隔室化允许真核细胞通过分离竞争反应和在细胞内特定位置定位酶和底物来调节细胞内功能。有效的区域划分需要动态的蛋白质运输过程，通过该过程，细胞能够建立并维持每个细胞器的特性和功能。酵母的液泡（溶酶体）酿酒酵母在细胞质细胞器的周转、细胞内/细胞外成分的降解和细胞生理的维持中起着核心作用(1). 为了实现这些功能，液泡维持着各种降解酶。常驻水解酶及其底物都通过各种分拣途径到达目的地。空泡水解酶传递到该细胞器的主要途径是羧肽酶Y（CPY），1碱性磷酸酶（ALP）和多泡体（MVB）途径涉及通过部分分泌途径的转运，以及胞质到液泡靶向（Cvt）途径，通过该途径，货物分子被包装为胞质膜结合中间产物(2,三). 在细胞分裂期间，驻留蛋白也通过母体细胞液泡遗传到子细胞(4). 底物通过内吞、自噬和液泡输入和降解途径进入液泡参考文献5). 所有这些过程中的一个共同特征是膜融合。膜融合机制的作用是确保蛋白质定向运动的特异性，同时保持高度分隔的真核细胞内每个细胞器的独特组成。
用于将可溶性水解酶氨基肽酶I（Ape1）传递到液泡的细胞质到液泡靶向途径正在研究中（有关综述，请参阅参考文献。2,5、和6). 在营养条件下，前体Ape1（prApe1(7). 完成后，细胞溶质Cvt小泡将靶向液泡。Cvt囊泡的外膜与液泡膜融合，完整的内囊泡（Cvt小体）进入液泡腔(8). Cvt体最终被驻留的液泡水解酶分解，导致prApe1的释放和成熟。在饥饿条件下，前体Ape1通过另一种称为自噬（Apg）的途径运输到液泡(2,9). 在Apg途径中，部分细胞质被隔离在相对较大的双膜小泡（自噬体）中，这些小泡也以液泡为靶点(7). 虽然Apg是一个降解过程，但自噬缺陷突变体，自动发电机组/自动装置，与重叠无级变速器突变体(10). 形态学和生化分析进一步表明，Cvt和Apg途径使用类似的机制(2,5,9).
为了进一步了解Cvt/Apg途径，我们筛选了prApe1成熟缺陷突变体的基因缺失库。我们发现了两个Cvt/Apg导入所需的突变体，而这两个突变体之前并未涉及这些途径。其中一个基因的产物Ccz1被认为参与了通向液泡的多种运输途径(11). Rab蛋白Ypt7的过度表达可以缓解对钙、咖啡因和锌的敏感性ccz1号机组Δ应变。Ypt7K127E公路突变已被确定为一种抑制ccz1号机组Δ表型(12). 共免疫沉淀数据进一步支持Ccz1和Ypt7之间的物理相互作用(12). 这个周一Δ应变对莫能菌素和布氏菌素A敏感(13)，但在其他方面没有特征。在这项研究中，我们发现缺乏这两种蛋白之一的菌株具有相似的表型。Mon1和Ccz1不仅对Cvt/Apg途径是必需的，而且对其他液泡生物生成过程也是必需的，包括通过CPY、ALP和MVB途径和内吞作用对新合成的液泡蛋白进行分类。生化和形态学证据进一步表明，Cvt/Apg途径在螯合囊泡形成后但与液泡融合前的一个阶段被阻断。这些研究还表明，Ccz1和Mon1共同定位在一个独特的膜上，并且它们在物理上相互作用。最后，我们演示了体内将这两种蛋白质定位到液泡周围隔室和液泡膜，这与它们在融合中的作用一致。
实验程序
菌株、培养基和生长条件
本研究中使用的酵母菌株列于合成最小培养基（SMD）含有0.67%的酵母氮碱，不含氨基酸，2%的葡萄糖，以及所需的营养缺陷氨基酸和维生素。氮饥饿培养基（SD-N）含有0.17%的酵母氮碱，不含氨基酸、硫酸铵和2%的葡萄糖。YPD培养基含有1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖。酿酒酵母菌株在30°C下生长。用于本研究的酵母细胞在适当的SMD培养基中培养至中对数（OD600第0.6页）。
表一
本研究中使用的酵母菌株
| 应变 | 基因型 | 参考 |
|---|
| 6210瑞典克朗 | MATαleu2–3112 ura3–52 his3–Δ200 trp1–Δ901 lys2-801 suc2–Δ9加仑 | (48) |
| CWY3号机组 | 6210瑞典克朗ccz1号机组Δ∷HIS5型 | 本研究 |
| JSY1型 | 6210瑞典克朗周一Δ∷HIS5型 | 本研究 |
| BY4742公司 | 材料αhis3Δ吕2Δ溶血素2Δ尿酸3Δ | 清烟源 |
| ccz1号机组Δ | BY4742公司ccz1号机组Δ∷抗性基因 | 清烟源 |
| 周一Δ | BY4742公司周一Δ∷抗性基因 | 清烟源 |
| D3Y102型 | 6210瑞典克朗真空8Δ | (31) |
| NNY20系列 | 材料一ura3 trp1 leu2 apg1Δ∷LEU2级 | (31) |
| 虚拟专用程序5 | 6210瑞典克朗虚拟专用交换机5 | (48) |
| CWY40型 | 6210瑞典克朗蒸汽m3Δ∷TRP1号机组 | 本研究 |
| WSY99型 | 6210瑞典克朗密码7Δ∷HIS3型 | (49) |
| VDY101型 | 6210瑞典克朗apg7号机组Δ∷LEU2级 | (37) |
| PSY35型 | 6210瑞典克朗MON1-HA公司∷TRP1号机组 | 本研究 |
| PSY36型 | 6210瑞典克朗CCZ1-HA公司∷TRP1号机组 | 本研究 |
| PSY42型 | 6210瑞典克朗1年1次∷HIS3型 | 本研究 |
| PSY44型 | 6210瑞典克朗CCZ1-CFP公司∷抗性基因 | 本研究 |
| PSY45型 | 6210瑞典克朗CCZ1-CFP公司∷KanMX pCUP1-YFP-MON1型∷URA3公司 | 本研究 |
| 第46页 | 6210瑞典克朗CCZ1-GFP公司∷HIS3型 | 本研究 |
| PSY47型 | 6210瑞典克朗MON1-GFP公司∷HIS3型 | 本研究 |
| 电视1 | 6210瑞典克朗第四人民党Δ∷LEU2级 | (50) |
试剂和抗血清/抗体
生长培养基试剂来自Difco实验室（密歇根州底特律）。DNA限制酶、T4 DNA连接酶和小牛肠碱性磷酸酶来自新英格兰生物实验室公司（马萨诸塞州贝弗利）。Tran公司[35S] 标签来自ICN（加利福尼亚州科斯塔梅萨）。氧化还原酶来源于Enzogenetics（Corvallis，OR）。OptiPrep™来自Accurate Chemical and Scientific Corp.（纽约州韦斯特伯里）。完全™EDTA-不含蛋白酶抑制剂从罗氏分子生物化学公司获得。pME3矢量包含葡萄裂殖酵母HIS5营养不良标记物是Neta Dean博士（纽约州立大学石溪分校）赠送的礼物。pFA6a敲除和标记载体包含TRP1号机组,HIS3型，或抗性基因马克·朗廷博士（俄克拉荷马州立大学）慷慨地赠送了这些标记(14). CFP（pDH3）和YFP（pDH5）质粒来自酵母资源中心（华盛顿大学）。FM 4-64染料是从分子探针（尤金，俄勒冈州）获得的。所有其他试剂均来自Sigma-Aldrich。抗Ape1抗血清(15)，优先级1(16)和Pep4(16)已描述。针对Pgk1、Ypt7和Anp1的抗血清分别由Jeremy Thorner博士（加利福尼亚大学伯克利分校）、William Wickner博士（新罕布什尔州汉诺威市达特茅斯医学院）和Sean Munro博士（英国剑桥市分子生物学MRC实验室）提供。抗Pho8、Dpm1和Pep12的抗体从Molecular Probes获得，抗HA抗体从Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）购买。制备抗Mon1、NH的抗血清2对Mon1 ORF的末端（1–585 bp）进行PCR扩增，并与麦芽糖结合蛋白的COOH末端融合。将产生的质粒转化为大肠杆菌菌株BL21。融合蛋白的纯化和抗血清的产生如所述(17).
