一个保守的Na⁺钠偶联中性氨基酸转运蛋白2（SNAT2）的结合位点^*

摘要

钠偶联中性氨基酸转运蛋白SNAT2，²属于溶质载体蛋白的SLC38基因家族(1). 与SNAT1和-4一起(2)，据信它能调解Na⁺-经典分配给系统A转运蛋白的依赖性氨基酸转运活性(三–8). 除SNAT1和-2外，SLC38家族还有其他四个已知成员，其中两个主要介导谷氨酰胺转运（SNAT3和-5，系统N(9–11)). SNAT2在哺乳动物组织中广泛表达(1,7)但它可能在大脑中起着特别关键的作用(12)它可能通过谷氨酸-谷氨酰胺循环帮助谷氨酰胺从星形胶质细胞穿梭到神经元(1). 这个过程对神经递质谷氨酸的循环利用至关重要(13). 然而，SNAT2对谷氨酸-谷氨酰胺循环的确切贡献仍存在争议(14).

尽管具有这种生理重要性，但人们对SLC38蛋白质转运氨基酸的功能特性和结构基础却知之甚少。虽然水疗分析预测了11个跨膜螺旋（TM），其中有一个细胞内N末端和一个细胞外C末端(1)目前尚不清楚这些转运蛋白是否属于转运蛋白的一个大超家族，其中的成员已经通过x射线晶体学进行了结构表征。目前，序列同源性仅与哺乳动物SLC32和SLC36家族的转运体以及与植物生长素载体和细菌氨基酸-多胺-有机定位（APC）家族关系较远的载体建立(15,16). 尽管最近报道了APC家族成员AdiC的低分辨率投影结构，但这些家族中的任何转运蛋白都没有高分辨率晶体结构(17)和SteT(18). 然而，这些结构不允许跨膜螺旋的分配。因此，尽管SLC38折叠是否与已建立的转运蛋白折叠相似似乎不太可能，但仍不清楚。

我们最近在SNAT2，Asn-82中发现了一个保守的氨基酸残基，它参与控制Na⁺转运体亲和力(19). 有趣的是，Asn-82定位在SNAT2的预测TM1中。最近发现第一个跨膜螺旋为钠提供配体⁺几种细菌转运蛋白中的结合位点，与SLC5（钠-葡萄糖转运体）和SLC6（钠和氯依赖性神经递质转运蛋白）家族成员相关(20–22)也包括细菌成员(23,24). 尽管与SLC5和-6的序列相似性是不可检测的，但SLC38可能是一个可能非常大的超家族的成员，具有相同的一般折叠，该超家族也包含许多氨基酸转运蛋白。

在这里，我们使用了一种基于轮廓的序列比对的同源建模方法(25,26). 对存放在蛋白质数据库（PDB）中的序列的搜索(27))发现最有可能共享类似折叠的转运体是来自超嗜热菌，亮氨酸_澳大利亚和同源海因转运体液化微杆菌，兆帕1。我们基于这些结构建立了同源模型，预测Asn-82是Na的一部分⁺结合位点。此外，TM8中另一个保守的亲水氨基酸残基Thr-384预计位于该阳离子结合位点附近。当Thr-384突变为丙氨酸时，SNAT2对Na的亲和力显著丧失⁺观察到，而在空间上从预测的Na中去除的其他位点的突变⁺结合位点对Na几乎没有影响⁺密切关系。我们假设SLC38家族是一个大型阳离子/有机底物转运蛋白超家族的成员，该超家族包括哺乳动物SLC5和-6蛋白，并且具有由TMs 1和8形成的保守阳离子结合位点。

实验程序

结果

这项工作中要测试的假设是，SLC5/6和SLC38溶质载体家族之间的阳离子结合位点是保守的，尽管它们没有显示出显著的序列同一性或相似性。例如，SNAT2和LeuT之间的ClustalW序列比对_澳大利亚显示了12%的微不足道的一致性。因此，我们使用其他方法来确定SNAT2和LeuT之间的潜在关系_澳大利亚.

