胃肠病学。作者手稿;PMC 2010年10月1日提供。
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美国国立卫生研究院:NIHMS130141号
Hedgehog介导的非酒精性脂肪肝上皮-间充质转化和纤维化修复
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Wing-Kin同步
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容美美(Youngmi Jung)
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阿莱西亚·奥梅内蒂
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哈维尔·范塞尔斯
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G卡拉卡
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安娜·梅·迪尔
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4美国北卡罗来纳州达勒姆市达勒姆退伍军人事务医疗中心医学部消化科
通讯作者:Anna Mae Diehl,医学博士,Florence McAlister教授兼主任,杜克大学消化科,Snyderman Bldg.,Suite 1073,595 LaSalle Street,Durham,NC 27710,电话:919-684-4173或919-684-2616,传真:919-694-4183,400lheid处的ude.ekud.cm *WK Syn和Y Jung对这项工作做出了同样的贡献。
- 补充资料
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摘要
背景和目标
修复反应决定了肝病的最终结果。本研究评估了以下假设:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的纤维化修复是通过Hedgehog(Hh)通路激活和导管型祖细胞上皮-间充质转化(EMT)诱导介导的。
方法
在Hh抑制剂环胺存在或不存在的情况下,将未成熟导管细胞暴露于声波刺猬(Shh)中,以确定Hh途径的激活是否直接调节肝祖细胞的EMT。使用喂食甲硫氨酸胆碱缺乏+蛋氨酸(MCDE)饮食(含或不含环胺)的小鼠来评估祖细胞EMT的潜在生物学相关性。还比较了野生型(WT)和Patched单倍体不足(Ptc+/-)小鼠在饮食诱导的NAFLD期间Hh信号增强对EMT和纤维生成修复的影响。最后,在NAFLD患者的肝脏切片中检测Hh途径激活和EMT的证据。
结果
在培养的祖细胞中,声波刺猬抑制了上皮基因和EMT抑制剂的表达,但诱导了肌成纤维细胞表达的基因。环磷酰胺逆转了这些作用。在小鼠NAFLD模型中,Hh途径激活、EMT、肌纤维母细胞数量增加和肝纤维化发生。环磷酰胺抑制Hh通路的激活和EMT的诱导。与WT小鼠相比,具有过活性Hh途径的Ptc+/-小鼠表现出持续的Hh靶基因过诱导,EMT、肌成纤维细胞积聚和纤维化更多。NAFLD患者中,表达EMT标记物的Shh产生细胞和Hh反应性导管细胞数量与肝纤维化平行增加。
结论
Hh介导的导管细胞EMT参与了NAFLD肝硬化的发病机制。
关键词:上皮-间质转化、纤维化、刺猬、非酒精性脂肪性肝炎
介绍
成人肝脏具有巨大的再生能力。急性毒性损伤后,死亡的肝细胞通常在几天内被替换,肝脏结构和功能在几周内完全恢复1然而,慢性肝损伤的恢复往往更加多变。有时再生与肝细胞死亡保持同步,尽管存在持续的损伤,但仍能保持肝脏结构和功能。其他时候,肝细胞的死亡速度超过了修复能力,死亡细胞积聚。后一种情况通常伴随着健康成人肝脏中罕见的各种类型细胞的肝脏堆积,包括肝祖细胞和肌成纤维细胞,以及过量胶原基质的沉积1,2这一过程始于海岭运河附近,海岭运河沿门管区边缘容纳导管型祖细胞。在注定要发展为肝硬化的患者中,纤维间隔含有大量未成熟导管细胞和成纤维细胞,延伸至小叶,最终形成桥,将实质岛分隔开来2,三.