单倍体基因缺失文库的筛选
A类材料α单倍体基因缺失文库来自ResGen/Invitrogen Corporation（Huntsville，AL）。将该公司提供的突变体接种在YPD平板上，并在30°C下培养12–24小时。收集YPD平板中的细胞，并在50小时内重新悬浮μMURB的l（50 m米NaPO公司4，25米米MES，pH 7.0，1%十二烷基硫酸钠，3米尿素，0.5%β-巯基乙醇，1 m米NaN公司三和0.05%溴酚蓝），并通过玻璃珠裂解和煮沸转化为粗细胞提取物。用抗Ape1抗血清对提取物进行免疫印迹分析。
干扰、表位标记和基因克隆
染色体单月1日和CCZ1号机组通过基于PCR的一步程序删除基因座(18). 简言之，通过PCR从pME3或pFA6a敲除质粒中扩增出相应的营养缺陷型标记，所用寡核苷酸包含标记外的序列，两侧是编码相应ORF开始和结束区域的序列。PCR产物用于转化酵母菌株SEY6210。通过Western blot检测假定的敲除菌株的Ape1表型。染色体HA和荧光蛋白标记也采用了类似的策略。要克隆单月1日和CCZ1号机组基因、ORF及其上游/下游序列均以基因组DNA为模板进行PCR扩增。产生的用于单月1日在编码起始密码子的序列之前包含360bp，在终止密码子之后包含405bp。碎片被消化囊我和Sma公司I并插入囊我和Sma公司用于生成质粒pMON1（416/426）的pRS416/425载体的I位点。用于克隆的PCR产物CCZ1号机组上游约300-bp，下游约700-bpCCZ1号机组ORF。PCR产物用千磅I生成pCCZ1（416/426）。为了构建COOH末端HA表位标记的Ccz1CCZ1号机组以pCCZ1（416）为模板对ORF进行PCR扩增。将得到的PCR产物消化并插入含有3×HA表位的pRS416HA和pRS426HA中(19). 建造NH2-终端YFP融合到Mon1单月1日以pMON1（416）为模板对ORF进行PCR扩增。将所得PCR产物插入pCuYFP（306）中，生成pCuYFP-MON1（306。构造用线性化千磅I并转化为菌株PSY44以替代内源性单月1日pCuYFP-MON1（菌株PSY45）。质粒pCvt19-CFP（414）(20)，pSte3-GFP（316）(21)，pCuGFP-Aut7（416）(22)，pGFP-Pho8（426）(23)和pSna3-GFP（416）(24)如前所述。如有要求，将提供所有寡核苷酸序列和质粒构造的其他细节。
免疫印迹分析、脉冲/大通标记和免疫沉淀
免疫印迹分析基本上如前所述进行(25). 为了对Prc1进行动力学分析，将酵母细胞培养至OD6001.0并转化为球形体。20 OD的球形体600300个细胞再次悬浮μ含1.3的1升SMD培养基米山梨醇，并标有20μTran词[35S] 标记5分钟，然后在含有1.3的SMD中进行追踪反应米山梨醇，0.2%酵母提取物，4米米蛋氨酸和2米米最终密度为2.0 OD的半胱氨酸600/毫升。在指定的时间点和1m处移除样品米NaN公司三添加是为了阻止反应。样品经过5000×克离心3分钟。用10%三氯乙酸分别沉淀所得上清液和颗粒部分。如前所述，将三氯乙酸沉淀物重新悬浮在MURB缓冲液中并进行免疫沉淀(25). 为了对Ape1、Pep4和Ste3进行动力学分析，将酵母细胞培养到OD600在SMD介质中为1.0。电池（20 OD600单位）在300μ1份SMD培养基，并标有20μTran词[35S] 贴上标签5–10分钟，然后在20 OD的最终密度下进行如上所述的追踪反应600/毫升。在指定的时间点取出样品，并用10%三氯乙酸沉淀。粗提取物通过玻璃珠溶解制备，并按照前面所述进行免疫沉淀(25).
