Bcl-2调节的细胞凋亡开关：机制和治疗潜力

摘要

引言

程序性细胞死亡在发育和组织稳态中都起着关键作用。事实上，在免疫系统中，细胞凋亡形成了免疫储备，精炼并终止了免疫反应[1*]。由于凋亡受损可能导致自身免疫或恶性肿瘤，因此人们对揭示其控制机制和探索其提供的治疗方案有着浓厚的兴趣。

凋亡是由caspase家族的半胱氨酸蛋白酶在两条不同但汇合的途径中的顺序激活引起的[2,三]。这个外源途径当配体介导的质膜上肿瘤坏死因子家族“死亡受体”的三聚化将衔接蛋白FADD和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶招募到多蛋白复合物中时，激活半胱氨酸蛋白酶-8（和人类的半胱氨酸水解酶-10）。这个内在的途径（也称为“线粒体”或“应激”途径）激活支架蛋白Apaf-1上的Caspase-9，当细胞色素c从受损线粒体释放出来，以应对各种应激，包括细胞因子剥夺和DNA损伤。这些启动子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶可以裂解并激活效应子半胱天冬酶（-3、-6和-7），通过裂解多个关键细胞蛋白来介导细胞破坏。

内在途径由Bcl-2蛋白家族控制，该家族构成一个三部分调控盒[4*]。Bcl-2本身是通过染色体易位发现的一种癌蛋白，标志着人类滤泡性淋巴瘤，它抑制细胞凋亡，其近同源物Bcl-x也是如此_L（左）、Bcl-w、Mcl-1、A1和（人类）Bcl-B。相比之下，其他两个亚组促进细胞凋亡：一个亚组包括Bax和Bak（以及研究较少的Bok），它们也类似于Bcl-2，尤其是在三个“BH”中(B类第2类H（H）omology）域，而另一组，包括Bim、Bad、Bid、Bik、Bmf、Puma、Noxa和Hrk，只共享BH3域。当被应激信号激活时，这些“BH3-only”蛋白将该结构域，即两亲性α螺旋插入到原存活亲属的疏水沟槽中[5]。这种耦合作用启动细胞凋亡，但承诺需要激活Bax和/或Bak[6,7]，然后在细胞内膜（包括线粒体外膜）上形成寡聚物，从而干扰其完整性。

在回顾Bcl-2家族在细胞凋亡中的作用时，我们将主要关注两个备受关注的领域：交战的Bcl-2派系之间的相互作用如何使细胞凋亡这一棘手问题，以及靶向该家族作为治疗癌症以及自身免疫和病毒诱导疾病的新方法的令人兴奋的前景。我们还简要讨论了最近的证据，即该家族也影响自噬和线粒体形态。最近的综述提供了关于Bcl-2家族和凋亡的进一步背景[1*,4*,8,9*]包括随附文件。

扳动生死开关

在定量研究显示出显著差异之前，人们认为只有BH3激活的蛋白质会不加区分地与所有生存前蛋白结合[10**]。Bim、Puma和tBid（激活的截短型Bid）确实与所有促生存蛋白紧密结合，但其他仅与亚群相关[10**]。例如，Noxa仅使用Mcl-1和A1，Bad仅使用Bcl-2和Bcl-x_L（左）重要的是，杂乱结合物比选择性结合物杀灭细胞的能力强得多，但互补结合物Noxa和Bad的结合容易诱导细胞死亡[10**]。这些发现表明，有效的凋亡需要中和多种促生存蛋白。

BH3-only蛋白明显作用于Bax和Bak的上游，因为它们不能诱导缺乏Bax和Bak的细胞凋亡[6,7]。然而，它们在激活Bax和Bak中的作用备受争议。在直接激活模型(图1A)，一种仅含BH3的蛋白质亚群，称为活化剂，建议直接与Bax和Bak结合以促进其活化[11,12*,13,14*,15,16*]。假定的激活剂包括Bim和tBid[11,12*,13,14*,15]也许还有美洲狮[16*,17]尽管这一直有争议[12*,13,18]。在这个模型中，剩下的BH3-only蛋白质被称为敏化剂，通过与促生存蛋白结合并释放任何结合的Bim或tBid来直接激活Bax和Bak发挥作用。

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图1

关于BH3-蛋白如何激活Bax和Bak的两个模型。(A类)在直接激活模型[11]，指示的活化剂仅BH3蛋白通过其BH3结构域（红三角）直接与Bax和Bak结合并激活它们，而敏化剂BH3-only蛋白质（例如Bad或Noxa）只能结合促生存蛋白质，只能取代活化剂来自生存前蛋白。(B类)在间接活化模型[10**,19**,20**]BH3-only蛋白只与促生存蛋白结合。由于杂乱结合物（Bim、tBid、Puma）可以中和所有促生存蛋白，因此每一种都可以很容易地触发Bax/Bak活化，而任何选择性结合物（如Bad）必须与互补结合物（例如Noxa）共同表达。

这个间接激活模型(图1B)相反，建议所有BH3-only蛋白仅通过与其生存前亲缘结合发挥作用，从而阻止细胞生存的守护者抑制Bax和Bak[10**,19**,20**,21]。在这个模型中，Bim、tBid和Puma是仅有BH3的最有效的蛋白质，因为它们可以参与所有促生存蛋白质[10**].