慢性肝损伤后纤维导管反应的细胞组成和迁移特征提示,这一过程可能涉及未成熟导管细胞的上皮-间充质转化(EMT),从而提供了一种机制,将这些祖细胞移出正常的生态位,进入肝实质,以替代死亡的肝细胞。我们进一步推断,这种修复过程可能受Hedgehog(Hh)通路的调控,因为最近有证据表明肌成纤维细胞和导管型祖细胞之间的旁分泌Hh信号传导促进未成熟导管细胞的EMT4为了评估这些假设,我们研究了Sonic hedgehog(Shh)配体对导管型祖细胞培养的直接影响,检查了非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型中Hh途径激活的后果,以及与NAFLD患者肝损伤和纤维化严重程度相关的Hh途径活性水平。NAFLD是人类最常见的慢性肝病之一,因此被选中进行详细审查5已经有强有力的证据表明肝细胞凋亡增加6,7以及由此产生的纤维导管反应三在这种疾病的肝硬化演变中起着重要作用,但调节后一过程的基本机制尚不清楚。
材料和方法
动物
C57BL/6补丁缺陷型(Ptc+/-)小鼠取自P.A.Beachy(马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学),野生型小鼠取自Jackson实验室(马里兰州Bar Harbor)。Ptc公司+/-小鼠只有一个补丁,一种Hh通路阻遏物。因此,这些小鼠无法沉默Hh信号并表现出过度的Hh通路活性。WT和Ptc+/-给小鼠喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食(n=4/组),诱导非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝纤维化,或给对照组(n=4/组)喂食4周。然后处死所有小鼠以获取血清和肝脏样本。
为了评估饮食诱导的NASH期间祖细胞依赖性肝再生,给小鼠(n=4)喂食补充0.15%乙硫氨酸(MCDE)的蛋氨酸胆碱缺乏饮食8在喂食MCDE饮食1周或3周后处死小鼠(n=4/组),并将结果与喂食食物的对照组(n=4)进行比较。另一组小鼠(n=4)喂食MCDE 3周,然后再恢复正常饮食3周,以使肝脏恢复,然后处死。
为了确定Hh途径的抑制是否会改变结果,额外的小鼠(n=12)被喂食对照周(n=4只小鼠)或MCDE饮食(n=8只小鼠),腹腔注射或不注射环胺,持续1周(n=4/组)。根据一项既定的研究,Hh信号抑制剂环磷酰胺(加拿大多伦多研究化学品公司)以0.6mg/mouse/day(1ml体积)的剂量给药体内协议9,10.在开始MCDE-diet前24小时首次注射环胺。
人体研究
来自杜克大学病理学系生物化学证实的非酒精性脂肪肝(NAFL)(n=5)、非酒精性肝炎(NASH)(n=5)和NASH相关性肝硬化(n=6)患者的福尔马林固定石蜡包埋肝切片。还从患有非NAFLD疾病(酒精性肝病、ALD和原发性胆汁性肝硬化,PBC)的受试者身上获取了肝脏切片,以评估是否会在各种肝病中发现类似的蛋白质表达模式。对照肝组织取自杜克大学医学院组织库共享资源,并按照美国国立卫生研究院和人体研究机构指南进行研究。
组织病理学分析
用H&E对连续切片进行染色。使用Brunt等人描述的标准评估NAFLD的严重程度11. (补充材料和方法).
免疫组织化学
如前所述,制备福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏进行免疫组化12,13。详细的方案和使用的抗体列于补充材料和方法.
分子技术
使用既定方案进行实时RT-PCR和Western-immunoblot14; 中的详细信息补充材料和方法 补充表1.
细胞培养实验
如前所述,将永生化但未转化的小鼠未成熟胆管细胞系(603B)保存在标准培养基中的6孔细胞培养簇(Costar 3516,Corning Incorporated)中4,15,16为了评估外源性Sonic Hedgehog对胆管细胞的影响,将603B细胞血清饥饿过夜,然后用重组Sonic Hedgehog(0、100、1000 ng/ml)(加拿大StemCell Tech Inc)再处理24小时。在单独的实验中,将603B细胞培养在含有Shh的培养基(100 ng/ml)中,并用Hh信号抑制剂环胺(加拿大多伦多研究化学品公司)处理,浓度为3uM17,18或tomatidine 3uM(加州圣地亚哥Calbiochem),一种对环胺无催化活性的类似物,持续24小时。所有实验重复进行。采集总RNA和蛋白质,分别用QRTPCR和免疫印迹法进行分析。
为了验证在603B细胞中观察到的变化,使用正常大鼠胆管细胞系(NRC)重复了一些实验19.
统计分析
将各组与基线(对照组或载体)或各治疗组之间进行比较。结果表示为平均值±S.E.M(除非另有说明);在SAS 9.1中使用PROC GLM,使用Student t检验或ANOVA(用于多组比较)进行分析。使用最小二乘法确定成对比较的显著性。P值通过Tukey的多重比较程序进行调整;显著性在5%水平上被接受。*p<0.05;**p<0.005
结果
外源性声波刺猬(Shh)促进肝祖细胞EMT
为了检测Hh途径激活对祖细胞EMT的直接影响,用N-末端Shh配体(0-1000 ng/ml)处理未成熟导管细胞(603B细胞),并用QRT-PCR分析RNA(). 通过用Shh(100 ng/ml)和或不使用环胺3uM(一种特定的Hh途径拮抗剂)或托马提丁3uM处理细胞(一种非活性的环胺类似物)重复实验,获得细胞RNA和蛋白质进行分析( 和 补充图1). 正如预期的那样,Shh增加了Hh靶基因gli1的表达。肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达20,也被诱导。这种间充质标志物的上调伴随着EMT抑制剂骨形态发生蛋白(bmp)7的下调21,22,及其介体分化抑制因子(id)223以及上皮基因的伴随抑制,如角蛋白(k)-7和e-cadherin.Shh处理对这些因子的蛋白和mRNA表达的影响不受托马替丁的影响,但在很大程度上被环胺逆转( 和 补充图1),证明这些变化是由肝上皮祖细胞中Hh信号的特异性激活引起的。
Shh配体诱导肝细胞Hh靶基因和EMT相关基因在标准培养条件下保持未成熟的小鼠导管型祖细胞(603B)。添加重组Sonic hedgehog(Shh)蛋白(0,100,1000 ng/ml)24小时;采集细胞,通过QRT-PCR分析评估基因表达的变化。(a) gli1、α-sma、bmp7、分化抑制因子(id)2、角蛋白-7和e-cadherin。结果表示为相对于载体处理的对照培养物的折叠变化。绘制了重复实验的平均值±SEM。为了确定Shh的作用是否可直接归因于Hh信号传导,将603B细胞在Shh(100 ng/ml)和3uM环胺(一种特异性刺猬-对峙拮抗剂)或3uM托马替丁(一种非活性环胺类似物)存在下培养24小时;蛋白质由Western-blot采集并分析。(b) 这些研究的定量数据如所示补充图1.*P<0.05或**P<0.005 vs 0 ng/ml Shh
为了排除观察到的EMT变化具有603B特异性的可能性,使用具有成熟胆管细胞表型的特性良好的NRC系重复实验19NRC细胞对603B细胞的反应类似。Shh激活了Hh途径并诱导了EMT典型的基因表达变化(数据未显示)。与对这些反应无影响的托马替丁相比,环胺降低了Shh处理细胞中gli1和αsma的表达,同时增加了上皮基因的表达(补充图2).