Cvt途径和自噬分析
如前所述，测定细胞活力和饥饿曲线以及过氧化物酶体降解率(17). 膜浮选试验基本上是通过上述方法进行的(26)稍作修改。球原生质体来源于周一Δ应变在PS200裂解缓冲液中重新悬浮（20 m米管道，pH 6.8，200 m米山梨醇），含5 m米氯化镁2球体密度为20 OD600/毫升。以13000×克在4°C下保持5分钟。10 OD的颗粒部分600将单位细胞重悬于100μ在含有或不含有0.2%Triton X-100的裂解缓冲液中加入15%的Ficoll-400（w/v）。再悬浮颗粒部分在裂解缓冲液中覆盖1ml的13%Ficoll-400，然后覆盖200μ在裂解缓冲液中加入2%的Ficoll-400。得到的阶梯梯度在13000×克在4°C下保持10分钟。500强μl被指定为浮子分数（F），剩余溶液被视为无浮子分数，梯度颗粒被指定为颗粒分数（P）。三个组分被三氯乙酸沉淀，用丙酮洗涤两次，并通过免疫印迹分析。如前所述进行蛋白酶保护试验(17). 简而言之，对数相培养物在含有5 m米氯化镁2.将裂解产物在13000×g下离心10 min，并在有或无50μg/ml蛋白酶K和/或0.2%Triton X-100。反应在冰上进行30分钟，然后进行三氯乙酸沉淀和免疫印迹分析。
亚细胞分馏和OptiPrep™密度梯度分析
表达pCcz1-HA（416）的Mon1-HA细胞生长至中对数期（OD600=0.6）在SMD介质中。将细胞转化为球形体，并重新悬浮在含有5 m的PS200裂解缓冲液中米氯化镁2以及密度为20 OD的Complete™EDTA无蛋白酶抑制剂混合物600/毫升。预轴承旋转后（500×克，在4℃下持续5 min），将总裂解物进行低速离心（13000×克10分钟），产生上清液（S13）和颗粒（P13）部分。对S13组分进行高速离心（100000×克在4°C下保持30分钟），以生成上清液（S100）和颗粒（P100）部分。所得组分进行免疫印迹分析。为了检测Ccz1-HA和Mon1-HA的膜结合，用1米氯化钾，0.1米纳2一氧化碳三（pH值10.5），3米尿素或1%Triton X-100，如前所述(17). OptiPrep™密度梯度分析是通过修改先前描述的程序进行的(17). 简而言之，表达Ccz1-HA的Mon1-HA菌株生长到中对数期（OD600=0.6）并转化为球形体。在含有1m的PS200中对球状体进行渗透溶解米EDTA，1米米氯化镁2和蛋白酶抑制剂混合物（Complete™EDTA游离蛋白酶抑制剂片，1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑制素A）。将裂解液进行极低速离心（800×克5分钟），以去除剩余完整的球形体。在该预筛选步骤之后，来自35OD的粗裂解物600细胞单位以100000×克在4°C下保持20分钟。最终的总膜分数在200μl溶解缓冲液，然后将其涂敷在含有10–55%OptiPrep™的密度梯度（12 ml，线性）的PS200溶解缓冲液顶部，其中含有1 m米EDTA，1米米氯化镁2，1米米二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂混合物。梯度以100000×克在Sorvall Th-641转子中，在4°C下保持12小时。样品从梯度顶部收集到14个部分。将这些组分进行三氯乙酸沉淀，并用丙酮洗涤两次，然后进行免疫印迹分析。
天然免疫沉淀
与Ccz1-HA共免疫沉淀的方案由先前描述的程序修改而来(12). 简言之，10 OD600用玻璃珠在裂解缓冲液（50m）中对对数相细胞单元进行裂解米HEPES，pH 7.4，150 m米KCl，1米米EDTA，0.5%Triton X-100），添加蛋白酶抑制剂混合物和1 m米苯甲基磺酰氟。在冰上溶解10分钟后，以13000×克在4°C下保持15分钟。至产生的上清液，10μ添加1 l抗HA抗血清，然后在4°C下与蛋白A-Sepharose孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤Sepharose珠共八次。结合蛋白在MURB中洗脱，然后进行SDS-PAGE和Western blot分析。
显微镜
所有用于显微镜检查的菌株均在SMD培养基至中对数期培养。体内如前所述进行FM 4–64染色(27). 使用尼康E-800荧光显微镜（马里兰州德克斯特市Mager Scientific Inc.）进行显微镜分析。图像由ORCA II CCD相机（新泽西州布里奇沃特市哈马松公司）使用Open拍摄实验室3软件（Improvision，Inc.，Lexington，MA）。
结果
Cvt、自噬和吞咽Pexophagy路径需要Mon1和Ccz1
尽管多种多样无级变速器,自动发电机组、和自动装置Cvt和Apg通路中缺陷的突变体已经被分离和分析（在参考文献。5和28)，关于这些途径的许多问题仍有待回答。我们对控制Cvt和Apg途径动态方面的分子机制感兴趣。我们推断，额外突变体的鉴定将进一步深入了解这些过程的蛋白质机制。因此，我们筛选了一个基于prApe1积累的单倍体基因缺失文库，prApe1是一种通过Cvt/Apg途径传递到液泡的货物蛋白。在鉴定的新突变体中，周一Δ和ccz1号机组Δ在prApe1成熟过程中显示完全阻断。尽管周一Δ以前没有报道在Cvt途径中起作用，互补分析表明CCZ1号机组与…等位CVT16型，之前未进行特征化无级变速器基因(10). 这个ccz1号机组Δ突变体最初是由于其对c（c）小鹿，c（c）钙，和z（z）公司(29). 研究还表明，该菌株表现出严重的液泡蛋白分类缺陷。免疫荧光数据表明Ccz1定位于内胚层室，并且已被建议与Rab蛋白Ypt7协同作用(11,12). 尚未发布描述Mon1函数的报告。这个单月1日基因，YGL124c型，编码644个氨基酸的蛋白质，预测分子量为73.5 kDa。数据库搜索表明Mon1与酿酒酵母然而，可能与Mon1具有24-37%同源性的同源物存在于S.pombe公司,秀丽隐杆线虫、和黑腹果蝇.Ccz1没有显著同源物。
