美国生理学杂志心脏循环生理学。2009年9月；297（3）：H976–H982。
饮食诱导代谢综合征小鼠模型心肌赖氨酸氧化酶对心脏重构的调节
,1,2 ,1,三 ,1 ,1和1,2
谢尔玛·齐巴迪
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院梅尔·扎克曼和埃尼德·扎克曼健康促进科学部三亚利桑那大学营养科学系
兰迪·巴斯克斯
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院梅尔·扎克曼和埃尼德·扎克曼健康促进科学部三亚利桑那大学营养科学系
德里克·摩尔
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院Mel和Enid Zuckerman健康促进科学部，以及三亚利桑那大学营养科学系
道格拉斯·拉森
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院梅尔·扎克曼和埃尼德·扎克曼健康促进科学部三亚利桑那大学营养科学系
罗纳德·沃森
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院梅尔·扎克曼和埃尼德·扎克曼健康促进科学部三亚利桑那大学营养科学系
1萨佛心脏中心，医学院，2亚利桑那州公共卫生学院梅尔·扎克曼和埃尼德·扎克曼健康促进科学部三亚利桑那大学营养科学系
转载请求和其他通信地址：R.R.Watson，Mel and Enid Zuckerman亚利桑那州图森市亚利桑纳大学亚利桑那州公共卫生学院，邮编：85724（电子邮件：ude.anozira.u@nostawr) 2009年4月28日收到；2009年7月6日验收。
摘要
代谢综合征（MetS）表示心血管疾病风险增加。虽然MetS的单个成分对心脏结构和功能有不利影响，但MetS的多个成分对心脏细胞外基质（ECM）的影响程度尚不明确。赖氨酸氧化酶（LOX）是心脏ECM修饰酶之一，催化胶原交联的形成。我们的目的是确定饮食诱导的MetS对LOX酶的影响。通过给C57BL/6雄性小鼠喂食高脂肪、高简单碳水化合物6个月，诱导其产生MetS。通过实时PCR检测基因表达。测定心肌蛋白表达和LOX酶活性。通过组织学和羟脯氨酸测定来评估纤维化的严重程度。通过体内压力-容积关系分析评估心脏舒张功能。对LOX、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂进行了分析，其中，LOX在MetS小鼠中的变化最为显著。尽管LOX亚型的基因表达减弱，但MetS小鼠的骨形态发生蛋白-1表达显著上调。相应地，与对照组相比，成熟LOX与前酶LOX的蛋白表达比率增加了25.9%，LOX活性增加了50.0%，心肌交联胶原增加。这种纤维化反应与舒张末期压力显著增加、左心室僵硬度增加和舒张充盈模式受损相一致。我们的数据表明，饮食诱导的代谢综合征改变了重塑酶，主要是LOX，从而通过增加交联量和诱导舒张功能障碍来改变ECM结构。
关键词：心脏，交联胶原蛋白
代谢综合征（MetS）代表了影响工业化国家约22%成年人和超过40%50岁及以上人群的心血管危险因素的聚集(12). 其主要特征包括腹部肥胖、胰岛素抵抗、高血压和血脂异常。这些因素协同作用，增加心血管不良事件的风险，并与高心血管发病率和死亡率相关(20,28). 动脉高血压导致心肌纤维化和肥厚，导致舒张功能障碍(18). 此外，胰岛素抵抗、肥胖和动脉粥样硬化有助于左心室重构和舒张功能障碍的发展(8,19,32). 最近的研究支持MetS与舒张功能障碍之间的关系(9,15). MetS患者同时存在收缩和舒张功能障碍(5,37).
舒张功能障碍，MetS早期出现的异常(9,15)与过度硬化的心脏细胞外基质（ECM）和心肌纤维化相关，导致心室舒张和舒张充盈模式受损。间质纤维化的特征是ECM成分的沉积增加，这是由于生产压倒了降解。在ECM修饰酶中，赖氨酸氧化酶（LOX）是ECM交替的核心，因为这些酶催化胶原蛋白和弹性蛋白交联的关键步骤。胶原蛋白交联的形成通过稳定ECM抵抗酶降解，有助于增加心室僵硬度和降低顺应性(三).