脂肪肝损伤的前体依赖性修复与EMT证据相关
为了评估祖细胞EMT的潜在生物学相关性,小鼠被喂食补充了乙硫氨酸(MCDE)的MCD饮食。MCD饮食诱发啮齿动物非酒精性脂肪性肝炎(NASH)24添加乙硫氨酸会加重这种肝损伤,同时抑制存活的成熟肝细胞的复制25-27因此,MCDE饮食模型已被用于研究祖细胞对受损肝脏的再生1,26,28肝祖细胞,包括随着NASH进展而积累的导管型细胞,8拥有Hh信令所需的蜂窝设备14,17,29然而,目前尚不清楚Hh信号是否调节脂肪肝损伤的祖细胞介导修复,或者是否在此过程中发生EMT。
为了开始解决这些问题,在短暂喂食对照食物或MCDE饮食的小鼠中评估了Hh途径激活和各种EMT相关基因表达的变化。在饮食控制一周后处死小鼠,获取肝脏RNA进行分析(). MCDE饮食治疗一周后,mpk的肝脏表达增加,mpk是肝上皮祖细胞的一个成熟标记物30Hh靶基因gli2以及促纤维化细胞因子TGFβ的mRNA水平也显著增加。Hh途径的激活和TGFβ的积累都被证明可以刺激EMT4,12,31-33与这些报告一致,我们发现MCDE饮食治疗增加了s100A4的肝脏mRNA含量,来源于上皮细胞的成纤维细胞标记物34,35以及波形蛋白,同时强烈下调EMT抑制剂bmp 7的表达.这些数据表明,在祖细胞依赖性肝再生过程中,Hh途径很早就被激活,并表明这一过程伴随着EMT。
用MCDE饮食快速诱导小鼠EMT相关基因诱导祖细胞依赖性肝再生C57BL/6小鼠被喂食对照饮食或MCD饮食+0.1%乙硫氨酸(饮用水中)1周(MCDE饮食;n=4/组)。在治疗期结束时,通过QRT-PCR检测总RNA。(a) mpk、(b)gli2、(c)tgfβ、(d)s100A4、(e)波形蛋白和(f)bmp7。结果表示为相对于饲料对照组的折叠变化。绘制平均值±SEM。*与对照组相比,P<0.05或**P<0.005
如果作为修复过程的一部分而经历EMT的上皮细胞恢复为上皮表型以填补死细胞留下的空白,这将是合乎逻辑的。为了确定肝损伤停止后是否发生EMT逆转(即间充质细胞向上皮细胞转化,MET),额外的小鼠被喂食MCDE饮食3周,或喂食3周,然后再改为正常饮食3周。s100A4和波形蛋白的表达在第1周后达到峰值,但在MCDE饮食的第3周下降(补充图3). 相反,上皮基因mpk和k7的诱导滞后于间充质基因的早期增加,在MCDE饮食的第三周达到峰值,因为间充质的基因表达下降。当小鼠从MCDE饮食中移除时,所有这些标记物最终恢复到基础水平。因此,总的来说,数据支持在脂肪肝损伤和祖细胞介导的肝再生模型中,EMT之后是MET的概念。
Hedgehog(Hh)通路、EMT和肝纤维化的激活在饮食诱导的NASH中发生,在Ptc中被夸大+/-老鼠
为了更直接地评估Hh-介导的EMT在纤维生成修复中的作用,Patched deficient(Ptc+/-)将小鼠及其野生型同胞对照组(WT)维持在对照组(n=4/组)或MCD饮食(n=4:组)4周。慢性接触MCD饮食可导致WT和Ptc的类似肝损伤+/-小鼠,类似组织学证明(补充图4a)以及组织学分级和血清AST(补充表2). 在任何一组chowfed小鼠中几乎没有检测到声波刺猬(shh)的肝脏mRNA表达,但在食用MCD饮食期间,WT和Ptc+/-小鼠的肝脏mRNA表达均显著增加(即至少4倍)(与相应的chowfed对照组相比,p<0.05)。Hh靶基因gli2在WT小鼠中的表达增加了约3倍,在Ptc中增加了4倍+/-老鼠(). 与gli2 mRNA水平类似,Ptc患者肝脏中表达gli2蛋白的导管细胞和肝细胞数量也较多+/-老鼠( 和 补充图4b). 另一种Hh-调节转录因子gli1的诱导也发生了,但不太稳定(补充图4c). 然而,Ptc+/-小鼠往往比WT小鼠表现出更大的gli1诱导,这与Ptc的单倍性不足损害Hh信号的正常沉默的事实一致。WT和Ptc+/-小鼠对饮食诱导的NASH表现出成纤维反应,胶原蛋白1α1基因表达增加了4-8倍(). 肝羟脯氨酸含量(),也显著高于比较处理的WT对照组(). 这些发现表明,在慢性NASH模型中,Hh信号增强增强了肝纤维化修复。