TMs 1–5和6–10串联重复的证据

首先，我们应用了亲水性剖面对齐（手动插入间隙，图1一Kyte-Doolittle量表(37)，通过HHPred进行校准，补充图1)SNAT2与多巴胺转运体（DAT1）SLC6A3和已知结构的细菌转运体LeuT_澳大利亚和Mhp1(21,22). 以前有人认为，亲水性比对是鉴定膜蛋白之间远距离关系的有用工具(38,39).图1一表明所有这些转运蛋白的假定TMs 1–2、4–5和9–10成对出现，仅由短亲水片段分开。其次，特别是TM3和TM8都很长（预计有25-30个氨基酸残基）。这表明，正如在LeuT中实验发现的那样，这些SNAT2-TM在膜双层内的构型是倾斜的_澳大利亚和Mhp1(21,22). 第三，TMs 1和6含有许多亲水侧链，除一个（Mhp1）转运体外，其余所有转运体的亲水指数峰值约为1.7。第四，TM11中的氨基酸残基在SLC38家族成员中保守性很差，这表明该TM对底物运输并不重要，正如LeuT的结构所表明的那样_澳大利亚(22).

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图1。

SLC38转运蛋白被预测与SLC5和-6转运蛋白家族有远亲关系。 一，SNAT2的Kyte-Doolittle水病指数校准(红色)含DAT1（多巴胺转运体）、LeuT_澳大利亚和Mhp1。B类，SNAT2的三个重复序列（基序1、2和3）的序列比对：相同残基（|）、保守取代（：）和相似残基（.）。线形的统计评估如表所示。C类，SNAT2的预测拓扑，序列重复如所示蓝色（图案1），红色（图案2），以及绿色（图案3）。C端子的一半显示为蓝色虚线框N端的一半作为红色虚线框.突变的氨基酸残基如下所示圈子(红色圆圈表示影响Na的残留物⁺突变亲和力）。

亮氨酸_澳大利亚和Mhp1展示了TM 1–5和6–10结构域的序列复制，这些结构域以倒置拓扑插入到膜中(21,22). 因此，我们提出了这样一个问题，即是否可以在SLC38蛋白中检测到这种重复。通过将相应的转运蛋白片段（预测的TM结构域）与剩余蛋白进行序列比对，获得了内部重复的证据(图1B类). 最显著的重复是一个28重复的TM5-TM10重复（基序3 in图1B类). TM2-TM7和TM3-TM8之间发现了另外两个重复序列，虽然较短(图1B类,图案1和2). 这些重复，在图1C类，映射到预测的SNAT2拓扑，就好像TMs 1–5和5–10是通过序列复制生成的，正如LeuT所建议的那样_澳大利亚和Mhp1(21,22). 统计分析表明，与随机序列比对预期的情况相比，这些重复的可能性高出50-200倍(图1B类，表）。此外，SNAT3的C末端和N末端两半序列的比对显示出16%的序列一致性和35%的序列相似性，与串联重复一致。SNAT2的N端和C端片段对齐的亲水性图如所示补充图2，显示除TM3和8外所有预测的TM螺旋线的合理对齐。由于上述所有原因，SNAT2的一般折叠模式证明了串联复制的证据，并似乎模拟了与SLC5和SLC6家族相关的细菌转运体的已知结构。

同源性建模表明与SLC5/6转运蛋白的关系

进一步测试SNAT2和LeuT的预测远缘关系_澳大利亚，我们使用HHSearch方法进行基于轮廓的比对，该方法已被证明在寻找蛋白质家族之间的远距离关系方面是有效的(26). 该算法是针对PDB中存放的序列运行的，其中包含LeuT_澳大利亚和Mhp1。这次搜索得到了PDB结构2A65型（亮氨酸_澳大利亚)和2JLN公司（Mhp1）作为最可能的点击(21,22)，SNAT2与LeuT比对的HHSearch得分为108_澳大利亚.与LeuT对齐_澳大利亚序列同源性为15%，相似度为33%。半乳糖钠转运蛋白(20)，与LeuT有关_澳大利亚而Mhp1也被发现是一个打击(补充图3B类)以及BetP(40). 该同源模型预测的螺旋结构域与二级结构预测的螺旋段吻合良好(补充图4). 作为算法的阳性对照，我们使用了人类GABA（γ-氨基丁酸）转运体序列GAT1（GABA转运体1；SLC6），它与LeuT关系更密切_澳大利亚得分为995分(图2C类). 作为阴性对照，紫胶从大肠杆菌和GltPh来自霍里克希热球菌，与LeuT无关_澳大利亚，得分为13分及以下。HHSearch评分和GabP（γ-氨基丁酸渗透酶(41)，与SNAT2相关的APC家族成员）和SNAT1比对总结如下图2C类然后使用这种基于轮廓的比对，使用LeuT生成SNAT2的同源模型_澳大利亚作为模板(图2B类，预测TMs 1和8的序列如所示图2一). 该模型通过ProQ验证，LGscore为4.5(图2C类，使用Swissmod将能量最小化，LGScores>4表示类天然结构）。阳性和阴性对照的LG得分也显示在图2C类强调了这种同源建模方法的有效性。以Mhp1为模板重复此方法也获得了类似的结果(补充图3一)虽然LGscore小于4，但表明存在非本机结构。连同vSGLT和BetP的结果(补充图3B类)，亮氨酸_澳大利亚似乎是SNAT2同源建模的最佳模板。总之，序列分析和同源建模数据预测SLC38家族与SLC5/6家族有着远亲关系。

