胞。然后用500 n米牛磺酸霉素15分钟或8小时。用反旗帜M2珠沉淀裂解液。

为了解决AR是否与微囊藻毒素珠非特异性相关，我们从裂解物中进行了一系列沉淀，以耗尽PP1，并确定这是否会消除AR相关性。如所示图4C类，三轮微囊藻毒素沉淀显著耗尽了裂解物中的PP1α，而没有显著影响AR水平（比较第一次免疫沉淀前、第三次沉淀前和第三次免疫沉淀后AR和PP1α的输入）。重要的是，在缺乏PP1的裂解产物中，微囊藻毒素珠的AR沉淀显著减少，这表明AR与微囊藻素珠没有非特异性的联系。使用CDS培养基中培养的LNCaP细胞的裂解物，获得了类似的结果(图4D类). 在DHT存在下，PP1α相关AR的数量增加，但总输入AR水平也被DHT增强，因此结合似乎不是强烈的配体依赖性。最后，AR-PP1α相互作用不依赖于PP1的催化活性，因为PP1对牛磺酸霉素的抑制不会改变它(图4E类). 综上所述，这些发现支持以下结论：AR和PP1α之间存在直接或间接（由PP1调节亚单位介导）的相互作用，并且这种相互作用不需要雄激素。

雄激素刺激AR表达细胞PP1核移位

未连接的AR广泛分布于细胞中，配体结合刺激LNCaP细胞中AR的快速核积累(图5A类). 因此，为了进一步评估是否存在生理性AR-PP1相互作用，我们接下来确定是否存在PP1α对雄激素反应的可检测核移位。值得注意的是，DHT在LNCaP和CWR22Rv1 PCa细胞中诱导了一部分内源性PP1α的快速核积累，但在AR阴性PC3细胞中没有(图5,B–D类). DHT处理的LNCaP细胞的核蛋白分级类似地显示AR的时间依赖性核进入，伴随着PP1α的核输入(图5F类). 这些结果进一步支持了AR-PP1相互作用，并提示PP1α可能与核内AR相关，参与AR核功能的调节。

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雄激素刺激AR表达细胞中PP1α核转位。 A–E将LNCaP、CWR22Rv1和PC3细胞在CDS培养基中的玻璃盖玻片上生长2天，在不使用或使用10n的情况下处理米DHT 15分钟，然后固定在福尔马林中。然后用抗AR、抗PP1、正常兔血清（NRS）或DAPI对细胞进行染色，并拍摄代表性区域的照片。F类在CDS培养基中培养2天的LNCaP细胞用10 n米DHT持续30分钟、1小时、2小时和4小时，核与全细胞蛋白提取物被印迹。

PP1增强AR转录活性

证明AR-PP1α相互作用和协同核转位的数据表明，PP1可能参与AR核功能的调节。为了验证这个假设，我们首先检查PP1α是否可以调节AR转录活性。如所示图6A类PP1α的共同表达增强了LNCaP细胞内源性AR的基础和DHT刺激的转录活性。为了确定PP1是否使AR对低水平雄激素敏感，在一系列DHT浓度下刺激PP1α转染的LNCaP细胞。如所示图6B类在没有PP1α的情况下，DHT可刺激AR活性约4倍。当细胞与PP1α共转染时，这一作用进一步增强了约2.5倍，尽管在没有DHT的情况下，基础活性也增加了约2倍。这种刺激似乎对转录没有一般影响，因为对控制CMV调节的转录没有影响雷尼利亚荧光素酶报告基因（数据未显示）。值得注意的是，PP1α没有显著降低刺激所需的DHT水平（～10 n米DHT）。

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PP1刺激AR转录活性。 A类，LNCaP细胞转染2.5 ng对照雷尼利亚报告人、50 ng ARE-核糖核酸酶报告人和PP1α质粒。将培养基改为CDS，不加或加10n米24小时的DHT和相对光单位（RLU，萤火虫比率/雷尼利亚荧光素酶）进行评估。B类和C类，LNCaP细胞转染雷尼利亚控制，ARE4-荧光素酶、50 ng PP1α质粒和细胞C类还与50 ng pCIneo-hAR质粒共转染。将培养基改为CDS加不同剂量的DHT培养24小时。D类，LNCaP细胞转染报告基因和PP1αA类除100 ng Flag-AR质粒外。通过抗Flag免疫印迹分析复制孔的萤光素酶活性或Flag AR表达。Flag抗体的条带强度归一化为β-微管蛋白，在没有PP1的情况下，比率设置为1。E类和F类，LNCaP公司(E类)和PC3(F类)用AR（100ng）、PP1α，雷尼利亚荧光素酶对照报告子和指示的AR驱动荧光素素酶报告子（Pb:Probasin），然后在CDS培养基中培养24 h，不含或含10 n米DHT如图所示。显示RLU归一化为非PP1α样品。

