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Ana Chim学报。作者手稿；PMC 2010年10月5日发布。
以最终编辑形式发布为：
Ana Chim学报。2009年10月5日；651(2): 201–208.
2009年8月27日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.aca.2009.08.032
预防性维修识别码：PMC2757635型
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院14092
PMID：19782812

脂质生物合成的高分辨质谱和核磁共振同构体分析

安德鲁·莱恩,1,2 特蕾莎·W·M·范,1,2,三 谢正之,2,三，4 亨特·N.B.莫斯利,2,三和理查德·东芝2,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

我们将2D-NMR和输注FT-ICR-MS与计算机辅助分配相结合，以分析13甘油磷脂（GPL）的C同位素直接存在于粗细胞提取物中，从而在几分钟内产生了3000个以上等压分子的极高信息吞吐量。为了将同位素与其他GPL结构区分开来，要求质量精度高于1 ppm，测量m/z的分辨率为100000。从[U上生长的LCC2乳腺癌细胞中提取的GPL的同位素分析-13C] -葡萄糖提供了关于GPL生物合成和周转的丰富信息。基于自然丰度背景，FT-ICR-MS的同位素强度比精确到≈1%或更好，并且取决于信噪比。公司成立的时间进程13C来自[U-13C] 对葡萄糖转化为特定磷脂酰胆碱进行了详细分析，以定量测量生长LCC2细胞中甘油、乙酰辅酶a和总GPL池的大小。位置的独立和互补分析13使用从高分辨率2D NMR获得的甘油和脂肪酰基链中的C富集来验证模型的关键方面。该技术能够简单快速地制备样品，进行快速分析，并且通常适用于几乎任何头部组的未分离GPL，以及其他类别代谢物的混合物。

关键词：稳定同位素分析、FT-ICR-MS、NMR、磷脂生物合成

1.简介

脂质的生物合成和周转是所有细胞维持和生长的重要组成部分，通常占细胞干重的10-20%[1]. 特别是，分裂细胞必须在细胞周期的每一段中使其脂质含量加倍，而且众所周知，增殖癌细胞上调脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶的表达或活性，这是脂肪酸生物合成中的两个关键酶[2–5]. 然而，细胞也可以从饮食中获得脂肪酸，一些不饱和脂肪酸在哺乳动物中是必不可少的[6]. 脂质代谢错误会严重影响细胞完整性，这已成为一个新的研究领域（“脂质组学”）[7–10]. 因此，脂质周转的细胞特征，以及它们如何随着疾病状态或环境损伤而变化，是我们理解细胞疾病的基础。

虽然生物系统中脂质的识别和量化至关重要，但确定其动态关系（如合成和周转）也同样重要。这需要使用示踪方法跟踪原子从源到产物，并确定前体的相对池大小。放射性示踪剂长期以来一直用于这一目的，但检测方法通常很少提供有关生物合成过程中实际标记的位置数量的信息[11,12]. 也使用了稳定同位素[9,11,13,14]特别是用于测量细胞或整个生物体的脂质生物合成，从而避免使用有害的放射性同位素[15–23].

使用MS和NMR检测的稳定同位素示踪有几个优点，包括易于处理，以及能够同时测量代谢物混合物中的大量标记位置。特别是，傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）的超高分辨率和精确质量能力可以在无需色谱分离的情况下同时测定数百到数千种脂同位素和同位素。这是MS当前应用程序的逻辑扩展[24–27] [28,29] [30] [31]和核磁共振[32] [33–35]关于脂质分析。通过与多种稳定同位素富集前体（例如。13C或2标记在不同位置的H-葡萄糖或脂肪酸），可以追踪各种脂质的详细转化途径。这些信息可能会提高对脂质代谢及其在细胞疾病中的失调机制的理解。然而，据我们所知，基于2D NMR的系统应用13迄今为止，尚未探索GPL混合物中具有高质量分辨率FT-ICR-MS同位素分布的C位置同位素，以及所需的仪器性能。