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图2。

基于模板LeuT结构的SNAT2同源模型_澳大利亚（PDB代码2A65型). 一，TMs 1和8的序列比对(灰色条)SNAT2和LeuT的_澳大利亚(红色，保守残基；黄色的，类似残留物；黑匣子和星星，残基有助于阳离子结合。B类，使用LeuT同源建模获得的结构模型_澳大利亚作为模板。预测的重复以颜色代码表示，如所示图1,B类和C类. The箭头显示模体2多肽链的方向。C类，HHSearch个人资料与LeuT比对的分数_澳大利亚(灰色条,左轴)和ProQ检查所得同源模型的LGscore(黑色条,右坐标轴).山墙γ-氨基丁酸（GABA）通透酶；服务贸易总协定1，GABA转运蛋白1；EAAC1号机组兴奋性氨基酸载体1；蕾丝，乳糖渗透酶。

在预测的阳离子结合位点附近突变保守氨基酸残基可消除钠⁺-感应负离子泄漏电流

同源性模型预测Asn-82，其先前已被证明可以控制Na⁺与SNAT2的相互作用(19)，靠近两个Na中的一个⁺模板的绑定位置。在LeuT中_澳大利亚，TM8（Thr-354，Ser-355）中的两个含OH的氨基酸侧链也为该Na提供配体⁺结合位点。Ser-355与SNAT2的保守苏氨酸Thr-384对齐(图2一). 因此，我们测试了Thr-384突变为丙氨酸是否影响Na⁺与SNAT2的互动。之前显示Na⁺结合激活SNAT2中未偶联的阴离子电流，该电流被随后的氨基酸结合所抑制(34). 一贯地，图3一显示向内阴离子电流（SCN⁻140 m的应用产生的流出米纳⁺野生型转运体（−110±20 pA，n个= 5). 然而，SNAT2的阴离子电流很小_T384A型（-11±2 pA，n个= 6,图3一). 与SNAT2相比_重量，具有Na的离解常数⁺(K（K）_纳105±8 m（近似值）米(n个= 5,图3B类)，增加Na⁺不会导致T384A突变转运体的阴离子电流饱和(图3B类)表明它不能支持阴离子电流或与钠的相互作用⁺被禁止。该表型与之前发现的SNAT2相似_N82A号(19).

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图3。

T384A突变抑制Na⁺-取决于阴离子泄漏电流。 一，140m应用引起的典型泄漏阴离子电流的比较米细胞外钠⁺在未转染的细胞（对照）和表达突变体和野生型SNAT2的细胞之间（140m米纳⁺应用程序由灰色条).B类，泄漏阴离子电流作为细胞外Na的函数⁺对于SNAT2_T384A型（○），SNAT2_G88A型(♦), 和SNAT_重量(●) (实体符号，减去非特异性电流（▴）；打开的符号，减法前的原始数据）。记录吸管包含140米米SCN公司⁻膜电位为0 mV。C类，突变体细胞表面部分的Western blot(右车道)和野生型(左侧车道)通过细胞表面蛋白生物素化后用亲和素珠分离得到YFP-SNAT2(M（M）_第页标记的起始位置显示在左边). 这个箭头表示预期M（M）_第页单体YFP-SNAT2融合。未转染细胞制备的样品中未观察到条带(中间车道). 高分子量和低分子量条带很可能是由聚集体和分解产物引起的，这在融合蛋白中很常见。

另一种可能性是SNAT2_T384A型在质膜中不表达。然而，这种可能性不大可能，因为（i）黄色荧光蛋白标记的SNAT2的细胞表面表达_T384A型（YFP-SNAT2）_T384A型)与SNAT2相比没有显著变化_重量(图3C类)由细胞表面生物素化和Western blotting确定（YFP-SNAT2功能齐全，未显示），（ii）与野生型转运体相比，细胞中的表达模式没有变化，这是由免疫细胞化学确定的(补充图5)以及（iii）如下文所述，突变转运体支持转运电流。TM1中另一个保守残基G88A的突变也降低了最大阴离子电流，但没有消除它(K（K）_纳（app））130±15米米,n个= 5,图3B类).