DHT对瞬时转染报告基因的LNCaP细胞AR活性的适度诱导似乎反映了内源性AR的限量，并且可以通过与AR的共转染而增加。因此，我们接下来检测了转染AR和ARE的LNCa P细胞4-荧光素酶报告子，负或正PP1α。AR的转染，减去PP1α，增加了10 n时DHT对～13倍诱导的反应米DHT公司(图6C类). 与PP1α共转染再次适度增加了基础活性，但在没有PP1的情况下，DHT刺激的报告基因活性显著提高了约14倍(图6C类). 由于这种放大的活性，可以在低10倍的DHT（0.1n米DHT），但在～1 n时观察到半最大刺激米在没有和存在共转染PP1α的情况下进行DHT。

PP1增强雄激素刺激转录的一种机制是通过增加AR蛋白表达（尽管如图2B类，PP1α转染不会显著增加LNCaP细胞中的总AR水平）。尽管如此，为了解决这一机制，LNCaP细胞与PP1α、ARE共转染4-荧光素酶报告基因和Flag-AR。如所示图6D类PP1α和AR在LNCaP中的共表达导致AR报告基因活性显著增加。相反，在同一个实验中，Flag-AR的表达有一个更适度的增加，这表明AR蛋白的增加并不是报告基因表达增强的唯一基础。最后，为了研究PP1的作用是否是启动子/增强子特异性的，将类固醇缺失培养基中的LNCaP和PC3细胞（AR-阴性PCa细胞系）瞬时转染AR和一组AR-调节荧光素酶报告基因，即负或正PP1α，并评估DHT刺激的活性。如所示图6E类（LNCaP）和6F类（PC3），共转染PP1α强烈增强了所有四个雄激素调节报告基因的AR反式激活。总之，DHT刺激的AR报告基因在AR和PP1α共转染LNCaP细胞中的表达显著增加，再加上这些细胞中AR蛋白的适度增加，表明PP1α除了对AR蛋白表达的影响外，还可以增强AR转录活性。

PP1抑制剂牛磺酸霉素对AR转录活性的影响

与上述结果一致，用AR调节的报告基因瞬时转染表明，PP1抑制剂牛磺酸霉素可以显著降低DHT刺激的转录活性(图7A类). 此外，使用定量实时RT-PCR，我们发现牛磺酸处理LNCaP细胞可以抑制DHT刺激的内源性雄激素调节的表达PSA公司和TMPRSS2型基因(图7,B类和C类). 与这些结果一致，我们还发现两种不同的PP1αsiRNA降低了LNCaP细胞中DHT刺激的PSA mRNA水平(图7D类).

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PP1抑制降低内源性AR介导的转录活性。 A类，LNCaP细胞转染2.5 ng雷尼利亚控制，50纳克ARE4-或PSA-荧光素酶报告质粒。然后将培养基改为不含或含10n的CDS米DHT和500 n米牛磺酸霉素治疗24小时。B类和C类如图所示，在CDS培养基中生长2天的LNCaP用DHT和牛磺酸霉素处理。分离总RNA用于PSA的实时RT-PCR分析(B类)和TMPRSS2(C类)基因表达。所示值是重复样本的平均值，代表了两个实验。D类，LNCaP转染20 n米用于非特异性控制的RNAi(NS公司)、AR或PP1，在CDS培养基中培养2天，然后用10 n处理米DHT 24小时，如图所示。提取总RNA用于实时RT-PCR分析PSA公司基因表达。E类和F类，LNCaP公司(E类)和C4-2(F类)细胞在CDS培养基中分裂2天，用不同剂量的DHT处理24小时，不使用或使用250 n米牛磺酸霉素。G公司在CDS培养基中分裂2天的LNCaP细胞用10 n米DHT 24小时，以及不同剂量（n米)PP2A特异性抑制剂磷曲霉素。

评估牛磺酸霉素对内源性AR蛋白的影响与AR转录活性，我们检测了LNCaP细胞中的DHT剂量反应。在没有牛磺酸霉素的情况下，AR蛋白水平增加，并且在0.1–1 n时强烈刺激PSA表达米DHT公司(图7E类). 牛磺酸霉素在较低DHT浓度下导致AR总蛋白减少，但在较高DHT浓度时AR水平部分恢复。在较高的DHT浓度下，Ser-81的AR磷酸化也部分恢复，尽管在高DHT浓度时，pS81相对于总AR的水平仍然降低。相反，在低DHT浓度下，牛磺霉素显著降低了PSA水平，而在高达100 n DHT浓度时，PSA水平没有恢复米尽管AR总额有所增加(图7E类). 在C4-2细胞中也获得了类似的结果，这些细胞在没有添加DHT的情况下具有大量的基础AR活性，并且对较低水平的DHT有反应(图7F类). 总之，PP1α转染和牛磺酸霉素数据表明，内源性PP1α可以显著增强AR转录活性，除AR蛋白稳定外，其他机制也可能有助于此效果。