在过去的二十年里，我们一直在使用稳定同位素示踪方法来跟踪13C和15使用MS和NMR检测将N标记前体直接转化为粗提取物中的多种代谢物，无需使用色谱分离[36–44]. 这里我们描述一个13基于C质谱同位素的分析方法，用于测量在[U上生长的乳腺癌细胞分裂过程中GPL的净合成-13C] -葡萄糖。使用直接滴注纳米喷雾FT-ICR-MS直接在粗提取物上测定同位素分布，作为标记时间的函数，无需色谱分离、衍生或其他化学程序。这项分析是通过利用超高质量分辨率来实现的，这种分辨率可以在完整的全分子物种中区分中子和质子[30,46,47]. 作为[U-13C] -葡萄糖产生[U-13C3]-甘油和13C2-乙酰辅酶A，将这些标记的前体物质并入GPL中，会使新合成的GPL增加3和2n个质量单位，这些GPL在质量同位素剖面中易于区分。高分辨率2D补充了FT-ICR-MS分析1提供独立定量位置同位素分布的核磁共振氢谱[36,38,40]GPL的甘油和脂肪酸部分。这种方法可以通过检查和直接积分峰来识别同位素，从而提供所需的富集度[40]. 这种技术的结合既提供了GPL物种的明确分配，也提供了对前体池大小的稳健估计。

2.实验

2.1材料

[美]-13C] -葡萄糖（99%原子量）购自Sigma Aldrich（密苏里州圣路易斯）。RPMI 1640培养基和胰蛋白酶购自Hyclone（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），Biowest胎牛血清购自USA Scientistic（Ocala，FL），青霉素/链霉素购自Atlanta Biologicals（Lawrenceville，GA）。

从Avanti Lipids（Alabaster，AL）中获得纯PC标准物（DMPC、DPPC、DSPC和DOPC），以验证天然丰度下的鉴定和同位素比率。光盘三OD（>99.9atom%）购自马萨诸塞州剑桥同位素实验室。其他溶剂为可用的最高试剂等级。

2.2方法

2.2.1细胞培养和处理

MCF7-LCC2细胞系是Young-Mee Park博士（罗斯韦尔公园癌症研究所）慷慨捐赠的。细胞培养在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、2 mM谷氨酰胺和0.2%未标记或均匀标记的RPMI培养基中13C-葡萄糖（[U-13C] -Glc，37°C，在含5%CO的增湿生长室中2大气。细胞生长3、6、11和24小时，然后通过0.25%胰蛋白酶处理将其分离，在过量的冰镇PBS中洗涤两次，并在4°C下1700 g下旋转5分钟，以获得牢固的细胞颗粒。去除PBS后，细胞颗粒立即在液氮中闪速冷冻并冻干。

使用100%甲醇和1 mM丁基羟基甲苯（BHT）作为抗氧化剂，在球磨机（MM200，Retsch，Newtown，PA）中用3 mM直径的玻璃珠萃取GPL 1分钟。甲醇提取物在Speedvac（Eppendorf，Westbury，NY）中真空干燥，再溶解于0.5 ml甲醇加1 mM BHT中，并通过0.45μm再生纤维素膜旋滤器过滤（Alltech Associates，Deerfield，IL）。用1.65 pmol/μL利血平作为内标物、1mM BHT和7.5 mM甲醇中的醋酸铵将滤液稀释100倍，然后加载到96 well的微量滴定板上进行FT-ICR MS分析。未稀释提取物用于核磁共振分析（见下文）。