当野生型细胞在营养丰富的条件下生长时，大多数Ape1以50-kDa成熟形式存在()，尽管有一小部分作为61-kDa前体存在。相比之下周一Δ和ccz1号机组Δ菌株只积累了Ape1的前体形式。通过在质粒上表达相应基因的单拷贝或多拷贝版本，修复了这些突变体中prApe1处理的缺陷，证实了Mon1和Ccz1在Cvt途径中的重要作用(). 前体Ape1在饥饿条件下通过自噬传递到液泡。我们利用饥饿敏感性分析来确定周一Δ和ccz1号机组Δ菌株能够进行自噬。野生型细胞或特异于Cvt途径的突变体具有耐饥饿性，而自噬缺陷突变体在缺乏氮的情况下失去生存能力(17). 如所示，野生型菌株在检测过程中对饥饿具有抵抗力。相反，周一Δ和ccz1号机组Δ应变，类似于apg1型Δ突变体在SD-N培养基中表现出快速丧失活力。在周一当这些细胞从基于CEN的质粒表达Mon1时，Δ菌株恢复。
这个ccz1号机组Δ和周一Δ菌株在Cvt、自噬和pexophagy途径中有缺陷A类、克隆和表征CCZ1号机组和单月1日.野生型（WT，SEY6210），ccz1号机组Δ（CWY3），以及周一Δ（JSY1）菌株和表达各自单拷贝的敲除菌株(欧洲标准化委员会)或多副本（2μ)质粒在SMD培养基中生长，并通过抗Ape1免疫印迹分析。B类,周一Δ和ccz1号机组Δ菌株对保氮条件敏感。野生型，apg1型Δ和周一Δ应变和周一Δ携带pMON1（416）或野生型的菌株和ccz1号机组Δ菌株在SMD培养基中生长至中对数期，并转移至SD-N培养基。在指定的时间，取下等分样品，一式三份铺在YPD板上。在30°C下培养2天后，计数活菌落的数量。C类,周一Δ和ccz1号机组Δ突变体在诱导自噬时不会绕过prApe1积累缺陷。这个真空8Δ（D3Y102），apg1型Δ（NNY20），ccz1号机组Δ和周一Δ菌株在SMD中生长到中对数期，并转移到SD-N培养基。在指定的时间，取出等分试样并进行针对Ape1的免疫印迹。天,周一Δ和ccz1号机组Δ菌株有缺陷。野生型，ccz1号机组Δ和周一将BY4742背景中的Δ菌株在YPD中生长到中对数期，转移到油酸培养基中诱导过氧化物酶体产生，并转移到SD-N。在指定的时间去除等分样品，并用Fox3抗血清进行Western blot分析。
饥饿敏感性表明自噬在周一Δ和ccz1号机组Δ应变。然而，最近我们已经证明，一些根据这一标准有自噬缺陷的突变体仍然能够在饥饿条件下诱导自噬体的形成。例如aut7年Δ菌株对饥饿敏感，但能诱导SD-N中异常小自噬体的形成(30). 此外，Cvt和Apg途径的某些成分仅对这两条途径中的一条至关重要。例如，Vac8和Cvt9只需要用于Cvt途径，而Apg17似乎只在自噬中起作用(26,31,32). 因此，这些类型的突变体能够在饥饿条件下成熟prApe1。我们通过检测Ccz1和Mon1在营养缺乏条件下prApe1输入中的作用，扩展了我们对自噬的分析。菌株在SMD培养至中对数期，转入缺氮培养基（SD-N），并用Western blot检测prApe1处理的时间进程(). 正如预期的那样真空8Δ应变显示，将细胞转移到SD-N后，prApe1积累缺陷发生逆转apg1型Cvt和Apg通路都有缺陷的Δ突变体由于自噬体形成缺陷而无法处理prApe1。类似于apg1型Δ应变周一Δ和ccz1号机组Δ菌株在饥饿条件下保留了Ape1的前体形式，这表明这两种蛋白质绝对是自噬所必需的。SD-N中prApe1成熟的阻滞与饥饿敏感性表型一致。因此，我们得出结论，Cvt和自噬途径都需要Mon1和Ccz1。
我们以前报道过过氧化物酶体降解途径pexophagy使用与Cvt和自噬途径类似的分子成分(33). 为了研究Mon1和Ccz1是否也需要用于pexophagy，我们通过在野生型油酸中生长细胞来诱导过氧化物酶体的表达，周一Δ和ccz1号机组Δ菌株，然后监测细胞转移到葡萄糖后Fox3的降解。在指定的时间收集粗细胞提取物，并通过Western blot进行检测。在野生型细胞中，SD-N中Fox3水平降低，反映过氧化物酶体降解(). 相比之下周一Δ和ccz1号机组Δ菌株将Fox3维持在初始水平，表明过氧化物酶体降解存在缺陷。因此，我们得出结论，Mon1和Ccz1都是Cvt、自噬和pexophagy途径共享的机制的一部分。
多个真空输送路径需要Ccz1和Mon1
据报道ccz1号机组Δ菌株表现出严重的液泡水解酶分选缺陷和碎片化液泡表型(11). 为了更好地了解液泡蛋白在周一Δ菌株，我们检测了通过各种机制靶向液泡的不同货物蛋白。羧肽酶Y（Prc1）通过CPY途径运输到液泡，该途径包括内质网、高尔基复合体和内体。在野生型菌株中，Prc1在5–10分钟的半衰期内成熟（mPrc1）。在用于此类分析的标准条件下，约5%的Prc1从细胞中分泌出来(). 相比之下，在典型情况下虚拟专用交换机突变体，如虚拟专用程序5，Prc1仍然是前体，大多数以p2（高尔基修饰前体）形式分泌到细胞外部分周一Δ菌株，细胞内部分发现少量mPrc1（～5%）。然而，即使在追捕30分钟后，大多数蛋白质仍以p2形式存在，大约一半错误地定位为细胞外部分(). Pep4也有类似的结果（数据未显示）。Prc1处理缺陷ccz1号机组Δ应变已发布(11). 与发布的数据一致ccz1号机组通过脉冲/追逐分析，Δ应变显示出Prc1分选缺陷，但在稳态条件下累积了大量mPrc1（数据未显示）。mPrc1的稳态积累可能反映了从已达到蛋白酶处理能力的前真空室出口的阻塞(34).