与牛磺酸霉素相比，PP2A抑制剂磷霉素增加了LNCaP细胞的AR蛋白，并显著增加了pS81和PSA(图7G公司). 这一结果证实了PP2A对不表达SV40 T抗原的细胞中的AR负调控，并表明蛋白磷酸酶对AR表达和磷酸化有明显影响(图7G公司).

PP1抑制增强Ser-650的AR磷酸化并降低AR核定位

上述结果表明，PP1α既能稳定AR又能增强其转录活性，但尚不清楚这些是否是PP1对AR的直接作用与PP1对调节AR稳定性和活性的其他蛋白质的间接影响。因此，我们接下来使用一组针对先前确定的AR磷酸化位点的磷酸化特异性抗体来确定特定位点的AR磷酸化度是否因PP1抑制而增加(7,10). 从牛磺酸霉素或对照处理的LNCaP细胞中沉淀AR，然后用磷酸特异性AR抗体免疫印迹等量的总AR蛋白。牛磺酸治疗导致Ser-650磷酸化显著增加，Ser-256和Ser-424适度增加，Ser-16、Ser-81、Ser-94、Ser-213或Ser-308没有明显变化(图8,A类和B类和数据未显示）。这一结果表明，尽管我们还不能排除其他位点的去磷酸化或PP1抑制强烈激活靶向Ser-650的激酶的可能性，但PP1可以选择性地去磷酸化Ser-650处的AR(4,10). 有趣的是，先前对PP2A在AR N末端靶向位点的研究发现，PP2A没有降低Ser-650磷酸化，这与Ser-650是PP1特异靶向位点一致(7).

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PP1介导Ser-650的AR去磷酸化和核滞留。 A类LNCaP细胞在FBS培养基中分裂2天，500 n米添加牛磺酸霉素1或8 h。用抗AR（N441）沉淀AR，并用一组磷酸-AR特异性抗体和总AR抗体免疫印迹等量的总AR。每个磷化抗体的条带强度均归一化为总AR，在不含牛磺酸霉素的情况下，比率设置为1。然后测定牛磺酸霉素1或8小时后的倍数增加，图表显示了三个独立实验的平均倍数变化。B类，显示pS81和pS650抗体结果的代表性印迹。C类LNCaP细胞在CDS培养基中培养2天，10 n米加入DHT 1小时和4小时。牛磺酸（500n米)如图所示添加，用NE-PER试剂盒收集细胞核和细胞质蛋白。D类，如中所示C类CDS培养基中生长的LNCaP细胞用10n米DHT和牛磺酸霉素，有和没有蛋白酶体抑制剂（MG115/132，5μ米每个）如所示，以及核与评估细胞质AR。E类在FBS培养基中培养表达标记AR野生型或S650A突变体的LNCaP稳定株，并用牛磺酸（500 n）处理米)如图所示。然后用抗标记抗体对细胞核和总蛋白提取物进行免疫印迹。

AR磷酸化在大多数位点的功能意义尚未确定，但最近的结果表明，Ser-650磷酸化和OA处理可以增强AR核输出(10,18). 因此，我们确定牛磺酸霉素治疗是否改变了LNCaP细胞内源性AR的核定位。不出所料，在雄激素缺失培养基中对LNCaP细胞进行DHT治疗，可显著增加细胞核AR，相应减少细胞质AR(图8C类). 添加牛磺酸霉素降低了核定位，核质AR的比率显著降低。牛磺酸霉素也导致与蛋白酶体抑制剂（MG115+MG132）联合处理的细胞中核AR的丢失，这与AR细胞定位的直接影响一致，即独立增加降解(图8D类). 综上所述，这些结果表明PP1抑制正在增强AR Ser-650磷酸化、核输出和降解。

最后，为了确定PP1抑制的这些作用是否依赖于增加的Ser-650磷酸化，我们检测了S650A突变型AR。在这些实验中，我们生成了稳定转染N末端Flag表位标记野生型或S650A AR的LNCaP细胞，牛磺酸霉素治疗表达Flag标记野生型AR的细胞导致核Flag-AR的显著丢失和总Flag-AR表达的减少(图8E类). 相反，牛磺霉素并没有降低细胞核中Flag-AR（S650A）的水平或降低总细胞水平(图8E类)表明PP1抑制的这些效应是由增强的Ser-650磷酸化介导的。