2.2.2质谱

样品在配备TriVersa NanoMate离子源（纽约州伊萨卡市Advion BioSeciences）和“a”型电喷雾芯片（喷嘴内径5.5μm）的混合线性离子阱-FT-ICR质谱仪（Finnigan LTQ FT，Thermo Electron，Bremen，Germany）上进行分析。TriVersa NanoMate通过施加2.0 kV电压，在无压头的情况下，在正离子模式下运行。在150至1300 Da的质量范围内记录MS运行。最初，采集低分辨率MS扫描1分钟，以确保电离的稳定性，然后使用FT-ICR分析仪采集高质量精度数据，其中采集MS扫描8.5分钟，目标质量分辨率为100000，800 m/z。AGC（自动增益控制）最大离子时间设置为500 ms（但通常使用<10 ms），并为每个保存的光谱采集五次“μ扫描”；因此，每个转换和保存的光谱的周期时间约为10 s。LTQ-FT根据制造商的默认标准建议进行调整和校准，其质量精度优于1ppm，并且能够在m/z=400时达到400000的分辨率。

使用QualBrowser 2.0（Thermo-Electron）将FT-ICR质谱作为精确的质量列表导出到电子表格文件中，通常导出所有观察到的峰。甘油磷脂种类根据其准确质量进行分类[30]首先根据内标物（利血平）的观测质量应用小的线性校正（通常<0.0005），然后使用内部软件工具PREMISE（PRecaculated Exact mass Isopologue Search Engine）（R.M.Higashi，未出版）进行手动验证。PREMISE是一个简单的例程，只需将观察到的m/z值与理论值进行匹配，可选择的窗口为0.0008 Da或更小。对于GPL，大量（>7000）可能的GPL及其加合物（主要是H和Na）的确切质量预先计算到电子表格查找表中。换句话说，PREMISE简单地将每个频谱的人工劳动自动化数千次。整体方法足以将GPL分配给特定类别，即酰基链总长度和饱和度，以及头组标识。

2.2.3 GPL的核磁共振分析

将细胞的甲醇提取物冷冻干燥并在100%d中再溶解4-甲醇并加载到5mm甲醇敏感性匹配的志贺美管（志贺美公司，Allison Park，PA）中。在20°C的瓦里安·伊诺瓦光谱仪上，在18.8 T下记录核磁共振谱。一维1H和1D13记录C HSQC光谱，循环时间为5 s。记录2D TOCSY光谱，采集时间为0.3 s2和0.042秒（单位：t）1使用50 ms MLEV-17自旋锁，场强9 kHz，循环时间2 s。TOCSY数据矩阵在t2到8192个复数点，线性预测，并将t中的4096个复数点补零1自由感应衰减在两个维度上都使用非移位高斯函数和1-Hz线宽指数进行切趾。化学位移参考3.32 ppm的残留溶剂甲醇质子共振。对最终光谱进行基线校正，并仔细分阶段进行整合。使用Varian VNMR软件对峰值体积进行整合，并根据之前描述的差异松弛进行校正[38,40]. 在可能的情况下，将2D积分与1D积分进行比较，结果表明富集的准确性在±2%以内。这与该技术方法的分析精度相当。在相同条件下记录DMPC、DPPC、DSPC和DOPC标准，以分配共振，并测量准确的T1附加到的质子值12C和13C（卫星）使用反演恢复。

2.3型号说明

磷脂酰胆碱（PC）等GPL的碳骨架包括一个5碳磷酸胆碱单元，该单元连接到一个三碳甘油主链上，甘油主链在1和2位置酯化为两条脂肪酰基链(图1). 在哺乳动物细胞中，胆碱部分来自培养基，而甘油磷酸和脂肪酸可以合成从头开始从培养基中或通过回收现有膜或内部储存的甘油三酯获得。在分裂细胞中，GPL的合成是净的，葡萄糖是碳的主要来源。生物合成的磷酸甘油来源于糖酵解中间体二羟基丙酮-3-磷酸（DHAP）。脂肪酸是由乙酰辅酶A生成的，乙酰辅酶a可以由包括葡萄糖在内的多种来源的丙酮酸制成。因此，有5种成分或前体，即磷酸甘油、乙酰辅酶A、两个酰基链和胆碱（或其他头基），直接参与每个GPL生物合成。在这里报告的实验中，虽然串联质谱的独立分析表明，所检测的主要GPL的脂肪酸为C16:0和C18:1，但这两个酰基链没有区分。