Ptc饮食诱导的NASH过程中Hh靶基因诱导增加和肝纤维化+/-Hh通路过度活跃的小鼠私人投资公司+/-给小鼠和野生型对照窝鼠(WT)喂食常规食物或蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)食物4周。在治疗期结束时,处死小鼠(n=4/组)。(a) gli2 mRNA的QRT-PCR分析;(b) WT和Ptc中Gli-2阳性导管细胞(白色条)和Gli2阳性肝细胞(实心条)的积聚+/-组。结果表示为相对于各饲料对照组的折叠变化,并绘制了平均值±SEM图;喂食WT(c)和Ptc的典型MCD饮食中Gli2的(c-d)免疫组织化学+/-(d) 小鼠-每个显微照片中的小插页在相应的饮食对照组中显示Gli2染色;(e) 治疗结束时胶原mRNA水平和(f)肝羟脯氨酸含量。结果表示为相对于相应的饲料对照组的折叠变化。绘制平均值±SEM。*与WT组相比,P<0.05或**P<0.005
为了评估EMT在这一过程中的作用,我们评估了EMT相关基因的差异(). 与WT控件相比,Ptc+/-小鼠对转化生长因子β(tgfβ)、α-sma、基质金属蛋白酶9(mmp9)的诱导作用更强,金属蛋白酶组织抑制剂-1(timp1),慢性肝损伤时bmp7和k-7的抑制作用更强。因此,在NASH的这个模型中,Ptc+/-与野生型对照相比,小鼠表现出更多的各种间充质基因的上调和更多的上皮基因的下调。鉴于BMP7是EMT的有效抑制剂21,22有证据表明,腺病毒介导的BMP7在受损肝脏中的过度表达抑制了肝纤维化36MCD饮食暴露引起的基因表达变化模式表明,饮食诱导的慢性NASH可引起EMT和肝纤维化。此外,因为Ptc的两种反应都更大+/-与WT对照组相比,Hh信号在该动物模型中被确定为纤维生成修复的重要调节因子。
Ptc饮食诱导NASH期间EMT相关基因表达的增强变化+/-老鼠进行QRT-PCR分析,以评估图例至(a) tgfβ,(b)α-sma,(c)mmp9,(d)timp1,(e)bmp7,(f)角蛋白-7。结果表示为相对于各个喂食对照组的折叠变化,并以平均值±SEM表示。*P<0.05 vs WT组
抑制Hh信号减弱体内EMT相关的纤维生成
由于NAFLD的两个小鼠模型均表明肝祖细胞中Hh途径的激活可调节EMT相关的纤维化形成,因此我们研究抑制Hh途径是否会逆转这些效应。使用之前制定的方案,在有或无环胺(0.6mg/只小鼠每天;i.p.)的情况下,给WT小鼠喂食正常的食物或MCDE饮食(n=4/组)1周9,10环磷酰胺抑制Hh靶基因gli2的MCDE-diet相关诱导()以及促成纤维细胞因子tgf-β(). Hh和TGF-β均调节EMT4,12,31-33相反,环胺使EMT抑制剂bmp7的表达有所增加(). 经环磷酰胺治疗的MCDE饮食喂养小鼠也表现出间充质基因波形蛋白的低表达()并且对上皮祖细胞标记物mpk的诱导较少(). 环胺的费用及其毒性使我们无法对其在健康小鼠中的作用进行更长期的研究。然而,这项短期研究的结果支持了Hh途径激活在脂肪肝损伤期间的纤维化修复中发挥作用的概念。
抑制Hh信号减弱体内EMT相关的纤维生成WT小鼠在正常饮食(n=4)或MCDE饮食(n=8)中添加或不添加环胺(n=4/组;每只小鼠每天0.6mg;i.p.),喂养1周。治疗结束时,采集肝脏总RNA进行QRT-PCR(a)gli2,(b)tgf-β,(c)bmp7,(d)vimentin,(e)mpk。结果表示为相对于各饮食对照组的折叠变化,并以平均值±SEM表示。*与对照组或MCDE组相比P<0.05**与对照组相比P<0.005
NAFLD患者Hh通路激活和EMT的证据
因为在培养的肝祖细胞和NAFLD小鼠模型中的数据表明,肝祖细胞中Hh途径的激活调节了参与纤维生成修复的上皮细胞到间充质细胞的转变,接下来,我们检查了人类肝脏样本,以确定在NAFLD患者的肝脏重塑过程中是否发生了类似的反应。对16名具有良好特征的NAFL(n=5)、NASH(n=5)和NASH相关肝硬化(n=6)患者的编码肝脏切片进行染色,以证明Shh(),胶质2()和S100A4()然后由盲眼观察者和/或计算机辅助形态计量学进行分析.Shh、Gli2和S100A4在NAFL患者中的表达最低,在肝硬化患者中表达最高,NASH患者中这三种蛋白的表达处于中间水平。因此,随着肝脏疾病的进展,Hh配体的积累以及Hh靶基因和EMT标记的表达稳步增加,因此肝硬化NAFLD患者的肝脏中Shh和Gli2表达细胞增加了约3倍(),和至少6倍以上的S100A4(+)细胞()而不是单纯脂肪变性患者的肝脏。典型肝硬化的低倍显微照片显示,S100A4表达细胞倾向于沿着肝实质结节周围延伸的纤维导管间隔定位().