讨论

我们最初观察到非特异性磷酸酶抑制剂OA对AR的细胞类型特异性影响。使用更特异的PP1抑制剂（牛磺酸霉素）和PP1 siRNA，我们发现蛋白酶体介导的AR降解在所有检测的细胞类型中都随着PP1抑制而增加。相反，PP1α的过度表达增加了AR表达和转录活性。相反，PP2A特异性抑制剂磷曲霉素增强AR蛋白的表达和反式激活，支持PP2A在不表达SV40小T抗原的细胞中负AR调节中的生理作用(7). 虽然无法检测到AR和PP2A之间的关联，可能反映了微弱的短暂相互作用，但我们很容易通过共沉淀检测到不依赖雄激素的AR-PP1相互作用。DHT处理还刺激内源性AR和PP1α的核转位，支持生理相互作用，并表明AR可能作为PP1核靶向的PP1调节亚单位发挥作用。值得注意的是，PP1抑制导致了Ser-650磷酸化的显著和特异性增加。此外，与最近显示Ser-650磷酸化刺激AR核输出的数据一致(10)，我们发现PP1抑制显著降低核AR。最后，PP1抑制对AR水平和核定位的这些影响被S650A突变所抵消，表明它们是由于该位点的磷酸化所致。综上所述，这些结果表明PP1与AR相互作用并增强其稳定性，AR有助于PP1核募集，PP1通过选择性去磷酸化Ser-650增强AR核表达。

蛋白酶体介导的AR降解增加是对牛磺酸霉素抑制PP1的反应，这可能是由于核输出增加和随后细胞质中泛素连接酶的暴露所致。然而，Ser-650也嵌入PEST序列（残基638–658）中，该序列可能直接靶向AR，通过蛋白酶体或胱天蛋白酶-3依赖性途径降解(19–21). 值得注意的是，一份报告表明Ser-650磷酸化增强了AR和E3泛素连接酶CHIP之间的相互作用(22). 虽然PP1结合不是雄激素依赖性的，但通过配体结合或与其他蛋白质的相互作用介导的AR构象变化可能会调节PP1对pS650的可及性，从而间接调节AR的定位或降解(8).

在本研究中，共沉淀实验表明AR和PP1α之间存在直接相互作用，尽管还不能排除PP1调节蛋白介导的间接相互作用。PP1催化亚基与许多调节亚基的结合部分由短基序（R/K）V介导X（X）F类(13,14,23,24). AR有一个位点（KVFF）适合这个基序，它位于DNA结合域，是DNA识别螺旋的一部分。我们的初步研究表明，AR-PP1结合不需要该位点（数据未显示）。然而，还需要进一步的研究来确定AR是否通过该位点或其他基序与PP1催化亚基直接相互作用(25). 或者，结合仍然有可能是通过PP1调节蛋白介导的。

在前列腺癌细胞中，PP1过度表达显著刺激AR介导的转录，而PP1抑制显著削弱AR转录活性。AR蛋白总表达的变化幅度较小，不太可能完全解释这些对转录的影响。核AR增加显然为PP1刺激AR转录活性提供了进一步的机制。此外，已知PP1与调节染色质重塑、转录和mRNA剪接的多种蛋白质相互作用(26–31). 因此，除了介导Ser-650去磷酸化和增加核AR外，PP1还可能被征募到AR靶基因并作为AR转录活性的辅激活子发挥作用。此外，AR对PP1的核募集提供了一种机制，AR可以通过这种机制增强特定基因的转录和调节剪接。这些假设目前正在调查中。

致谢

我们感谢Daniel Gioeli博士（弗吉尼亚大学）慷慨提供pS650 AR抗体。我们感谢Tao Zhang和Xin Yuan博士生成并提供Flag-AR载体，感谢Howard Shen博士提供Probasin-Luc，感谢Robert Borgesi博士提供技术援助。

*这项工作得到了国防部拨款PC060807和国家卫生研究院拨款R01CA111803和P50 CA90381（发给S.P.B.）的支持。这项工作还得到了SPORE职业发展奖、DOD博士后奖PC040499和NIH K99CA135592（至S.C.）、好时家庭前列腺癌研究基金会以及前列腺癌基金会挑战奖的支持。

三使用的缩写如下：

应收账
雄激素受体
FBS公司
胎牛血清
美国公共广播电视公司
磷酸盐缓冲盐水
办公自动化
冈田酸
达皮
4′，6-二氨基-2-苯基吲哚
聚丙烯
蛋白磷酸酶
PCa公司
前列腺癌
RLU（RLU）
相对光单位
DHT公司
二氢睾酮。

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32证据中删除
文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会