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甘油磷脂酰胆碱的结构

当细胞生长在含有[U-13C] -葡萄糖-每个细胞内代谢物可被视为13C-标记和非标记物种。然而13C-标记的GPL前体，即甘油-3-磷酸、脂肪酸和乙酰辅酶A，直接从标记的葡萄糖合成先验的未知。核磁共振数据表明甘油部分是天然丰度13C或13C3.在一级近似下，醋酸盐被认为存在于天然丰度或13C2（即完全来自葡萄糖）。脂肪酸链要么是天然丰度下预先存在的，要么是合成的从头开始来自乙酰辅酶A。在这里，我们已经确定了新合成的脂肪酸的等位异构体和等位异构体分布，假设从标记和未标记的乙酸盐的公共池中随机添加。根据二项式定理计算自然丰度分布如下：

p（m）=（1−f）n个（f）米不！/[m！（n−m）！]
(1)

其中p（m）是找到m的概率13C原子，n是碳原子的总数，f是13C（天然丰度=1.108%）。对于PC34:1中的自然丰度分布，n=42。对于脂肪酰基部分，分配计算为n=8和n=9乙酰辅酶a单位（假设每个循环包含两个碳单位，以生成总共16+18=34个碳）。其他同位素丰度足够低，可以忽略不计，但在这种质量分辨率下是可以区分的。

一次13C被纳入分子中，自然丰度贡献的计算变得更加复杂[48–52]，并且效果取决于每个位置处存在的标签的实际程度。在这里，我们实施了一种迭代剥离方法，以解释在纳入13C原子。

这是基于最终衰减的二项式项(等式2)描述了多种可能的组合13C特定分子的自然丰度合并，

B类(n个,k)=(C类马克斯−n个k−n个)N个一C类13k−n个(1−N个一C类13)C类马克斯−k;B总和(n个)=∑k=n个+1C类马克斯B类(n个,k)
(2)

式中，Cmax是分子中碳原子的数量，NA（0.01109）是13C.见证人13C富集，自然丰度的影响可以使用一系列衰减二项式项进行计算，如下所示等式（3）代表来自13C每种质量同位素的天然丰度。

我M（M）+我=我M（M）+我,N个一−∑x个=0x个<我我M（M）+x个B类(x个,我)1−B总和(我)
(3)

从i=0开始。I是I的强度第个物种，B（x，i）定义于等式（2）

算法的细节将在其他地方介绍。

随着细胞的分裂，预计并观察到（见下文）预先存在的GPL（自然丰度）的比例会随着时间的推移而减少。因此，假设存在以下物种：

  1. 米0：自然丰度（预先存在）GPL
  2. 米0+3：未标记的FA+标记的甘油
  3. 米0+第二名：13C-标记的FA（新合成）+未标记的甘油
  4. 米0+3+2n：13C标记FA+13C-标记甘油

观察到的强度分布（I）是这些物种的线性组合，I（n）=p1我（m）0)+p2我（m）0+3） +磅三我（m）0+2n）+p4我（m）0+3+2n）（2）和∑p我=1

这意味着需要四个参数（三个独立的参数）来描述可标记成分的分数。另一个参数是总乙酰辅酶A池的分数，即13需要C-2来描述13脂肪酰基链中的C-2单元需要，如通过等式（1）.