尽管MetS中已有心肌纤维化和舒张功能障碍的报道，但LOX表达和活性的特征性变化仍不清楚。因此，本研究侧重于饮食诱导的MetS对心脏ECM重塑的影响，尤其是LOX和交联胶原蛋白。
材料和方法
动物模型。
该研究方案由亚利桑那大学动物审查委员会批准。本研究遵循了《实验动物护理和使用指南》和《实验动物护理原则》中的程序。雄性C57BL/6小鼠于4周龄时从Jackson（ME Bar Harbor）购买，并在标准条件下饲养。老鼠(n个=8/组），喂食6个月的对照饮食（7%脂肪、20%蛋白质、59.2%碳水化合物、F5371、BioServ、Frenchtown、NJ）或高脂肪、高简单碳水化合物（HFHSC）饮食（35%脂肪、20%蛋白、35.4%简单碳水化合物、BioServi、F5366），其中包括来自猪油的35%热量，猪油富含饱和和单不饱和脂肪酸。脂肪酸分析表明，HFHSC膳食中含有36.9 mgω-6脂肪酸/g膳食，比例为102.6:1至ω-3脂肪酸(). 随意喂食老鼠。在基线和每月测量食物摄入量和体重。在6个月的治疗后，所有小鼠均通过经胸超声心动图进行评估，并采集Millar电导导管系统和组织进行基因组和结构表征。
表1。
| 脂肪酸 |
饮食
|
|---|
| 控制 | HFHSC公司 |
|---|
| 总饱和水量 | 28.5 | 142.3 |
| 单不饱和总含量 | 35.7 | 178.5 |
| PUFA总量 | 7.5 | 37.3 |
| ω-6 PUFA总量 | 7.4 | 36.9 |
| ω-3 PUFA总量 | 0.07 | 0.36 |
| w-6/ω-3多不饱和脂肪酸 | 102.6 | 102.6 |
代谢评估。
小鼠在抽血前禁食6小时。在麻醉下通过直接心脏穿刺获得动脉血（0.8 ml）。血清总胆固醇和甘油三酯的浓度由亚利桑那大学病理学系实验室采用酶比色法测定。使用罗氏诊断公司（印第安纳波利斯）的Accu-Chek舒适曲线试剂盒测量血液中的葡萄糖。使用Linco Research（密苏里州圣查尔斯）的ELISA试剂盒测量血清胰岛素水平。
血压测量。
使用XBP1000计算机化鼠尾血压系统（Kent Scientific，Torrington，CT），通过无创尾剪断法测量未麻醉小鼠的收缩压。收缩压值是连续三次测量的平均值。
显微外科方法和体内血液动力学测量。
正如我们实验室之前所描述的那样，使用了Millar电导导管系统(39,42). 所有小鼠均用生理盐水中的氨基甲酸乙酯（1000 mg/kg ip）和丙二醇中的氯醛糖（50 mg/kgip）麻醉并通气。颈外静脉插管进行容量给药。通过胸骨后横切口暴露心脏顶部和下腔静脉。将高保真度1.4-Fr换能器导管（Millar Instruments，Houston，Texas）通过心尖插入左心室。如前所述，采集压力-容积（P-V）回路，并使用PVAN软件计算血流动力学参数(42).