NAFLD患者的Hedgehog通路激活对16例特征明确的NAFL患者(n=5)、NASH患者(n=2)和NASH相关性肝硬化患者(n/6)的编码肝切片进行Hh-配体、Shh和Hh-靶基因Gli2染色。用计算机辅助形态计量学分析Shh染色。显微照片来自(a)NASH(NAFL中的小插入显示Shh染色)和(b)NASH相关肝硬化的代表性患者。(c) 所有患者Shh的定量分析。Shh的量表示为每高倍视野中染色细胞的百分比(放大倍数X400)。由盲法观察者在肝脏切片的10个高倍视野/切片中测定Gli2染色细胞的数量。(d)NASH中的Gli2染色(NAFL中的小插条显示Gli2着色)和(e)NASH相关肝硬化。(f) 对所有患者的Gli2进行定量分析。数据以Gli2细胞/高倍视野(放大倍数X400)的平均数±数量绘制*P<0.05或**P<0.005 vs NAFL
NAFL、NASH和NASH相关性肝硬化患者的EMT证据中所述患者的编码肝脏切片对图例进行S100A4染色,这是一种来源于上皮细胞的成纤维细胞标记物。计算机辅助形态计量学分析S100A4染色。显微照片来自(a)NAFL、(b)NASH和(c)NASH相关肝硬化(放大倍数X400)的代表性患者。(d) NAFLD相关性肝硬化代表性患者S100A4染色的低倍镜(放大倍数x100)。(e) 所有患者S100A4定量分析。S100A4的数量表示为每个高倍视野中染色细胞的百分比*与NAFL相比,P<0.05或**P<0.005。(f) NASH相关性肝硬化中具有代表性的Gli2(棕色)和Vimentin(蓝色)双重免疫染色。Small Insert显示人类健康肝脏中的Gli2和vimentin双重染色(放大x630)。
此前,我们发现导管细胞具有Hh反应性,并与EMT标记物S100A4共定位4在这里,我们证明了在人NAFLD中表达间充质标志物Vimentin的Gli2阳性导管细胞( 和 补充图5d)、ALD(补充图5b和5e)和PBC(补充图5c和5f). 总之,这些数据提供了进一步的证据,证明Hh诱导的EMT发生在各种人类肝脏疾病中,表明它是对慢性肝损伤的保守反应。
讨论
NASH患者的肝细胞损伤和死亡比单纯的脂肪变性患者更为广泛,这被认为可以解释为什么NASH患者更容易发展为肝硬化6,7然而,事实上,许多NASH患者并没有变为肝硬化37提示肝损伤反应的诱导间差异在确定NASH的最终结局方面也起着重要作用。本研究结果表明,在小鼠和人类中,Hh通路在脂肪肝损伤期间被激活,并且通路活性水平与纤维化阶段相关。这些发现表明,Hh信号调节的诱导间差异可能影响脂肪肝损伤的纤维化反应强度。有证据表明,在饮食诱导的NASH期间,小鼠Hh途径沉默的遗传损伤会导致过度肝纤维化,这支持了这一概念。此外,Hh信号转导可导致肝纤维化的机制已被确定,即上皮-间充质转化(EMT)。
EMT描述了上皮细胞分解细胞与细胞之间的附着物,使其与相邻细胞相连,并获得更多间充质表型,从而迁移到基质中,在基质中,上皮细胞可以更好地获得各种生长因子,并可以更自由地增殖31EMT通常发生在胎儿发育期间的生长组织中,也是成人侵袭性和转移性恶性细胞的特征。Hh-信号在发育过程中调节EMT32,38,以及在肿瘤转移期间33,38因此,胚胎发生和成人肿瘤发生期间的组织生长和重塑涉及Hh介导的EMT。
越来越多的证据表明,EMT是对纤维肝损伤(如胆管梗阻)的反应4和四氯化碳诱发的啮齿动物肝硬化39以及胆汁性肝硬化28和人类酒精性肝硬化40本研究表明,非酒精性脂肪性肝病也会发生EMT。接受EMT治疗的肝细胞不易发生凋亡39表明EMT是一种适应性反应,最终促进健康肝脏的重建/再生。这一概念得到了当前研究结果的支持,该研究表明Hh途径激活直接诱导导管型祖细胞的EMT在体外类似的过程也会发生体内在一个经典的啮齿动物祖细胞依赖性肝再生模型中。此外,对修复过程中不同时间点的肝脏RNA的分析表明,EMT典型的基因表达变化发生在肝损伤早期,然后随着上皮祖细胞标记物的上调而下降。当肝脏再生完成后,后者回归到基线。这些发现表明,受损肝脏中至少有一些成纤维细胞可能是移行上皮细胞,这些细胞被动员起来代替死亡的肝细胞。事实上,另一个研究小组已经报道,随着NAFLD发展为肝硬化,未成熟导管细胞和肝成纤维细胞的数量随着桥接性纤维化的发生而增加三目前的研究表明,这些纤维隔中充满了Hh反应细胞,其中许多细胞表达蛋白S100A4,这是一种前EMT因子,由来源于上皮细胞的成纤维细胞表达。因此,新的数据补充和扩展了其他证据,总体上表明,在NASH相关肝硬化的演变过程中,过度修复相关的EMT有助于纤维化的形成。