脂肪酰基分布使用等式（1）作为的函数13乙酰辅酶A池的C-2部分。p的估算我如结果部分所述确定。使用Kaleidiagraph（Synergy Software，Reading，PA）进行非线性回归数据拟合和统计分析。

3.结果和讨论

我们使用高分辨率NMR和FT-ICR-MS来分配GPL，并确定其在13来自源分子的C[U-13C] -葡萄糖。这些数据反过来用于建模示例GPL中同位素的分数分布。

3.1 LCC2提取物的核磁共振分析

1D NMR显示，存在的主要GPL物种是磷脂酰胆碱，根据5.35 ppm（双键）和5.25 ppm（甘油C2H）共振的相对面积评估，每个甘油部分平均有两个双键(图2A、C). 一维HSQC和一维质子核磁共振谱中胆碱甲基共振的相对强度(图1)，表明胆碱头组13哺乳动物细胞中预期的C标记[53,54]. 相反，在细胞暴露于[U-13C] -葡萄糖。用[U标记24小时后提取的GPL的2D TOCSY光谱中的交叉峰簇进行积分-13C] -葡萄糖（cf图2B)，的13如前所述，测定了选定原子的碳富集[38,40]. 对于PC的甘油部分，我们估计13C分数为44±1.2%U-13C（因此为56±1%未标记甘油）。因此，在24小时内，近50%的GPL是新合成的。这与质谱法估计的结果接近，是GPL有三种方法的主要手段13C原子（见下文）。TOCSY光谱中的脂肪酰基链也显示出广泛的13C标签。尽管散装CH2酰基链的共振在很大程度上是简并的，可以从脂肪酸的w甲基和C2、C3、C4位置以及不饱和碳中分离出单独的信号（尽管在这些光谱中没有确定准确的位置）。代表新合成链的脂肪酸C2、C3和C4的特定标记模式与来自一组13C2+12乙酸C2（参见图A2，补充材料)，平均13C掺入46±4%。

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LCC2细胞甲醇提取物的高分辨率核磁共振谱

从10 mM[U存在下生长的LCC2细胞中提取甘油磷脂-13C] -葡萄糖24小时，如文中所述。如方法所述，在800 MHz、20°C下记录核磁共振谱。

A、 B.用1D 1H NMR谱记录50 ms混合时间的TOCSY谱。TOCSY光谱在18.8 T 293 K温度下记录，在B温度下混合时间为50 ms1场强为9 kHz。数据通过一个线性预测和t中的零填充进行处理1并在两个维度中使用非移位高斯函数进行切趾。

C.1D核磁共振波谱

顶部：1D13C编辑1H（HSQC）光谱

底部：高分辨率1核磁共振波谱

3.2 FT-ICR-MS中的质量和强度精度

正如预期的那样，实际GPL光谱的质量精度和分辨率始终超过Thermo LTQ-FT仪器的调谐和校准规范。目前，对质量同位素的分析要求同位素峰的强度既准确又精确，并且前体代谢物池具有预期的同位素分布。

我们已确定质谱强度精度如下。首先，通过直接输注FT-MS将四种正宗PC标准（见方法）作为混合物进行分析，并将前四种标准的强度13重复测量碳同位素。强度归一化为m的总强度0+对四种标准中的每一种进行了重复性和准确性比较。m的变异系数重复性为0.33%0峰值，m为1.8%0+2.通过将观察到的组分与为1.107%的自然丰度计算的组分进行比较来评估准确性13C、 使用等式（1）.m的均方根误差0+3为0.0097±0.004，即平均误差约为1%。

其次，在0 h处理时对对照LCC2样品执行相同的程序（自然丰度，参见。图3). 对于此示例13碳同位素分布可以根据等式（1），其中n=42。观察到显著强度达到m0+3，相当于总量的0.6%。观测强度与计算自然丰度值的均方根误差为0.0039，表明分析精度为0.4%。正如预期的那样，误差随着强度的降低而增加。实际上，这意味着在这些常规灵敏度条件下，强度比的有效动态范围约为100:1，最大峰值通常为10 pmole/μL，8分钟的采集速度约为350 nL/min。我们注意到，这种能力是通过FT-ICR的高分辨率实现的，因为每个峰几乎总是没有因m/z非常接近的离子而产生的强度畸变，例如由于其他自然丰度元素而产生的同位素2H、，15N、 以及18O、 以及其他结构及其同位素。