LOX的Western blot分析。
心脏组织在冷CelLytic哺乳动物组织溶解/提取试剂（Sigma-Aldrich）中均质，并使用Bio-Rad蛋白质分析进行定量。将20微克蛋白质涂敷在NuPAGE 10%双三凝胶（Invitrogen）上，使用NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（Invit罗gen）在200 V下分离50分钟，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下，将膜置于含有5%BSA（Sigma-Aldrich）的封闭缓冲液中，在含有0.1%吐温-20（TBS-T）的TBS中培养1h。用兔多克隆抗LOX抗体（1:32000，Novus Biological）在1×TBS-T中在4°C下过夜，并在TBS-T内洗涤三次。相应的抗兔次生辣根过氧化物酶偶联抗体来自Calbiochem。用ECL蛋白质印迹检测试剂（GE Healthcare）进行反应。通过X射线胶片曝光获得图像，并通过Quantity One 4.6.2，Basic（Bio-Rad）分析带密度。为了正常化，使用β-肌动蛋白抗体作为负荷对照。
LOX活性的测定。
根据Palamakumbura和Trackman的报告修改的高灵敏度荧光分析法测量LOX活性(30). 简单地说，25 mg心脏组织在−80°C的300μl CelLytic（Sigma）中均质化，并用LOX缓冲液[1.2 mol/l尿素和50 mmol/l硼酸钠（pH 8.2）]重新配制成1 ml，然后在12000℃离心克收集上清液10分钟后，通过烷基单胺底物产生过氧化氢检测LOX酶活性，并通过辣根过氧化物酶催化氧化N个-乙酰-3,7-二羟基苯恶嗪（Amplex红），波长563和587 nm。通过添加500μmol/l富马酸β-氨基丙腈来制备平行未知样品，以完全抑制LOX的活性。与纳米过氧化氢标准图的荧光相比，发射强度差异被转换为LOX作用产生的过氧化氢量。
MMP活性的测定。
明胶酶谱分析是根据Zibadi等人描述的方法进行的(42). 简单地说，将10 mg心脏组织均匀地放入1 ml酶谱仪提取缓冲液中，并将提取上清液应用于预制的10%聚丙烯酰胺凝胶酶谱（Novex）。活化和显影后，用图像分析软件（Bio-Read GS-800）对条带进行定量。
心肌总胶原和交联胶原的测定。
羟脯氨酸是一种只存在于结缔组织中的氨基酸，用于量化胶原蛋白浓度。为了测量总心肌羟脯氨酸，将干燥的左心室样品在6 N HCl中120°C下水解72 h，然后用2.5 M NaOH中和。然后根据Stegemann和Stadler的方法，通过与反式羟脯氨酸（Sigma）的标准比色曲线进行比较来量化羟脯氨酸水平(35). 根据Woodiwiss等人的研究，胶原蛋白交联是通过溴化氰消化法测定的(38)这是穆克吉和森最初描述的修改(26). 干燥的左心室样本在PBS中均匀化，然后在4000℃下离心克持续10分钟。然后将所得沉淀在2%SDS中洗涤三次以去除非胶原蛋白，每次以4000离心克持续10分钟。在PBS中连续三次洗涤，然后在丙酮中两次洗涤，以去除2%的SDS。第二次丙酮洗涤后，将所得颗粒风干，并将其重新悬浮在20 mg/ml溴化氰中70%甲酸中，并在25°C下培养24小时。培养后，将悬浮液在4000℃下离心克持续20分钟。使用快速真空干燥所得上清液，然后如上所述测量羟脯氨酸。通过比较总羟脯氨酸和氰溴化物-可溶性羟脯氨酸来确定交联百分比。假设胶原蛋白平均含有13.5%的羟脯氨酸，数据以每毫克干心脏重量中的胶原蛋白微克表示。
心脏组织组织学。
心脏纤维化由亚利桑那大学病理学系实验室采用标准Picosirius红染程序进行评估。
统计。
数据表示为平均值±SE。使用SPSS软件（SPSS，芝加哥，IL）进行统计分析。未付费学生的t吨-当数据符合t吨-测试。当正态性和等方差检验失败时，替代可比非参数检验（Mann-Whitney检验）。值为对<0.05被用作统计显著性的标准。
结果
代谢概况。
总结了喂食MetS诱导饮食的小鼠的代谢特征。与对照组相比，HFHSC饮食治疗组的空腹血清总胆固醇、甘油三酯和葡萄糖水平分别显著升高59.7%、58.6%和72.3%。与对照组相比，HFHSC饮食导致胰岛素浓度显著增加四倍(对<0.05). 此外，喂食HFHSC的小鼠尾部收缩压和体重显著增加(对<0.0001). 因此，喂食HFHSC的小鼠出现了一系列生化和代谢异常，这些异常是MetS的特征。
表2。
| 参数 | 控制 | HFHSC公司 |
|---|
| 总胆固醇，mg/dl | 129.0±5.6 | 206.0±2.9† |
| 甘油三酯，mg/dl | 64.5±6.3 | 102.3±13.0* |
| 葡萄糖，mg/dl | 150.0±6.2 | 258.4±23.1* |
| 胰岛素，ng/dl | 1.20±0.14 | 4.02±0.59* |
| 收缩压，mmHg | 120.3±1.3 | 166.6±5.2† |
| 体重，g | 42.4±1.2 | 54.1±0.9† |
血液动力学参数和舒张功能。
使用电导导管P-V回路分析，发现舒张末期容积显著减少，而喂食HFHSC的小鼠舒张末期压力显著增加(对<0.05,,A类和B类).HFHSC组舒张末期P-V关系（β）斜率更大（增加71.6%，对<0.01). 这种变化表明心室僵硬度增加，顺应性降低。相应地，左心室充盈率受到抑制（dV/dt吨最大值,对<0.01），这是心脏周期异常充盈期的特征(). 这些变化伴随着左心室P-V环持续向左和向上移动().