TGFβ是EMT最成熟的调节剂21,31它通过Smad依赖性激活蜗牛和Smad依赖诱导有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MEK)或PI3K通路来刺激41当用TGFβ处理时,胎儿肝细胞会经历EMT,增加波形蛋白和蜗牛的表达,同时抑制e-钙粘蛋白42TGFβ诱导的肝细胞EMT已在成年小鼠中得到证实43在饮食诱导的NASH中,我们观察到Ptc中TGFβ的表达增强+/-小鼠(具有激活的Hh信号传导)。此外,用环胺抑制Hh信号传导可降低TGFβ水平。这些发现表明,Hh相关的EMT可能至少部分依赖于TGFβ的诱导。初步研究支持这种可能性,因为TGFβ抑制剂显著降低Hh处理的3T3-NIH成纤维细胞中EMT相关基因的表达(数据未显示)。
NASH是隐源性肝硬化的主要病因44在特发性肺纤维化(通常被认为是隐源性肝硬化的肺等价物)患者中,大多数成纤维细胞来源于上皮细胞45因此,失调的EMT可能在成人器官纤维化的一般发病机制中发挥作用,因此阐明其相关机制非常重要。众所周知,受损成人组织中的应激和死亡细胞释放因子,通过触发存活细胞群的代偿性增殖来促进其替代。对果蝇的研究表明,正常休眠的多能祖细胞中Hh通路的瞬时激活对这一过程至关重要,因为当Hh信号被阻断时,急性损伤的组织无法修复46另一方面,在哺乳动物的几种慢性肝损伤期间,持续(而非短暂)Hh途径激活8,12,13我们的研究结果表明,这会使EMT和Hh反应细胞类型的增殖/积累永久化,导致肝脏结构扭曲、累积性纤维化,最终导致肝硬化。与这一概念一致,在可逆性胆道梗阻的啮齿动物中,Hh信号、EMT和纤维化在梗阻缓解后均逐渐消退47本研究表明,EMT的程度和肝纤维化的严重程度也取决于脂肪肝损伤中Hh途径活性的水平。这两个观察结果都提出了一种有趣的可能性,即纤维生成修复倾向的诱导间差异可能反映了启动/维持Hh信号传导的损伤相关因子的产生差异,以及Hh途径本身对这种调节的敏感性的内在变异性。需要进一步的研究来评估这一概念,并描述Hh-TGFβ相互作用的下游介质,但可能会导致肝硬化生物标志物的识别,以及新的治疗靶点,以防止这一并发症高危亚组患者发生肝硬化。
致谢
作者感谢黄佳文博士在动物护理方面的协助,以及卡尔·斯通先生在行政方面的努力。
作者还感谢PA Beachy博士(马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学)提供了Patched-deficient(Ptc)+/-)小鼠;G.J.Gores博士(明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所)和上野幸之(日本仙台东北大学)提供小鼠未成熟导管细胞系(603B);N.LaRusso(明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所)提供正常大鼠胆管细胞系(NRC)。
基金:
这项工作得到了AMD的RO1 DK077794和RO1 DK053792的支持。
缩写
NAFLD公司 | 非酒精性脂肪肝 |
小时 | 刺猬 |
电子病历 | 上皮-间充质转化 |
嘘 | 声波刺猬 |
K7公司 | 角蛋白7 |
α形状记忆合金 | α-平滑肌肌动蛋白 |
骨形态发生蛋白7 | 骨形态发生蛋白7 |
身份证件 | 分化抑制剂 |
MCD(E)饮食 | 蛋氨酸胆碱缺乏(乙硫氨酸)饮食 |
格利 | 胶质母细胞瘤 |
私人投资公司 | 已修补 |
转化生长因子β | 转化生长因子β |
基质金属蛋白酶9 | 金属蛋白酶9 |
TIMP1公司 | 金属蛋白酶组织抑制剂1 |
脚注
出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将进行编辑、排版和校对。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明都适用。
披露:
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工具书类
1Fausto N.肝脏再生和修复:肝细胞、祖细胞和干细胞。肝病学。2004;39:1477–1487.[公共医学][谷歌学者] 2Roskams T,Desmet V.导管反应及其诊断意义。精神病学诊断。1998;15:259–269.[公共医学][谷歌学者] 三。Richardson MM、Jonsson JR、Powell EE等。非酒精性脂肪性肝炎的进展性纤维化:与再生改变和导管反应的关系。胃肠病学。2007;133:80–90.[公共医学][谷歌学者] 4Omenetti A、Porrello A、Jung Y等。刺猬信号调节啮齿动物和人类胆道纤维化期间的上皮-间质转换。临床投资杂志。2008;118:3331–3342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Clark JM、Brancati FL、Diehl AM。非酒精性脂肪肝。胃肠病学。2002;122:1649–1657.[公共医学][谷歌学者] 6Feldstein AE、Canbay A、Angulo P等。肝细胞凋亡和fas表达是人类非酒精性脂肪性肝炎的显著特征。胃肠病学。2003;125:437–443.