多个液泡运输途径在ccz1号机组Δ和周一Δ应变A类，的周一Δ菌株将Prc1错配至细胞外部分。野生型（WT、SEY6210），虚拟专用程序5、和周一Δ（JSY1）菌株生长到中对数期并转化为球形体。将这些球形体标记5分钟，并在30°C的指示时间内进行非放射性追踪。样品被分离到细胞内(我)和细胞外(电子)用Prc1抗血清免疫沉淀部分，并用SDS-PAGE分离。B类,周一Δ和ccz1号机组Δ菌株积累前体Pho8。野生型，第四人民党Δ（TVY1），ccz1号机组Δ（CWY3），以及周一Δ菌株在SMD培养基中生长至中对数期，并使用Pho8抗血清进行免疫印迹分析。C类，GFP-Pho8到达ccz1号机组Δ和周一Δ应变。野生型，ccz1号机组Δ,周一Δ和蒸汽m3Δ（CWY40）菌株用pGFP-Pho8（426）转化，并在SMD培养基中生长至中对数期，然后进行荧光显微镜观察。天、内吞和MVB小泡积聚在ccz1号机组Δ和周一Δ细胞位于液泡外。野生型，ccz1号机组Δ和周一表达内吞途径标记物Ste3-GFP（316）或MVB途径标记物Sna3-GFP的Δ菌株生长到中对数期，然后进行荧光显微镜观察。驾驶员信息中心差分干涉对比度。
接下来，我们检测了液泡整体膜蛋白Pho8通过ALP途径的传递。在稳态条件下周一Δ和ccz1号机组Δ菌株表现出约50%的Pho8加工障碍，而野生型菌株积累了成熟的Pho8(和参考文献11). 为了进一步检测这两个突变株中Pho8的传递，我们对GFP-Pho8进行了定位。我们使用了蒸汽m3Δ应变作为对照，因为ALP途径需要v-SNARE Vam3。野生型，ccz1号机组Δ,周一Δ和蒸汽m3表达GFP-Pho8的Δ菌株生长到中对数期，并通过荧光显微镜进行检测。类似于蒸汽m3Δ应变，两者ccz1号机组Δ和周一Δ也显示出碎片空泡表型，尽管大量细胞表现出一些相对较大的空泡(). 在野生型细胞中，在液泡膜上检测到GFP-Pho8，表明该水解酶能够正确地传递到液泡。与野生型细胞相比，GFP-Pho8在蒸汽m3Δ应变(). 虽然在蒸汽m3Δ菌株高度破碎，我们能够得出结论，这些荧光点都不在破碎的液泡内。我们发现ccz1号机组Δ和周一Δ菌株在液泡膜上积累了GFP-Pho8，但在其碎片液泡外也显示出一些点状GFP-Pho9点，表明Pho8的传递仅部分受阻(). 通过检测表达Nyv1-GFP的细胞也观察到类似的结果，Nyv1-GFP也通过ALP途径传递到液泡（数据未显示）。这些数据表明，ALP通路在周一Δ和ccz1号机组Δ应变。
除了Cvt/Apg、CPY和ALP途径外，通向液泡的蛋白质也通过内吞和MVB途径转运。我们通过观察Ste3-GFP在周一Δ和ccz1号机组Δ应变。Ste3是一因子受体，并被配体依赖和配体依赖的内吞模式下调(35). 在本研究中，我们检测了配体依赖模式。在野生型菌株中，Ste3-GFP在液泡中广泛积累(). 相反，Ste3-GFP定位于细胞液泡外的多个点状结构周一Δ和ccz1号机组Δ应变。这些结构可能代表内吞囊泡。这些数据表明周一Δ和ccz1号机组Δ应变。最后，我们通过MVB途径检测了Sna3-GFP的定位(24). 与野生型细胞中的液泡腔染色相反ccz1号机组Δ和周一Δ细胞在液泡外显示出大量小点状结构()，可能代表晚期内体/MVB隔室。使用其他MVB途径标记蛋白，包括Phm5-GFP和GFP-CPS，也可以看到类似的结果（数据未显示）。
囊泡与液泡融合需要Ccz1和Mon1
大多数无级变速器,自动发电机组、和自动装置先前发现的突变体对Cvt和自噬途径具有特异性，在其他空泡传递途径中没有缺陷。这些突变体似乎都在囊泡诱导和/或形成阶段发挥作用。然而cvt4型和cvt8型突变体被发现与VPS39/VAM6系列和VPS41/VAM2分别为(25)这表明可能与其产物在液泡蛋白定位中起更普遍作用的基因重叠。因为周一Δ和ccz1号机组Δ突变体在多个液泡传递途径中存在缺陷，我们认为Mon1和Ccz1可能通过其与液泡融合步骤的需求在蛋白质运输途径中发挥一般作用。
为了仔细研究Ccz1和Mon1在囊泡与液泡融合中的拟议作用，我们使用了监测prApe1转运阻断的生化分析(17). 为了确定prApe1是否能够结合膜，我们进行了浮选分析。通过Ficoll阶跃梯度离心溶解的球原生质体的总膜部分。在周一Δ菌株、一部分prApe1和完整的ER膜控制蛋白Dpm1可造粒，并在无洗涤剂的情况下分离成浮子（F）部分(). 相反，细胞溶质蛋白Pgk1仅存在于上清液（S）部分。类似的结果也出现在ccz1号机组Δ应变（数据未显示）。这一结果表明prApe1能够与其靶膜结合。
Cvt囊泡完成后需要Mon1和Ccz1A类，前体Ape1是与周一Δ应变。这个周一Δ（JSY1）菌株生长到中对数阶段并转化为球形体。按照“实验程序”中的描述，通过Ficoll阶梯梯度（有或没有Triton X-100）渗透性溶解球体并离心。含膜浮子(F类)，非浮式(核聚变)、和颗粒(第2页)收集组分并使用Ape1、Dpm1和Pgk1的抗血清或抗体进行免疫印迹。B类，前体Ape1在周一Δ和ccz1号机组Δ应变。这个apg7号机组Δ（VDY101），密码7Δ（WSY99），周一Δ和ccz1号机组Δ（CWY3）菌株生长至中对数期，转化为球形体，然后进行渗透溶解。总裂解物(T型)被分解成上清液(S公司)和颗粒(P（P）)分数为13000×克离心和使用Ape1和Pgk1的抗血清通过免疫印迹分析的部分。其余颗粒组分在没有或存在Triton X-100的情况下进行蛋白酶处理，并使用Ape1抗血清进行免疫印迹。C类，Cvt途径标记GFP-Aut7积聚在液泡外周一Δ和ccz1号机组Δ应变。野生型，ccz1号机组Δ和周一Δ菌株用pCuGFPAut7转化(22). 菌株生长到中对数期，并用荧光显微镜拍摄图像。
为了确定prApe1是否被隔离在完整的Cvt囊泡中，我们接下来进行了蛋白酶敏感性分析。如“实验程序”中所述，对球形体进行渗透裂解，并在不存在或存在洗涤剂的情况下对低速颗粒部分进行外源蛋白酶K处理。这个apg7号机组Δ菌株在Apg12与Apg5结合方面有缺陷，不能形成完整的Cvt小泡/自噬体(36,37). 该菌株在没有洗涤剂的情况下以蛋白酶敏感状态积累prApe1(). Ypt7是一种Rab蛋白，是Cvt囊泡/自噬体与液泡融合所必需的(37)、和密码7Δ细胞积累蛋白酶保护的prApe1。前驱猿1周一Δ和ccz1号机组Δ菌株在没有洗涤剂的情况下也受到蛋白酶保护()表明它积聚在完整的囊泡中。将Pgk1分离到上清液部分证明，蛋白酶保护的prApe1的积累并不是由于低效的球形体裂解。