舒张功能的体内分析。数据表示从体内压力-容积（P-V）回路分析中获得的舒张功能参数。高脂肪、高简单碳水化合物（HFHSC）饮食与舒张末期容积显著降低相关(A类)舒张末期压力增加(B类)舒张末期P-V关系斜率增加（β；C)，以及左心室（LV）充盈率降低(D类). LV P-V回路也向上和向左移动(E类). 数值表示为平均值±SE；n个=4–8只小鼠/组*对<0.05和†对与对照组相比<0.05。
心脏LOX基因和蛋白的表达和活性。
心脏的液氧和LOXL-3型与对照组相比，喂食HFHSC的小鼠的mRNA水平保持不变。然而，骨形态发生蛋白-1（BMP-1；1.8倍，对<0.05），处理前-LOX，产生成熟酶(35)(). 蛋白质印迹分析显示两个免疫反应带对应于LOX的酶原（50kDa）和成熟（30kDa）形式。如所示在喂食HFHSC的小鼠中，成熟LOX与前LOX的蛋白表达比率增加了25.9%(对<0.05），表明BMP-1增加了前-LOX潜伏池的激活。相应地，与对照组相比，喂食HFHSC的小鼠的LOX酶活性增加了50.0%(对<0.05,).
心脏赖氨酰氧化酶（LOX）基因和蛋白的表达和活性。A类：通过实时PCR测定LOX、LOXL-3和骨形态发生蛋白-1（BMP-1）的相对mRNA表达。用HFHSC饮食治疗6个月后，BMP-1基因表达上调了1.8倍。B类：免疫反应性LOX蛋白的Western blot分析，代表原酶（50kDa）和成熟（30kDA）形式。C：由H的生成表示的LOX活性2O（运行）2并通过Amplex红氧化法检测。D类心脏LOX酶活性与左室僵硬度（β）之间的相关性。数值表示为平均值±SE；n个=3至4只小鼠/组*对与对照组相比<0.05。
心脏MMPs基因表达和活性。
与对照组相比，喂食HFHSC的小鼠中MMPs与TIMPs的基因表达比率降低的趋势不明显(). 值得注意的是，与对照组相比，喂食HFHSC的小鼠表现出明显较低的MMP-2（62 kDa）活性(对<0.01），支持胶原蛋白降解率降低，从而导致心室僵硬度增加。检测到前MMP-2活性有类似的下降趋势，与对照组相比无显著差异(,B类和C).