[公共医学][谷歌学者] 7Wieckowska A、Zein NN、Yerian LM等。肝细胞凋亡作为非酒精性脂肪性肝病疾病严重程度的新生物标志物的体内评估。肝病学。2006;44:27–33.[公共医学][谷歌学者] 8Fleig SV,Choi SS,Yang L等。Hedgehog反应性祖细胞的肝脏积聚随着小鼠脂肪肝损伤的严重程度而增加。实验室投资。2007;87:1227–1239.[公共医学][谷歌学者] 9.Berman DM、Karhadkar SS、Hallahan AR等。通过刺猬通路阻断抑制髓母细胞瘤生长。科学。2002;297:1559–1561.[公共医学][谷歌学者] 10Lipinski RJ、Hutson PR、Hannan PW等。刺猬信号拮抗剂环磷酰胺在小鼠体内的剂量和路径依赖性致畸性、毒性和药代动力学特征。毒物科学。2008;104:189–197.2008[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Brunt EM,Janney CG,Di Bisceglie AM等。非酒精性脂肪性肝炎:组织学病变分级和分期的建议。美国胃肠病杂志。1999;94:2467–2474.[公共医学][谷歌学者] 12Omenetti A,Yang L,Li YX,等。Hedgehog介导的间质-上皮相互作用调节肝对胆管结扎的反应。实验室投资。2007;87:499–514.[公共医学][谷歌学者] 13Jung Y,McCall SJ,Li YX,等。原发性胆汁性肝硬化中胆管和基质细胞表达刺猬配体和/或刺猬靶基因。肝病学。2007;45:1091–1096.[公共医学][谷歌学者] 14杨磊,王毅,毛华,等。声波刺猬是肌纤维母细胞肝星状细胞的自分泌活性因子。肝素杂志。2008;48:98–106. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Yahagi K、Ishii M、Kobayashi K等。正常小鼠肝脏胆管细胞的原代培养。体外细胞开发生物动画。1998;34:512–514.[公共医学][谷歌学者] 16Ishimura N、Bronk SF、Gores GJ。诱导型一氧化氮合酶上调小鼠胆管细胞中Notch-1的表达:与致癌的关系。胃肠病学。2005;128:1354–1368.[公共医学][谷歌学者] 17Sicklick JK、Li YX、Melhem A等。刺猬信号在一生中维持着肝祖细胞的存活。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2006;290:G859–870。[公共医学][谷歌学者] 18Chen JK,Taipale J,Cooper MK,等。通过环胺与Smoothened的直接结合抑制刺猬信号传导。基因发育。2002;16:2743–2748. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Vroman B,LaRusso NF.大鼠肝内胆管上皮细胞极化原代培养的发展和特征。实验室投资。1996;74:303–13.[公共医学][谷歌学者] 21Zeisberg M、Hanai J、Sugimoto H等。BMP-7可对抗TGF-β诱导的上皮-间充质转化,并逆转慢性肾损伤。自然医学。2003;9:964–968.[公共医学][谷歌学者] 22Zeisberg M,Shah AA,Kalluri R.骨形态发生蛋白-7在成人肾成纤维细胞中诱导间充质向上皮转化,并促进受损肾脏的再生。生物化学杂志。2005;280:8094–8100.[公共医学][谷歌学者] 23Kowanetz M、Valcourt U、Bergstrom R等,Id2和Id3定义了转化生长因子β和骨形态发生蛋白对细胞增殖和分化反应的效力。分子细胞生物学。2004;24:4241–4254. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Weltman MD、Farrell GC、Liddle C.炎症性肝脂肪变性大鼠营养模型中肝细胞CYP2E1表达增加。胃肠病学。1996;111:1645–1653.[公共医学][谷歌学者] 25.Roskams T,Yang SQ,Koteish A等。酒精性和非酒精性脂肪性肝病小鼠和人类的氧化应激和卵圆细胞积聚。《美国病理学杂志》。2003;163:1301–1311. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Akhurst B、Croager EJ、Farley-Roche CA等。一种改良的胆碱缺乏、补充乙硫氨酸的饮食方案可有效诱导小鼠肝脏中的卵圆细胞。肝病学。2001;34:519–522.[公共医学][谷歌学者] 27Yang S,Koteish A,Lin H,等。脂肪肝小鼠成熟肝细胞损伤和复制性衰老的卵圆细胞补偿。