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LCC2细胞甲醇提取物的高分辨FT-ICR质谱

A.使用[U标记24小时后LCC2甲醇提取物的FT-ICR-MS剖面光谱-13C] -葡萄糖。图中显示了m/z区域从760到782的特写。高分辨率（测量质量>100000）下的准确质量（优于1 ppm）可以分配GPL及其同位素。根据内部标准利血平进行外部校准和二次校准的质量和强度已任意缩放至100单位（m）0m/z=760.5860。

B.将PC 34:1的质量分布归一化为总强度随时间的函数。0h时的分布与预期的自然丰度强度无法区分。这里使用线形图只是为了清楚起见；数据点之间没有隐含值

C.选定质量峰值的时间进程。■ 米0，□米0+3，●∑（m0+2n）；❍ ∑（米0+3+2n）。m0+3个强度拟合到a（1−exp（−kt）），a=0.11±0.008，k=0.19±0.04 h−1

3.3 LCC2提取物的FT-ICR-MS分析

尽管核磁共振谱提供了位置同位素分布，但单个GPL物种没有被解析。因此，仅确定了混合物中所有重要PC物种的总体平均富集度。相比之下，高分辨率FT-ICR-MS可分辨单个GPL物种及其13C同位素，但不是位置同位素。

与GPL标准一样，粗提取物的FT-ICR-MS质量精度和分辨率始终超过调谐和校准规范。图3A显示了在[U-13C] -葡萄糖24小时。该质量范围包括与PC（34:1）相对应的精确质量。m0峰值为m/z=760.5860；其余的山峰属于13GPL的C同位素，如表所示表A1（支持信息）对于每个时间点，将每个各向同性的强度归一化为各向同性的总强度。所得分数以图3B在t=0时，PC的光谱（34:1）对应于天然碳丰度（见上文），但随着培养时间的增加，峰值出现在m0+3和m的广泛分布0+2n（均匀质量）和m0+出现3+2n（奇数质量）同位素峰。显然，随着时间的增加，m的分数0同位素减少，而m0+3分数和m的分布0+2n+米0+3+2n同位素增加，表明新加入了13C来自葡萄糖。奇数同位素（m0+3和m0+3+2n）对应于13含有未标记和标记脂肪酸（FA）的C3甘油，而偶数同位素代表了未标记甘油与13C标记的FA。其他GPL物种也观察到类似结果（cf图A1，补充材料).

当n=10–20时，峰的强度随时间增加，但从6到24小时，仅略微向更高质量转移。如果FA链完全由13C2乙酰辅酶A，不仅强度会增加，而且质量数也会增加，因为最终所有新链都会接近100%13C（参见。补充材料). 由于情况显然并非如此，因此必须有12乙酸C2持续24小时。事实上，24小时分布的最大值出现在n=15、17和19。这对应于12–1613C原子，总共34个，因此13乙酰辅酶A的C在24小时时应约为30–50%。

由于根据NMR在甘油部分中的标记程度为44%（见上文），预计这些质量峰的强度大致相等。在考虑了天然丰度强度后，并使用方法中给出的关系式，我们计算出在24小时时，35±2%的GPL未标记，11±1%仅在甘油部分标记（m0+3） 35%标记在甘油部分和脂肪酸中，其余（约19%）标记在脂肪酸中而不是甘油中。这使得标记的甘油部分等于46%，接近核磁共振估计值（见上文）。类似地，脂肪酰基部分标记为约44%