心脏基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达和活性。A类：通过实时PCR测定前MMP-2和-9、MMP组织抑制剂（TIMP）-2和-4的相对mRNA表达。B类：显示MMP-9、原-MMP-2和MMP-2活性变化的代表性明胶酶谱。C：裂解带的相应密度分析。外径，光密度。数值表示为平均值±SE；n个=3至4只小鼠/组*对与对照组相比<0.01。
心肌总胶原和交联胶原特征。
通过组织学和羟脯氨酸测定评估对饮食诱导的MetS的纤维化反应。心脏切片的Picosirius红染色显示喂食HFHSC小鼠的心肌明显纤维化().显示了通过羟脯氨酸测定测定的心室胶原含量。与对照组相比，喂食HFHSC的小鼠心脏总胶原蛋白含量增加了44.9%(对<0.05). 喂食HFHSC的小鼠的纤维胶原交联比对照组多68.1%(对< 0.05). 这些发现与MMP-2活性中度下降和LOX活性显著增加相一致，导致胶原蛋白降解减少，总胶原蛋白和交联胶原蛋白累积增加。HFHSC小鼠交联的改变解释了舒张功能的变化。
心肌胶原特征。A类：心脏组织的Picosirius红色图像。B类：通过羟脯氨酸和溴化氰消化试验测定心肌总胶原和交联胶原。假设胶原蛋白平均含有13.5%的羟脯氨酸，则数据表示为每毫克干心脏重量中的胶原蛋白微克数。数值为平均值±SE；n个=4只小鼠/组*对与对照组相比<0.05。
讨论
代谢综合征与心血管疾病之间的关系已在临床和实验模型中明确确立(5,37). 尽管有这些观察，ECM修饰酶LOX在MetS相关心脏ECM重塑中的作用仍不清楚。C57BL/6小鼠株已被用作研究饮食诱导肥胖、糖尿病的模型(27)，动脉粥样硬化(21,33)和高血压(24). 虽然用于诱发这些个体疾病的饮食中脂肪含量都很高，但不同饮食的脂肪量和脂肪酸组成差异很大。在当前的研究中，我们表明，对雄性C57BL/6小鼠进行为期6个月的HFHSC饮食治疗，可诱发高胰岛素血症、高血糖、血脂异常和高血压，与MetS患者的代谢紊乱相似。本研究使用该模型研究饮食诱导的MetS对ECM成分和舒张功能的影响。
心肌ECM含有纤维性胶原，可确保相邻心肌细胞的结构和功能完整性。心脏ECM不是静态结构，而是对心肌适应病理应激至关重要的动态实体。细胞外基质稳态的破坏会导致适应性不良的心脏重塑、舒张功能障碍，最终导致心力衰竭。我们证明了用HFHSC饮食治疗6个月后，雄性小鼠心脏间质纤维化的诱导，如胶原沉积增加和交联程度所示。这一观察结果与早期数据一致(1)其中，用高脂饮食治疗雌性大鼠8周与广泛的心肌血管周围纤维化相关。我们的数据表明，纤维化反应与纤维化前基因表达的显著变化无关。然而，饮食诱导的MetS与适度抑制MMP-2活性、显著增加LOX活性以及随后增加的心肌纤维胶原和交联程度相关，从而导致病理性纤维化。值得注意的是，通过P-V环分析评估的心脏功能显示舒张充盈受损和舒张功能障碍。
LOX酶是导致ECM稳态紊乱的关键酶之一，它受到饮食诱导的代谢综合征的影响(). LOX的失调可能是纤维化病理发生和发展的基础(34). LOX是一种新型的含铜胺氧化酶，可引发ECM中胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联。已知LOX是作为前蛋白合成的，以50-kDa的形式分泌N个-糖化原酶。然后由BMP-1将其蛋白水解为30-kDa催化活性成熟酶(34). 最近的分子克隆揭示了LOX家族的存在，该家族由LOX和四种LOX样蛋白组成，具有复杂的组织特异性表达模式和mRNA水平的巨大差异。在心血管系统中高度表达的三种LOX和LOX-like蛋白（LOX、LOXL-2和-3）中，LOX是心脏中最丰富的形式，也是唯一一种使用胶原蛋白作为底物的形式(25,30). 研究表明，LOXL-2在胎儿心脏发育早期大量存在(25)而LOXL-3 mRNA的表达几乎仅限于成人主动脉(25). 我们的数据表明，尽管LOX同工酶的基因表达减弱，但成熟型与前酶型LOX的蛋白质表达比例及其酶功能有所增加。因此，饮食诱导的MetS与LOX mRNA水平的非显著变化有关，这可能是由于LOX转录的表观遗传沉默所致(6). 然而，BMP-1基因表达显著增加，这解释了原-LOX潜伏池的蛋白水解过程增加，因此，尽管mRNA水平不变，喂食HFHSC的小鼠的酶活性增加。然而，BMP-1本身经过翻译后修饰，包括前体蛋白的裂解和糖基化，以转化为功能性蛋白酶(14). 调控BMP-1基因表达及其翻译后修饰的因素在文献中尚未明确定义。我们还证明，在饮食诱导的MetS小鼠中，LOX活性的增加与纤维胶原交联和心室僵硬的增加平行(对<0.05). 此外，我们还发现，LOX酶活性与舒张末期P-V关系（β）斜率呈正相关，后者是心室僵硬的指标(R（右）2= 0.78,). 胶原蛋白交联增加也被证明与左心室僵硬相关(2,40).