肝病学。2004;39:403–411.[公共医学][谷歌学者] 28Tee LB,Kirilak Y,Huang WH,等。将卵圆形细胞分化为癌前肝脏中的导管样细胞,这些细胞是在缺乏胆碱的饮食中添加乙硫氨酸的大鼠体内形成的。致癌。1994;15:2747–2756.[公共医学][谷歌学者] 29Sicklick JK,Li YX,Choi SS,等。刺猬信号在肝星状细胞激活和存活中的作用。实验室投资。2005;85:1368–1380.[公共医学][谷歌学者] 30Tian YW、Smith PGJ、Yeoh GCT。胚胎期、新生儿期和癌前期肝脏中作为肝干细胞候选细胞的卵形细胞:基于形态学和免疫组织化学染色的白蛋白和丙酮酸激酶同工酶表达鉴定。Hisochem细胞生物学。1997;107:243–250.[公共医学][谷歌学者] 31Thiery JP。发育和病理中的上皮-间充质转变。当前操作细胞生物学。2003;15:740–746.[公共医学][谷歌学者] 32Hay ED.上皮-间充质转化概述。Acta Anat(巴塞尔)1995;154:8–20.[公共医学][谷歌学者] 33Yoo YA,Kang MH,Kim JS等。声波刺猬信号通过转化生长因子β介导的ALK5-Smad 3通路的激活促进胃癌细胞的运动和侵袭性。致癌。2008;29:480–490.[公共医学][谷歌学者] 34Strutz F、Okada H、Lo CW等。成纤维细胞标记物的鉴定和表征:FSP1。细胞生物学杂志。1995;130:393–405. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35.Okada H,Danoff TM,Kalluri R,等。Fsp1在上皮-间质转化中的早期作用。美国生理学杂志。1997;273:F563–574。[公共医学][谷歌学者] 36Kinoshita K、Iimuro Y、Otogawa K等。腺病毒介导的BMP-7表达抑制大鼠肝纤维化的发展。内脏。2007;56:706–714. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Adams LA、Sanderson S、Lindor KD等。非酒精性脂肪性肝病的组织学过程:对103名连续肝活检患者的纵向研究。肝素杂志。2005;42:132–138.[公共医学][谷歌学者] 38Bailey JM、Singh PK、Hollingsworth MA。发育途径促进肿瘤转移:声波刺猬、Notch和骨形态发生蛋白。细胞生物化学杂志。2007;102:829–839.[公共医学][谷歌学者] 39Nitta T、Kim JS、Mohuczy D等。小鼠肝硬化诱导肝细胞-上皮-间质转化和生存信号通路的改变。肝病学。2008;48:909–919. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Jung Y、Brown KD、Witek RP等。刺猬反应祖细胞的积累与小鼠和人类酒精性肝病的严重程度相似。胃肠病学。2008;134:1532–1543. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Derynck R,Zhang YE。TGF-β家族信号转导中的Smad依赖和Smad依赖途径。自然。2003;9:577–84.[公共医学][谷歌学者] 42.Valdés F,Alvarez AM,Locascio A等。胎鼠肝细胞中的上皮-间质转化对转化生长因子β的凋亡作用具有抵抗力。摩尔癌症研究。2002;1:68–78.[公共医学][谷歌学者] 43Kaimari A,Potter J,Kaimari JY,等。转化生长因子-beta1在体外诱导小鼠肝细胞的上皮-间充质转化状态。生物化学杂志。2007;282:22089–101.[公共医学][谷歌学者] 44.Caldwell SH、Oelsner DH、Iezzoni JC等。隐性肝硬化:临床特征和潜在疾病的风险因素。肝病学。1999;29:664–669.[公共医学][谷歌学者] 45Konigshoff M、Balsara N、Pfaff EM等。特发性肺纤维化患者的功能性Wnt信号增加。《公共科学图书馆·综合》。2008;三:e2142。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46.Fan Y,Bergmann A.果蝇眼增殖和分化组织中凋亡诱导代偿性增殖的独特机制。开发单元。2008;14:399–410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Omenetti A、Popov Y、Jung Y等。刺猬通路调节大鼠胆道梗阻的重塑反应。内脏。2008;57:1275–1282.[公共医学][谷歌学者]