这在中显示得更清楚图3C，其中，这四组的分数强度，经自然丰度校正后，绘制为标记时间的函数。m的分数强度0峰值随滞后而下降。在此期间，细胞正在分裂（加倍时间<24小时），因此这在一定程度上代表了随着合成新的GPL以制造新膜，预先存在的GPL的部分减少。m处的峰值0+3代表在所有三个碳上标记甘油部分的PC，如NMR（见上文）所示，其中脂肪酰基部分未标记。该峰值在6小时内接近约11%的稳态值，半衰期为3.6小时，表明从头开始在此期间确实发生了GPL的生物合成，但利用了预先存在的未标记脂肪酸的储存（例如来自内部甘油三酯储存）或脂肪酸的生物合成发生在由葡萄糖以外的来源补充的未标记乙酰辅酶a池中。然而，如下图所示，乙酰辅酶A库接近35%13C2.作为从天然丰度合成PC（34:1）的概率13C乙酰辅酶A库极低，约为4×10−7与24小时后观察到的11%相比，这意味着该池与完整脂肪酸的再循环有关，而不是与脂肪酸合成有关。

含有标记甘油+标记FA和未标记甘油+标签FA的GPL的分数分别通过求和所有偶数质量数（n≥2）和所有奇数质量数的自然丰度-校正强度来计算。如所示图2C，这些分数随滞后时间的增加而增加，与m的观测值相当0奇数峰和偶数峰的稳态分数分别接近34%和20%。

3.4模型仿真

NMR和FT-ICR-MS数据支持GPL的最小模型13C同位素剖面如图4.[U-13C] -葡萄糖13在这些实验中，C生成标记的甘油-3-磷酸和乙酰辅酶A。未标记的磷酸甘油也部分是由GPL和内部甘油三酯储存的周转产生的，这些储存也会产生游离脂肪酸，这些游离脂肪酸可以重新结合到GPL中或被氧化为未标记的乙酰辅酶A。如核磁共振数据所示，未标记和标记的甘油部分都随机并入GPL，乙酰辅酶A也是如此。模型计算表明，未标记GPL的比例从0时的100%下降到24小时的35%13C3-没食子酸和未标记的酰基链在24小时时增加到11%，而含有未标记甘油的GPL+13C-标记的酰基链或13C-标记甘油+13C-标记的酰基链分别达到20%和35%（参见。图3C和补充材料). 给定时间点的所有分数之和接近1。

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甘油磷脂酰胆碱生物合成模型

仅显示了可从葡萄糖中生物合成标记的碳原子（胆碱头部基团未标记，见正文）。Glc=葡萄糖，Gly=甘油。

实心圆表示13C和开放圆12C.甘油和乙酰碳源于[U-13C] -葡萄糖或未标记来源。脂肪酸是由标记和未标记的乙酰辅酶A随机生成的。丁酸（如图所示）有4种可能的同位素。这些可以与未标记（天然13C丰度）甘油，或标记甘油。从4个脂肪酰基同位素中，与每个甘油部分缩合生成16个可能的二酰基GPL分子，有两种方法可以使两条链都未标记，两种方法都完全标记（813C） 有两种方式13C、 四分之四13C.对于两种形式的甘油，这些可能性同样存在，导致包含m的两个峰0，米0+2，米0+4，米0+8和m0+3米0+5米0+7和m0+11.总量的一部分也将对应于尚未移交的先前存在的GPL（即仅自然丰度13C） ●●●●。仅显示了四种具有代表性的二丁基GPL同位素（共32种）。

最佳确定参数为p1和p2这主要受到强度比测定的分析误差的限制（即这些强峰的误差为0.5–1%，见上文）。其他误差包括光谱重叠和相对较低的质量峰强度。总的来说，误差似乎小于5-10%，参数估计值与甘油主链标记的独立核磁共振数据吻合良好（见上文）。

剩下的未知是13脂肪酰基链中的C。如上所述，最简单的可能模型是存在一个乙酰辅酶a单池，在足够长的时间内接近同位素稳定状态，乙酰辅酶a单元随机并入新合成的酰基链。乙酰辅酶A池和GPL中的预期分布在补充材料.模拟使用等式（1）作为分数的函数13C2-乙酰辅酶A表明，在24小时时，该总量约为总量的35-40%，与从最大值位置获得的粗略估计一致(图3A). 使用此值和p的值1-第页4如附录1所示，我们使用C16和C18链的随机合并来模拟PC（34:1）的分布。这与观察到的分布进行了比较图5.