目前尚不清楚用于诱导MetS的HFHSC饮食是否会对心脏LOX产生直接影响。然而，代谢综合征的个别成分，如高血压(40)和糖尿病(22)与LOX介导的交联增加有关。MetS通常与血管紧张素II的过度活性有关(10). 血管紧张素II增加大鼠血管平滑肌细胞LOX mRNA水平和分泌酶活性(16). 转化生长因子-β（TGF-β），在MetS中过度表达(4)，还增加LOX表达和活性(29). 有趣的是，TGF-β同时上调纤维连接蛋白的生成(17)参与LOX蛋白水解激活(11)，一种可能参与TGF-β诱导LOX的机制。此外，成纤维细胞生长因子家族（LOX表达的另一调节因子）几个成员的血清水平(7)，在MetS中增加(13,41).
左室高血压重构具有多态性特征，包括间质纤维化，这会增加心肌僵硬，导致舒张功能受损(18). 此外，高血压重塑与LOX酶活性增加和LOX介导的交联有关(40). 因此，在饮食诱导的MetS中观察到的间质纤维化和舒张功能障碍可能部分归因于高血压。这项先导性研究的主要局限性是没有一个降压治疗对照组来阐明高血压对观察到的疗效的贡献。就目前的知识而言，尚不清楚这种心脏ECM重塑在多大程度上可由高血压或MetS的其他个别成分引起。这项研究的另一个弱点是缺乏中间时间点。由于我们专注于LOX酶途径和有限的心脏组织，我们只能评估MMP和TIMP基因的表达以及MMPs的酶活性，而MMP-2活性仅表现出中度抑制。此外，我们很难对喂食HFHSC的超重小鼠进行可靠的经胸超声心动图测量，这可能是由于心包和腹部脂肪组织增加所致。因此，我们只专注于体内P-V环分析。此外，麻醉剂对儿茶酚胺流出的影响可能导致血管抑制和血压下降，如从两组获得的P-V环中观察到的那样。
我们还研究了饮食诱导的MetS对另一种ECM修饰酶MMP的影响。ECM降解受基质金属蛋白酶及其内源性抑制剂TIMP调节。心脏纤维化的临床研究和实验模型报告了MMPs和TIMPs之间平衡的改变，特别是在心力衰竭进展的中间时间点(23). 在本研究中，喂食HFHSC的小鼠左心室组织中MMP与TIMP基因表达的比率较低，这一趋势并不显著。酶谱显示，MMP-2的蛋白水解活性在饮食诱导的MetS中受到中度抑制()，表明ECM退化有所减少。pro-MMP-2细胞表面活化的经典模型是通过形成由膜型-1 MMP、TIMP-2和pro-MMP-2组成的三分子复合物(36). 由于TIMP-2 mRNA水平保持不变，因此观察到的MMP-2活性降低可能是由于膜型1 MMP对前MMP-2的处理减少所致。
总之，我们证明饮食诱导的MetS与左心室胶原交联和间质纤维化增加以及舒张功能障碍有关。我们认为LOX蛋白水解过程的增加及其活性可能是MetS相关ECM重塑的病理生理学决定因素。因此，LOX可能是降低MetS患者僵硬胶原蛋白和改善左心室机械性能的目标。然而，为了更深入地了解LOX在MetS诱导的ECM重塑中的作用，有必要使用MetS的其他模型进行进一步的结构-功能研究。
赠款
本研究部分由国家补充和替代医学中心拨款R21-AT004177（发给R.R.Watson）支持；华莱士研究基金会（致R.R.Watson）；和国家心脏、肺和血液研究所拨款R01-HL-079206（致D.F.Larson）。
参考文献
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