在SNAT2中_重量丙氨酸在细胞外钠存在下的应用⁺导致抑制阴离子泄漏电流(34). 然而，在SNAT2中没有发现阴离子泄漏电流的抑制_T384A型(补充图6)，尽管丙氨酸在10米处与转运蛋白结合米浓度（见下文）。总之，这些结果表明T384A突变阻止阴离子渗透转运蛋白，就像之前在SNAT2中发现的那样_N82A号.

T384A突变干扰底物转运

为了进一步测试T384A突变效应的机制，我们测定了10 m米丙氨酸。尽管在SNAT2中观察到显著的传输电流_T384A型-表达细胞（比对照组高340%），此电流显著降低与国民账户体系2_重量电流（22%WT，图4,一和B类). 这些电流是由衬底传输引起的，而不是由泄漏电导引起的，如补充图7丙氨酸转运电流数据得到了电流记录和使用特定系统A可转运底物MeAIB的摄取实验的支持，该系统没有显示出显著的摄取活性(图4B类). MeAIB由SNAT2运输_重量根据目前的记录，丙氨酸的比率为85%(图4B类). 这些结果表明，T384A突变干扰了SNAT2转运氨基酸的能力，正如之前发现的N82A突变一样(19). 然而，在SNAT2中，MeAIB摄取也可能受损_T384A型因为它的亲和力很低(K（K）_AA公司（近似值）=95米米,补充图8).

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图4。

384位突变抑制丙氨酸转运电流和氨基酸摄取。 一，施加10 m引起的典型输送电流米丙氨酸到非转染（对照）和SNAT2_重量-和SNAT2_T384A型-表达细胞。镀液含140 m米NaMes，移液管溶液含有140 m米0毫伏跨膜电位下的KMs。B类，平均10m米丙氨酸和MeAIB诱导的转运电流(黑色和灰色条,左轴)和MeAIB摄入(浅灰色条,右坐标轴)瞬时转染载体（pBK-CMV（Δ[1098–1300]）、SNAT2野生型和SNAT2的HEK293T细胞_T384A型cDNA。运输[¹⁴C] MeAIB（40μ米)在含NaMes的缓冲液中测量1分钟。减去泄漏电流。SNAT2中电流相对较大的误差条_重量-表达细胞是由不同细胞之间高达3倍的表达水平差异引起的。这个黑色恒星（*）表示与SNAT2相比的统计显著性_重量在第页<0.05水平，由单向方差分析和Tukey的事后分析确定。统计显著性与控制电流/吸收由灰色恒星(*). −, 未进行错误分析。

T384A突变对底物亲和力的影响

氨基酸和共转运钠⁺离子被提议以有序的顺序与细胞外结合位点结合，与钠结合⁺第一结合和第二氨基酸结合(4,19,34)，如下所示方案1.

方案1

尽管不能完全排除随机顺序底物结合方案的替代方案，但很明显，Na⁺不需要结合氨基酸与SNAT2相互作用(19,34). 根据Na的说法⁺-第一个绑定方案，有缺陷的Na⁺结合到突变转运体K（K）_纳以及缺陷氨基酸的相互作用应导致高显着性K（K）_AA公司（app）用于丙氨酸结合，根据，

哪里K（K）_AA公司是氨基酸SNAT2的固有离解常数。K（K）_AA公司（应用程序）_重量Na倍增时减少了1.3±0.1倍⁺140至284米米(图5一和B类)，与内在一致K（K）_纳115米米（已测量K（K）_纳（近似值）=105 m米). 相反，Na加倍⁺导致K（K）_AA公司SNAT2的（应用）_T384A型丙氨酸(图5,一和B类)，暗示内在K（K）_纳第页，共页>5页米从方程式1因此，这些数据表明钠离子受损⁺结合间接导致表观K（K）_AA公司运输公司的（app）。对于SNAT2_重量，的第三个数据点K（K）_AA公司（近似值）=1.3±0.15 m米在10米处收集米细胞外钠⁺(图5B类). 此数据与内在K（K）_纳上面列出的值（应为K（K）_AA公司（近似值）=1.6 m米). 对于SNAT2_T384A型，的K（K）_AA公司（app）过高，无法按预期可靠确定K（K）_AA公司（近似值）=160 m米在10米处米纳⁺.