为了确定prApe1是否存在于细胞溶质囊泡或液泡下囊泡中，我们通过观察GFP-Aut7扩展了我们对Cvt途径的分析体内Aut7是Cvt囊泡和自噬体形成所必需的，并且在完成后仍与这些囊泡相关(22,38). 因此，它可以作为囊泡标记物。与之前公布的数据一致，GFP-Aut7被视为在富培养基中生长的野生型细胞的液泡外积聚的单点结构(,SMD公司). 在饥饿条件下，Aut7被诱导，我们在野生型菌株中观察到GFP-Aut7的明亮液泡腔染色(,SD-N号). 相反，GFP-Aut7在周一Δ和ccz1号机组Δ应变显示出多个点状点，与密码7Δ电池(和参考39). 通过叠加荧光和DIC图像，我们可以确定这两个菌株中的多个点状结构位于破碎的液泡之外。在饥饿条件下，我们在两个突变株中检测到较强的GFP-Aut7信号，表明它们在Aut7诱导中没有缺陷。在两个突变株的液泡外检测到一些可能代表自噬体的较大的双膜结构，但GFP-Aut7似乎与液泡不一致。总的来说，这些数据表明prApe1在两种细胞的完整的胞质小泡中积累周一Δ和ccz1号机组Δ应变。因此，我们得出结论，这些囊泡与液泡的融合步骤需要Ccz1和Mon1。
Ccz1和Mon1是膜相关蛋白质
为了研究Ccz1和Mon1的定位，我们用HA表位标记了这两种蛋白质。COOH末端HA标记不会导致Ccz1或Mon1功能障碍，因为质粒上的各自结构补充了空细胞的prApe1排序缺陷，并挽救了片段空泡表型（数据未显示）。已经表明Ccz1在P13和P100级分中富集(11). 我们决定将Mon1 HA本地化与Ccz1 HA一起检查。将染色体位点标记有Mon1-HA的菌株转化为pCCZ1-HA（416），生长到中对数期，转化为球质体，然后进行渗透溶解。如“实验程序”所述，将溶解的球形体进行速度沉降。细胞溶质蛋白Pgk1主要从S100组分中回收，而液泡膜蛋白Pho8仅位于P13组分中，表明有效分离(). 我们还检查了Ypt7的定位，发现它主要位于P13部分。在P13和P100馏分中回收Mon1-HA；然而，我们发现Ccz1-HA不仅在P13和P100组分中检测到，而且在S100组分也出现了大量，表明该蛋白存在细胞溶质(). 接下来，我们通过检测这两种蛋白质膜结合的稳定性来扩展我们对这两种蛋白的分析。我们发现，用0.1米纳2一氧化碳三（pH值10.5）和3米尿素，而在1米KCl和1%Triton X-100(). 综上所述，这些数据表明Ccz1-HA和Mon1-HA外围附着在相对不溶于洗涤剂的膜室上。洗涤剂中的溶解度不足可能表明这两种蛋白质都与一个大的蛋白质复合物有关。
Ccz1和Mon1是外周膜蛋白A类、Ccz1-HA和Mon1-HA可造粒。用pCCZ1-HA（416）转化Mon1位点（PSY35）上带有HA标签的菌株，生长到中对数期并转化为球形体，然后在含有5 m的PS200缓冲液中渗透溶解米氯化镁2.总数(T型)将部分分离成低速上清液(第13节)和颗粒(第13页)分数为13000×克离心步骤。将S13部分进一步分离成高速上清液(S100标准)和颗粒(第100页)以100000×克使用HA、Pgk1、Ypt7和Pho8抗血清对收集的部分进行免疫印迹。这个星号标志着在Pho8下方迁移的交叉反应带。B类、可造粒Ccz1-HA和Mon1-HA的生化特性。Mon1-HA和Ccz1-HA（PSY36）菌株的球形体按照“实验程序”进行渗透溶解和纺丝。将颗粒部分重新悬浮在单独的缓冲液或含有1米KCL，0.1米纳2一氧化碳三，pH值10.5，3米尿素或1%Triton X-100并分离到上清液中(S公司)和颗粒(P（P）)分数。样品用抗HA抗血清进行免疫印迹。
Ccz1-GFP和GFP-Mon1的体内定位
调查Ccz1和Mon1的作用部位体内，我们构建了GFP融合到COOH末端的菌株单月1日和CCZ1号机组染色体位点的ORF。这些菌株表现出正常的液泡表型，表明表达的融合蛋白具有功能性(). 当细胞生长于YPD至中对数期（并在最小培养基中洗涤）时，在每个细胞的2-5个泡周点中检测到Ccz1-GFP，并显示出微弱的泡膜染色(). 这些GFP染色的斑点结构非常可动，可以看到它们在液泡周围移动（数据未显示）。尽管荧光信号较弱，但Mon1-GFP的染色模式与Ccz1-GFP相似。
体内Ccz1和Mon1的本地化在染色体位点上整合有Ccz1-GFP（PSY46）和Mon1-GFP的酵母菌株在YPD中生长到中对数期，然后在SMD培养基中洗涤和再悬浮(A类)或H2O（B），然后用荧光显微镜检查。Ccz1和Mon1定位于点状液泡周围结构，渗透性休克导致液泡边缘重新分布。驾驶员信息中心差分干涉对比度。C类将带有染色体Ccz1-GFP（PSY46）的酵母菌株在YPD中培养至中对数期，洗涤，并在水中再悬浮5分钟，然后在荧光显微镜前切换到SMD条件。如图所示，SMD治疗后每隔几分钟拍摄一次图像。基于时间推移显微镜，Ccz1-GFP在5分钟内逐渐重新分布到点状结构。由于延时曝光导致的光漂白，液泡边缘染色难以检测。Mon1-GFP获得了基本相同的结果。
在低渗透条件下清洗酵母细胞会导致多叶液泡融合并膨胀。当在显微镜检查之前用水冲洗Ccz1-GFP和Mon1-GFP酵母时，可以看到液泡扩大(). Ccz1-GFP和Mon1-GFP的点状染色模式大部分丢失，并被液泡边缘上增加的信号所取代。此外，通过将低渗治疗转回SMD，我们能够恢复点状染色模式以及Ccz1-GFP和Mon1-GFP的模糊空泡环定位(). 点状图案迅速出现，并在反转渗透条件后5分钟内饱和。因此，我们得出结论，大多数Ccz1-Mon1复合物位于液泡附近的几个膜结构上，可能附着在液泡膜上以实现其功能。
由于这两种蛋白在荧光显微镜下显示出相似的亚细胞分布，我们通过检测YFP和CFP标记蛋白的共同定位来扩展分析。由于在COOH末端用CFP或YFP标记的Mon1染色体显示出非常微弱的荧光信号，我们替换了染色体单月1日具有YFP-MON1号机组在CUP1大学发起人。结果菌株表现出正常的液泡形态(). Ccz1-CFP和YFP-Mon1显示多个点状点，类似于用GFP标记的构建体看到的图案。此外，这两种蛋白质共同定位(). GFP-Mon1和Ccz1-GFP的染色模式与大多数定位于自噬前结构的Apg/Cvt蛋白的单点结构不同(20). 为了确定Mon1和Ccz1是否定位于不同的隔室，我们比较了Ccz1-YFP和Cvt19-CFP的分布。Cvt19是prApe1的受体或适配器(40)定位于自噬前结构(20). 我们发现，与Ccz1-YFP对应的点状点与Cvt19-CFP代表的自噬前结构没有共同定位().