最近的几项发现强烈挑战了直接活化模型[20**]。首先，没有Bak与任何BH3-only蛋白共同免疫沉淀。其次，没有Bax可以检测到与Bim的生理相关形式（Bim_EL公司和Bim_L（左）)在死亡细胞中没有与Bim共免疫沉淀。第三，尽管tBid和一种次要的Bim同种型（Bim_S公司)弱绑定Bax，tBid和Bim_S公司携带BH3突变，阻止与Bax结合，但保持与生存蛋白的正常结合，仍然与杀手一样有效。最能说明问题的是，在对几种凋亡刺激的反应中，或是对Noxa和Bad的强制联合表达，缺乏Bid和Bim的细胞与野生型细胞一样容易死亡，甚至这些细胞中的RNAi下调Puma也不会影响由多种刺激驱动的凋亡[20**]。因此，没有一种假定的仅激活BH3的蛋白质似乎是细胞凋亡所必需的。

小鼠遗传研究也有利于间接活化模型。缺少Bim和Bid的老鼠[20**]或Bim和Puma[22]，看起来正常，其细胞对某些凋亡信号保持正常敏感。上直接活化模型，缺少这些活化剂应该阻止细胞凋亡并促进严重的发育异常，就像缺乏Bax和Bak的小鼠一样[23].

一些病毒Bcl-2同源物可能被选择为对BH3-only调节器的抑制具有抵抗力，也通过结合和抑制Bax和Bak发挥作用[24]，进一步支持间接活化模型。值得注意的是，黏液瘤病毒M11L是一种与Bcl-2缺乏序列同源性的抗凋亡蛋白，具有极其相似的3D折叠[25*]和基于结构的突变表明，其关键结合靶点是Bax和Bak，而不是仅BH3蛋白。

总之，这些发现表明，细胞凋亡并不依赖于任何已知的仅BH3蛋白对Bax或Bak的直接激活(图1A). 然而，在某些情况下可能会发生直接激活。Bax与tBid协同裂解无蛋白脂质体[26]或与Bim或Bid的BH3肽在高浓度下（例如>10微摩尔）[12*]或者，如果这些肽以化学方式“钉合”成α螺旋和/或以人工方式靶向细胞膜，则其水平要低得多[14*,15]。也许Bim或tBid的直接结合有助于细胞凋亡的放大步骤。

违约死亡

在间接活化模型中，凋亡是默认途径，Bcl-2生存前蛋白主要通过抑制Bax和/或Bak的激活发挥作用(图2). 在小鼠个体生存基因失活时观察到的不同表型（参见[4*]以及Opferman在本期中的评论）可能表明，在不同的细胞类型中，特定的促生存蛋白是Bax/Bak的主要保护蛋白。例如，Bcl-x_L（左）/Bak开关主要控制无核血小板的寿命[27个**]。暴露于BH3模拟物的血小板可使Bcl-x失活_L（左）（见下文）发生凋亡，血小板水平降低bcl-x公司杂合子或携带不稳定低形态Bcl-x的小鼠_L（左）伴随的Bak缺乏改善了突变体。推断是Bcl-x_L（左）是血小板存活率的限制因素，一旦正常周转率下降到限制Bak的阈值以下，释放的Bak就会驱动细胞凋亡[27**].

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图2

生存前家庭成员对Bak（顶部）和Bax（底部）的约束模型[19**,20**,21]。(A类)在未受干扰的细胞或凋亡信号的早期，有人建议小部分Bak和Bax分子获得一种“引物”构象，在这种构象中，它们的BH3结构域是可访问的，但被指示的促生存蛋白（也可能是A1）参与。启动可能需要一个独立的未确定信号，特别是从细胞溶质中招募Bax。(B类)在凋亡细胞中，一旦BH3-only蛋白（“BH3”）或BH3模拟物与适当的促生存蛋白结合，释放的启动物Bak或Bax可以使寡聚化成核，从而使线粒体外膜渗透，从而使细胞发生凋亡。促生存蛋白似乎也有一种不依赖于Bax/Bak BH3结构域关联的约束模式（见正文）。

生存前Bcl-2蛋白对Bax和Bak的抑制部分依赖于直接结合[19**,20**]。在健康细胞中，Bak可以与任一Mcl-1结合[28]或Bcl-x_L（左）（尽管出乎意料的是，不是Bcl-2），并且这种相互作用似乎需要Bak BH3结构域[19**]。为了启动凋亡，BH3-only蛋白似乎从这些促生存蛋白中取代了Bak。重要的是，当且仅当Mcl-1和Bcl-x都存在时，Bak才能导致细胞死亡_L（左）被Noxa plus Bad等灭活[19**]。Bax似乎也部分受到与生存蛋白直接相互作用的限制[20**]。它们之间的联系的重要性长期以来一直受到质疑，因为它通常只能在非离子洗涤剂中检测到，因为非离子洗涤器改变了Bax的构象，可能是模仿其活化作用[29]。然而，最近的杀灭试验已经证实，BH3蛋白对多种生存前蛋白（包括Bcl-2）的中和作用对于Bax的激活是必要的，而且显然是足够的(图2) [20**].