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图5。

增加细胞外钠⁺对SNAT2的表观亲和力产生差异效应_重量和SNAT2_T384A型丙氨酸。 一,K（K）_AA公司SNAT2的（应用）_T384A型和SNAT2_重量对于丙氨酸，通过记录140和284 m存在时作为丙氨酸浓度函数的底物诱导的转运电流来确定米0 mV.SNAT2下的细胞外NaMes_重量，□在140米处米纳⁺和○在284米处米纳⁺; 国民账户体系2_T384A型，■140米处米纳⁺和●284 m处米纳⁺.B类，比较K（K）_AA公司（应用程序）我-SNAT2的丙氨酸_T384A型和SNAT2_重量存在10米、140米和284米米细胞外钠⁺双向方差分析表明K（K）_AA公司SNAT2的（应用程序）_重量和T384A以及K（K）_AA公司140 m和284 m处的（近似）值米纳⁺（在第页<0.05水平，由星星.

T384A突变对转运电压依赖性的影响

尽管SNAT2_T384A型丙氨酸转运电流（10 m米丙氨酸，140米米纳⁺)在0 mV时很小，在跨膜电位越来越负时呈指数增长(图6,一和B类). 相反，SNAT2的IV关系_重量更为复杂，在−30 mV及以上的电压下，电压依赖性很小，在更多负电压下电压依赖性更陡。这可能表明速率限制步骤发生了变化。当细胞外丙氨酸浓度从10 m降低时，这种IV关系发生了改变米（饱和浓度）至0.5 m米（70%饱和度，图6,B类和C类). 钠的减少⁺至1米米（20米米丙氨酸）也有类似的效果(图6D类). SNAT2的IV关系_T384A型140 m处的输送电流米纳⁺和40米米丙氨酸（70%饱和度）的斜率与相同饱和度水平下WT转运蛋白的斜率非常相似。因此，T384A突变不会改变SNAT2转运的固有电压依赖性，这与非电荷改变突变一致。然而，表观电压依赖性增加，因为Na⁺和/或丙氨酸结合位点未饱和。

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图6。

传输电流-电压关系（由我-SNAT2的丙氨酸应用）_T384A型和SNAT2_重量. 一，SNAT2典型丙氨酸诱导传输电流的电压依赖性_T384A型.B类，平均电流-电压关系为10 m米丙氨酸诱导的非转染细胞的转运电流（对照，开放式圆圈)以及SNAT2_T384A型(开放三角形)-和SNAT2_重量-表达细胞(实心正方形).C类，平均电流-电压关系为10 m米丙氨酸诱导的(开放三角形)和40米米丙氨酸诱导的运输流(实心三角形)在SNAT2中_T384A型和0.5米米丙氨酸诱导的运输流(开放式广场)在SNAT2中_重量存在140 m米细胞外钠⁺.D类，存在40 m时的平均电流-电压关系米丙氨酸浓度和140 m米纳⁺在SNAT2中_T384A型(实心三角形)在20m的情况下米丙氨酸浓度和1 m米纳⁺在SNAT2中_重量(开放的圆圈).

T384A突变强烈干扰Na⁺与SNAT2的互动

要测量K（K）_纳对于野生型和突变型SNAT2，我们测定了丙氨酸诱导的转运电流作为细胞外钠的函数⁺丙氨酸浓度为20 m米(图7一). 明显的K（K）_纳SNAT2的（应用）_重量为800±200μ米（丙氨酸转运体，n个=5），与内在K（K）_AA公司为140μ米和aK（K）_纳115米米（在中确定，表1)根据方程式，

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图7。

T384A突变导致SNAT2对钠的表观亲和力显著降低⁺.SNAT2的表观亲和力_重量(一)和SNAT2_T384A型(B类)对于细胞外Na⁺通过记录20 m进行测量米 我-丙氨酸诱导的转运电流与细胞外钠的关系⁺膜电位为0 mV（140 m米梅斯⁻，细胞外溶液，140米米KMes细胞内溶液）。

表1

丙氨酸和钠的SNAT2转运体的固有离解常数⁺

范围K（K）_AA公司和K（K）_纳为SNAT2提供_T384A型所有这些都导致了理论数据与实验数据集的类似偏差，这是由使用方程式1和2.