Ccz1和Mon1共同定位于不同于自噬前结构的空泡周围隔室A类，表达YFP-Mon1的菌株PSY45CUP1大学启动子和Ccz1-CFP在YPD中生长到中对数期。用50μ米CuSO公司4显微镜检查前1小时。B类从染色体位点表达Ccz1-YFP，从质粒表达Cvt19-CFP的菌株PSY42在SMD中生长到中对数期，然后在YPD中生长1h。所有细胞在SMD中清洗一次，然后通过荧光显微镜进行检查。
Ccz1和Mon1形成稳定的蛋白质复合物
我们已经证明了ccz1号机组Δ和周一Δ菌株具有相似的液泡蛋白转运缺陷，Ccz1和Mon1都是可丸化的，它们与膜的结合具有相似的生化特性。此外，这两种蛋白质通过荧光显微镜共同定位(). 为了进一步研究Ccz1-HA和Mon1-HA的亚细胞定位，我们按照“实验程序”所述，在OptiPrep密度梯度上解析膜室。离心后，从梯度顶部收集组分，并通过免疫印迹分析。Ccz1-HA和Mon1-HA均在组分8至13中检测到(). 我们将其分布与内膜标记物Dpm1（ER）、Anp1（高尔基）、Pep12（内体）和Pho8（液泡）进行了比较。所有这些蛋白质都显示出与Ccz1-HA和Mon1-HA不同的分馏模式。我们还检查了Ypt7的定位，该定位被认为与Ccz1相互作用，并发现这些蛋白质在组分8和9中重叠，但峰值不同().
Ccz1和Mon1物理交互A类、Ccz1和Mon1共分离，但通过OptiPrep密度梯度从内膜标记蛋白中分离。表达pCCZ1-HA（416）的Mon1-HA菌株（PSY35）通过密度梯度分离进行分析，如“实验程序”所述。使用Dpm1（ER）、Anp1（高尔基体）、Pep12（内体）、Pho8（液泡）、Ypt7和HA的抗血清或抗体对组分进行免疫印迹。B类，Ccz1-HA通过天然免疫沉淀共同沉淀Mon1。野生型，ccz1号机组Δ（CWY3），以及周一Δ（JSY1）菌株用pCCZ1-HA（426）、pMON1（426）和/或pYPT7（424）转化，并生长到中对数相，然后在HEPES天然免疫沉淀缓冲液中进行玻璃珠裂解。等分试样（10μl） 以裂解产物的含量作为负荷控制。如“实验程序”所述，将裂解液与抗HA抗体和蛋白A-Sepharose孵育，并对HA、Mon1和Ypt7进行免疫印迹。
为了扩展这一分析，我们使用联合免疫沉淀法检测了Ccz1是否与Mon1发生物理相互作用。我们在几个菌株背景中表达了pCCZ1-HA（426）、pMON1（426(). 在prApe1成熟方面，各蛋白的过度表达对野生型或突变菌株没有任何显著影响（数据未显示）。用玻璃珠溶解细胞，将细胞裂解液粗品进行Western blot作为负荷对照(,输入). 我们按照“实验程序”中的描述制备了针对Mon1的多克隆抗血清。抗血清在野生型菌株中检测到一个非常微弱的～70kDa条带，并且在表达多拷贝的细胞中显示出该条带的水平大大增加单月1日质粒(和数据未显示）。按照“实验程序”所述，用HA抗血清对细胞进行天然免疫沉淀。然后用HA、Mon1和Ypt7抗体或抗血清对沉淀的免疫复合物（亲和分离物）进行SDS-PAGE和Western blot。在含有过表达Ccz1-HA的野生型菌株中，免疫复合物拉下了大量Mon1染色体(). 免疫亲和信号对Mon1具有特异性，因为在周一Δ菌株在相同免疫沉淀条件下。当Mon1在没有Ccz1-HA的情况下过度表达时，免疫复合物中没有检测到Mon1，表明Mon1的分离依赖于Ccz1(). 当我们使用Mon1抗血清进行免疫沉淀时，也观察到反向相互作用（数据未显示）。此前已发表Ccz1-HA与Ypt7共同免疫沉淀(12). 然而，在这个实验中，我们无法检测到任何Ypt7信号。Ypt7和Ccz1（也可能是Mon1）之间的相互作用可能是暂时的，而Cczl和Mon1之间的相互影响是丰富和稳定的。
讨论
Ccz1和Mon1在通向酵母液泡的多条途径中是必需的
将液泡水解酶Ape1前体形式从细胞质传递到酵母液泡的生物合成Cvt途径是我们研究的主题。我们已经确定了许多无级变速器突变体，发现其中大多数表现出广泛的遗传、生化和形态重叠自动发电机组和自动装置降解自噬途径缺陷的突变体（综述于参考文献。5和28). 为了全面了解Cvt途径，我们通过筛选酵母缺失文库进一步鉴定了prApe1排序缺陷的突变体。利用这一策略，我们确定了Cvt、自噬和pexophagy途径所需的两种新蛋白Ccz1和Mon1(). 为了进一步了解这两种蛋白质的确切作用，我们首先进行了广泛的分析，以确定ccz1号机组Δ和周一Δ菌株在其他液泡转运途径中具有多效性效应。CPY途径涉及通过分泌途径的一部分进行转运，其行程包括上腔室（PVC）/内体。我们发现CPY途径货物蛋白Prc1在周一Δ应变。之前已经显示了类似的分泌表型ccz1号机组Δ应变(11).