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模拟同位素极化24小时分布

术后24小时的同位素分布13C葡萄糖标记使用等式（2）以及文中给出的p的适当值。脂肪酰基链的同位素利用等式1如文中所述，乙酰辅酶a池为35%13C2醋酸盐。

（●）观察到的模拟分布。

计算的分布的一般形状与实验分数一致，尽管存在一些定量差异，部分反映了上述测量误差以及简单模型中的缺陷。例如，假设乙酰辅酶A单元没有出现干扰（即13根据核磁共振数据，前一条件未完全满足，这表明存在135%水平的C1乙酰基单位。

更详细的模型和生物学解释将在其他地方介绍。

4.结论

我们已经表明，即使在短时间内采集<9分钟的低pmol/μL GPL浓度，FT-ICR-MS也能提供足够的分辨率和高质量的强度数据，用于测定13复杂混合物中单个GPL物种的C同位素分布，由[U-13C] -葡萄糖作为前体。这产生了m0+3甘油和m0+2醋酸盐，因此在质量同位素分布中可以区分。

当结合来自高分辨率核磁共振数据的位置同位素标记信息时，可以确定用于合成特定GPL物种的代谢物贡献池的分数。FT-ICR-MS的关键方面是将直接注入与高质量分辨率相结合，从而消除类似m/z离子的污染，快速分配的高质量精度，以及显示高精度和高精度同位素丰度的强度。

PC（34:1）的选定同位素的分数分布的时间过程建模显示，当从葡萄糖合成甘油部分时，新合成的酰基链的结合滞后，而从葡萄糖合成的甘油部分在6小时内达到稳定状态（cf图3C). 模型分析还表明，在长达24小时的标记时间内，存在未标记的甘油和乙酰辅酶A库（可能来自先前存在的GPL库）。此外，将标记和未标记的甘油和乙酰辅酶A并入PC16，18基本上是随机的。因此，这些数据为分析使用葡萄糖碳合成GPL提供了基础，并提供了净增长条件下GPL周转的信息。

我们已经说明了正离子模式下特定甘油磷脂酰胆碱的原理。显然，这适用于任何PC，也适用于其他正离子或负离子模式的GPL，包括PE、PS和鞘磷脂，但前提是，如果其头部组也进行了代谢标记，则需要进行额外分析。PC（34:1）是这些样品中最丰富的GPL。然而，在这些样品中观察到具有不同链长的其他GPL物种的可比同位素分布(图A1，补充材料)事实上，在其他乳腺细胞系中（A.N.Lane、T.W-M.Fan和R.M.Higashi，未发表的数据）。

同样的方法也可以很容易地应用于研究其他重要代谢物的合成和周转，例如使用标记葡萄糖或其他标记前体的核苷酸。

补充材料

01

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致谢

这项工作部分得到了国家科学基金会EPSCoR拨款#EPS-0447479、国家研究资源中心NIH拨款编号P20RR018733、国家癌症研究所1R01CA118434-01A2、肯塔基州卓越挑战、苏珊·科门基金会BCTR0503648和布朗基金会的支持。

缩写

BHT公司
丁基羟基甲苯
DMPC公司
二糖基磷脂酰胆碱
DPPC公司
二棕榈酰磷脂酰胆碱
DSPC公司
二硬脂酰磷脂酰胆碱
DOPC公司
二油酸磷脂酰胆碱
全球定位系统
甘油磷脂
个人计算机
磷脂酰胆碱

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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