	国民账户体系2重量	国民账户体系2T384A型
K（K）AA公司(μ米)，丙氨酸	140	80–120
K（K）纳（米米)	115	15,000–20,000

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相比之下K（K）_纳SNAT2的（应用）_T384A型增加了约800倍，达到250±100米米(n个= 6,图7B类). 与WT和突变数据最为一致的内在离解常数，如所示（使用最小二乘最小化方法方程式1和2两点Na⁺浓度为140和284 m米)在中列出表1表明T384A突变对内源性K（K）_纳（与SNAT2相比至少增加了130倍_重量)但对K（K）_AA公司.

Asn-82和Thr-384以外的位点突变对Na几乎没有影响⁺结合

迄今为止所描述的结果表明，82位和384位的氨基酸参与了钠的控制⁺亲和力，与预测Na的一部分一致⁺结合位点。为了测试这种对亲和力的影响是否是这个结合位点特有的，或者是否也是由其他突变引起的，我们测定了Na⁺许多其他随机选择的突变转运蛋白的离解常数(图8一). 尽管有两种突变转运体SNAT2_Y337A型(19)和SNAT2_C279S型，已更改K（K）_纳中度，在2-5倍之间，其他5个测试突变对K（K）_纳这些结果表明K（K）_纳对预测的Na的突变具有特异性⁺结合位点。

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图8。

验证Na的位置⁺SNAT2中的结合位点，由同源性模型预测，具有突变映射。 一,K（K）_纳Na的值⁺结合野生型SNAT2和突变转运蛋白（突变在底部,V（V）=0毫伏）。颜色代码：K（K）_纳（Mut）增加<2倍与K相比_纳（重量）(灰色条)，2-5倍(棕色钢筋)，和>5倍(红色条)通过特异性突变。B类，根据中所示的色码映射突变的影响一利用LeuT对SNAT2进行同源建模得到的结构模型_澳大利亚作为模板。丙氨酸底物（仅显示Cα）在其假设结合位置如所示绿色，纳⁺在其假设结合位点（LeuT的Na2_澳大利亚)如所示蓝色。每个突变只显示骨干碳原子。TMs 1和8(黄色的)以及3和6(灰色)在示意图中强调。

讨论

在这里，我们提出了哺乳动物SLC38家族和SLC5和-6家族的转运蛋白之间的远缘关系，它们的一般结构折叠模式已知，在跨膜结构域中具有保守的阳离子结合位点。与SLC5/6对应物一样，SLC38转运蛋白似乎是通过具有5个跨膜螺旋的祖先蛋白的串联复制进化而来，导致C末端5个TM的拓扑反转(图1C类). 然而，与SLC6家族和LeuT相比_澳大利亚和Mhp1(21,22)，TM12在SLC38家族中缺失，导致细胞外C末端。因为LeuT_澳大利亚而Mhp1结构预测TMs 11和12在空间上从易位途径中移除，这些螺旋可能对转运蛋白功能并不重要。一直以来，TM11中的氨基酸在SLC38家族成员中保存最少。还应该注意到，许多细菌SLC6序列预测11个TM螺旋。

基于所提出的距离关系，我们使用LeuT生成了SNAT2的同源模型_澳大利亚和Mhp1作为模板，测试SNAT2的一般折叠模式。该同源性模型旨在提供SNAT2多肽链主干折叠的信息，以指示氨基酸残基作为诱变研究的目标。该模型预计不会提供氨基酸侧链的详细位置。因为LeuT_澳大利亚和Mhp1都有保守的Na⁺结合位点(21,22)，我们检查了SNAT2同源模型中的保守氨基酸残基，这些氨基酸残基可能有助于该结合位点的配体。我们在TM1中鉴定出Asn-82，在TM8中鉴定出Thr-384(图2,一和B类)，两者在整个SLC38家族中都是保守的(补充图9). 虽然在LeuT_澳大利亚而Mhp1 TM1仅将主链羰基作为Na的配体⁺结合位点(21,22)，TM8提供了两个侧链配体，其中一个在SNAT2和LeuT之间基于轮廓的序列比对中保守_澳大利亚（SNAT2-Thr-384，图2一).