高尔基体晚期ALP途径与CPY途径不同；像Pho8这样的蛋白质在到达液泡之前不会通过PVC。我们在这两个突变菌株中发现了Pho8处理的部分缺陷(). 当我们进一步研究GFP-Pho8的定位时，我们在这两个突变体的碎片液泡上观察到嵌合体的出现。相比之下蒸汽m3Δ菌株积累了大量含有GFP-Pho8的小泡，这些小泡在碎片液泡上没有观察到。虽然我们确实在中间囊泡结构上看到一些GFP-Pho8ccz1号机组Δ和周一Δ菌株，大多数GFP-Pho8针对其碎片液泡(). 因此，似乎绕过内体的ALP途径在ccz1号机组Δ和周一Δ应变。部分Pho8加工缺陷可能反映了由于Prc1、Pep4和其他利用CPY途径的水解酶的错误分类导致液泡加工能力降低。这种可能性得到了纯化液泡中50%前体Pho8的观察结果的支持ccz1号机组Δ和周一Δ应变（数据未显示）。Ste3-GFP和Sna3-GFP分析显示内吞和MVB通路中存在阻滞(). 这些数据表明周一Δ和ccz1号机组Δ在多个真空分选途径中具有多效性缺陷。
囊泡融合步骤中的Ccz1和Mon1功能
多个液泡传递途径的缺陷以及在两个突变体中积累的囊泡状转运中间产物的观察表明，Mon1和Ccz1可能在与液泡融合的阶段发挥作用。利用已建立的Cvt/Apg途径模型(28)，我们可以通过检测prApe1状态的生化分析来评估Mon1和Ccz1的作用(17). 在过去几年中，我们将Cvt/Apg途径分解为几个离散的步骤。这些包括囊泡成核和货物隔离、囊泡形成/完成、对接/融合以及在prApe1成熟后的液泡下囊泡溶解(). 因此，我们开发了生化工具来评估突变菌株运输过程中货物蛋白prApe1积累的阶段。膜浮选分析表明，prApe1在周一Δ应变与膜相关(). 此外，我们发现prApe1在周一Δ和ccz1号机组Δ菌株处于蛋白酶保护的形式，表明Cvt复合物的螯合步骤已经完成。因此，周一Δ和ccz1号机组Δ是在多个筛选中分离出的前两个突变体自动发电机组,自动装置、和无级变速器在隔离囊泡完成后起作用的突变体。
Cvt和自噬途径的工作模型产生的囊泡类型取决于营养条件。在营养缺乏的条件下，自噬体在自噬过程中形成。Cvt小泡是在营养丰富的条件下通过Cvt途径生成的。这两种途径的四个一般步骤如下所示在下面插图。Cvt和Apg途径所需的成分是根据其假定作用来指示的。
在囊泡溶解步骤缺陷的菌株中，蛋白酶保护的prApe1可以积聚在液泡腔内的液泡下囊泡中。为了验证ccz1号机组Δ和周一Δ菌株在向液泡输送时存在缺陷，我们研究了GFP-Aut7在两个突变菌株中的分布。Aut7是Cvt囊泡形成所需的成分，其自身定位于Cvt小泡(41). 因此，Aut7是一种有用的囊泡标记物。与野生型菌株中观察到的单个液泡周围（SMD）或管腔（SD-N）点不同，GFP-Aut7定位于液泡外部的多个点状结构中ccz1号机组Δ和周一Δ应变(). 此外，GFP-Aut7在两个突变体中的定位与在密码7Δ应变。Ypt7是一种Rab GTP酶，是多种囊泡类型（包括Cvt囊泡和自噬体）与液泡融合所必需的(37). 综上所述，我们的数据表明，Ccz1和Mon1在自噬体/Cvt小泡与液泡融合阶段发挥作用。
Ccz1和Mon1在融合中的分子功能
Ccz1和Mon1都是外周膜蛋白(). 有一个额外的Ccz1胞浆池(). 这两种蛋白质共同定位于密度相对较高的隔间，与大多数内膜标记物的峰值位置不同(). 这两种蛋白质似乎都起到了稳定的蛋白质复合物的作用()在本研究中称为Ccz1-Mon1复合物。同样，体内荧光标记的Ccz1和Mon1的检测表明，Ccz1-Mon1复合物定位于重叠的空泡周围点结构(). 先前公布的免疫荧光数据表明，Ccz1与内体标记Nhx1共定位(11)，表明这些点可能代表某种内体/PVC结构。既不是定位于被认为是Cvt囊泡/自噬体合成位点的自噬体前结构的蛋白质，也不是供体膜的位点(). 我们还观察到Mon1和Ccz1的微弱液泡膜染色，表明这些蛋白质可能靶向液泡膜以实现其融合功能。虽然我们在OptiPrep密度梯度中没有观察到Ccz1和/或Mon1的液泡峰，但我们不能排除它们与液泡的关联相对较弱并且在生化过程中丢失的可能性。Cvt18也有类似的表型，在球状体裂解后从液泡中消失(42).
Cvt/Apg途径中所涉及成分的已发布数据摘要如所示在融合步骤中，SNARE蛋白包括Vam3(43)，Vti1型(44)和Vam7(45)需要Cvt囊泡和自噬体与液泡融合。Ypt7，Rab GTPase(37)，及其提议的效应复合物，称为C类Vps/HOPS（同型融合和空泡蛋白分选）复合物，包括Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41(25,46)，也是这一步中必不可少的机器。在Cvt囊泡/自噬体融合步骤所需的这些已鉴定成分中，当它们从基因组中删除时，没有一个保留正常的液泡表型。另一方面，大多数但并非所有表现出液泡破碎表型的突变体都有Cvt/自噬途径缺陷。例如，尽管千卡1Δ菌株表现出片段化液泡表型，积累了成熟型Ape1(参考47).2同样，一些虚拟专用交换机突变体，如虚拟专用程序5有破碎的液泡，但prApe1的输入基本正常(15).
在本研究中，我们介绍了新型Ccz1-Mon1复合物，该复合物在Apg/Cvt途径的融合步骤以及涉及囊泡与液泡融合的大多数其他途径中发挥作用。由于Ccz1-Mon1复合体在液泡的生物发生和功能中起着明显的普遍作用，因此研究它是否是液泡融合的基本机制的一部分非常重要。例如，Ccz1-Mon1复合物的特定分子作用是什么？据报道，Ccz1与Ypt7相互作用(12). Ccz1-Mon1复合物也是Ypt7效应物复合物的一部分吗？尽管我们的共免疫沉淀数据没有再现Ccz1-HA和Ypt7相互作用的已发表结果，但我们认为这种相互作用是短暂的，而Ccz1-Mon1复合物是非常丰富和稳定的。我们目前正试图确定Ccz1-Mon1复合物在Cvt和Apg途径中的具体作用。安在体外分析将进一步了解它们在囊泡融合机制中的作用。