我们还使用了APC家族转运蛋白的序列比对，已知其与SLC38有关(16)，含LeuT_澳大利亚和Mhp1(图2C类和补充图3). 正如Lolkema和Slotboom最近假设的那样，APC转运体也被预测具有与SLC6转运体相似的一般折叠(42). 然而，它们似乎与Mhp1关系更密切，因为TMs 1和8中提议的阳离子结合基序在一些APC转运蛋白中完全保守。这个装订图案由A组成XX年TM1中的I基序和TM8中的S（T）S（T。

LeuT_澳大利亚实验验证了基于Mhp1的同源模型，如图8B类。我们使用了突变映射方法，说明了突变对Na的影响⁺与SNAT2结合。突变对K（K）_纳（>5倍）用红色表示。显然，这些突变映射到同源模型上预测的阳离子结合位点，尽管其他位点的突变对K（K）_纳我们之前报道过Asn-82的突变，它是预测的阳离子结合位点的一部分，强烈降低了SNAT2对Na的亲和力⁺这些结果与SNAT3的突变数据一致，其中类似和保守的残基N76消除了底物转运(43). 在这里，我们将这些研究扩展到了Thr-384，它对Na至关重要⁺但与Asn-82突变不同的是，底物转运仍然可能发生。事实上，增加Na⁺增加钠饱和度的浓度⁺结合位点显著增加转运电流，而SNAT2则不是这样_N82A号(19). 这一结果表明T384A突变的影响更为微妙。

尽管SNAT2-Na的详细几何结构⁺结合位点不能通过我们的突变和同源建模研究直接确定，我们提出了一个假设的结构模型，如补充图10在这个模型中，Asn-82将阳离子与其主链羰基氧以及侧链氧进行配位。有趣的是，与LeuT中的两个OH配体相比，TM8的关键部分只有一个侧链羟基作为配体_澳大利亚这种差异最可能的解释是SNAT2 Asn-82侧链酰胺氧取代了385位缺失的丝氨酸（苏氨酸）侧链配体(补充图10). 因此，与LeuT类似，假设的SNAT2阳离子结合位点的配位数为5_澳大利亚和Mhp1(21,22). 我们计算了这个假想钠的化合价⁺使用经验方法的结合位点（参考文献。44,图10的补充信息)，Na的值为1.07⁺作为配体。这与Na的预期价非常一致⁺结合位点(44). 拟建Na⁺结合位点不涉及氨基酸底物贡献的阳离子配位。因此，氨基酸可能在没有阳离子的情况下结合，尽管亲和力很可能很低。

SLC38和SLC5/6家族成员之间关系的进一步证据来自于对转运蛋白的功能特性和转运机制的研究。在SLC5/6家族的许多成员中，发现电致Na⁺这种钠引起的结合和/或构象变化⁺结合是整个输运过程的电压依赖性的主要因素(45–47). 此外，至少一个Na的顺序结合⁺离子与有机底物结合是所提出的传输机制的一个共同特征(46,47). 系统A运输车具有这些机械特性(4,19,34,48)，表明在这些远距离相关的转运蛋白中机制是保守的，而多肽序列有很大的差异。因此，通过研究机制来检测远距离转运蛋白家族关系可能比仅仅依靠基因序列比较方法更有用。

SNAT2与阴离子电导有关，阴离子电导被钠激活⁺与转运体结合，并被氨基酸底物的结合所抑制(34). 这是一种非耦合电导，阴离子通量仅由阴离子的电化学驱动力决定，而不是由输送的阳离子/基质决定。氨基酸Asn-82和Thr-384的突变是预测的阳离子结合位点的一部分，消除了这种阴离子电导(图3和补充图6). 因此，这些位点可能不仅控制Na⁺亲和性和耦合的阳离子/底物运动，以及解偶联的电流成分。

在这项工作进行综述的同时，发表了一种细菌精氨酸的两种x射线结构：来自APC家族的胍丁胺反转运蛋白(49,50). 这些结构证实了我们提出的SLC5-6和APC/SLC38运输机的类似结构褶皱。

总之，本研究为SLC38和SLC5/6转运蛋白家族成员之间的远距离关系提供了理论和实验支持。我们的结果预测存在一个保守的阳离子结合位点，由跨膜螺旋1和8贡献的氨基酸残基形成。生成了一个同源模型，该模型允许预测与氨基酸底物结合相关的氨基酸残基，有助于对SLC38转运体的未来结构-功能研究，并生成允许设计作用于SLC38蛋白质的药物的分子模型。

补充材料

确认

参考文献