鉴于已知Bax的结构，生存前蛋白如何抑制Bax和Bak[30]和Bak[31]BH3域被埋葬了吗？一种建议是，在健康细胞中，一小部分Bax和Bak（见下文）处于“启动”状态，其BH3结构域暴露但受到与促生存蛋白结合的限制[19**] (图2). 任何引发的Bax都可能存在于线粒体膜上，因为胞质形式是单体的[32]。Bax和Bak的启动型构象可能在凋亡信号的早期形成，而不是预先存在，自发形成或响应独立的细胞毒信号[20**]。例如，Bax的磷酸化可能调节其向膜的转运[33,34].

生存前蛋白也可能通过第二种未知机制限制Bax和Bak，而不需要通过Bax/Bak BH3结构域将其结合。已经鉴定出Bak和Bax的BH3突变体，它们不能与它们的促生存亲属可检测地结合，但在细胞毒性刺激下仍然具有功能[16*]（J Fletcher、DSC Huang和JMA，未发表的结果）。

BH3类药物的前景

由于大多数肿瘤都有p53通路的缺陷或Bcl-2同源物的过度表达，人们对诸如BH3结构域等结合一个或多个Bcl-2同系物并触发细胞凋亡的抗癌药物的潜力越来越感兴趣[4*,9*]。这种“BH3模拟物”应该比作用于上游的抗肿瘤药物更有效。此外，BH3选择性[5,10**]预示着以维持特定肿瘤类型所需的Bcl-2同源物为靶点，保留更多正常细胞的前景。这种药物也可能适用于某些自身免疫性疾病，也许也适用于表达应答性vBcl-2同源物的病毒感染。

虽然很少有药物是肽，但BH3肽被化学主食限制为α螺旋[14*,35]或添加非天然氨基酸[36,37]，可能有潜力。装订的Bid BH3肽激活Bax的能力，至少在体外[14个*]这可能意味着Bax（或Bak）也可以作为靶点，尽管这会杀死更多的正常细胞，而不是与特定的促生存蛋白结合的化合物。

小型有机BH3仿制品似乎更有前景。基于结构的方法导致了ABT-737，它与Bcl-2，Bcl-x强烈结合（低nM亲和力）_L（左）和Bcl-w，但不适用于Mcl-1或A1[38**]。ABT-737被证明是B淋巴细胞肿瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）以及小细胞肺癌细胞系的多种样本的单一细胞毒性因子。值得注意的是，它在小鼠异种移植中诱导了肺癌的稳定消退，且副作用最小[38**]。它还能杀死AML细胞，但不能杀死正常的造血祖细胞在体外以及无副作用的异种移植中的迟发性白血病[39].

与其他六种假定的BH3模拟物不同，ABT-737以基于机械的方式表现，因为它避免了缺乏Bax和Bak的细胞[40*]。值得注意的是，具有高水平的Mcl-1的细胞（该药物不结合）比那些低水平的Mcl-1的细胞更难处理（相比之下图3A和B) [39,40*,41,42个*,43]表达频率较低的A1也促进了一些抗性[40*]。然而，通过不同的策略降低短寿命Mcl-1的表达，其中一些策略具有潜在的临床应用价值，因此具有敏感性[39,40*,41,42个*,43]。有趣的是，该药物很容易克服高水平的Bcl-2[40*]。事实上，大量的Bcl-2可能会导致CLL等肿瘤更多敏感，通过隔离Bim等高水平的潜在杀手（可能由致癌应激引起），药物可以释放(图3C) [44]。因此，ABT-737本身应对低Mcl-1和A1的肿瘤有效，即使面对高Bcl-2，如果与阻止Mcl-1合成、促进其降解或使其失活的药物联合使用，可能会证明更广泛有效。

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图3

肿瘤细胞对与Bcl-x紧密结合的选择性BH3类似物ABT-737（红色箭头）的耐药性/敏感性模型_L（左）、Bcl-2和Bcl-w，但不适用于Mcl-1或A1。(A类)高Mcl-1（深蓝色）使细胞变得难熔，因为Mcl-1可以捕获Bcl-x释放的Bak_L（左）通过药物。（B） 在含有少量Mcl-1（浅蓝色）（或A1）的细胞中，释放的Bak可以启动凋亡。（C） 高Bcl-2（或Bcl-x_L（左）)在许多肿瘤中发现可以隔离高水平的Bim[44]防止Bim诱导细胞凋亡。矛盾的是，这实际上可以增强敏感由于ABT-737从Bcl-2（或Bcl-x）释放的Bim_L（左）)可以使ABT-737-敏感性Mcl-1（或A1）失活，释放Bak以驱动细胞凋亡。

BH3模拟物也可能被证明是常规治疗中的重要佐剂。ABT-737和Bcl-x_L（左）-特定A-385358[45]细胞对多种化疗药物显著敏感，部分原因是Mcl-1降解[38**,39,40*,41,42,46,47*]。例如，Bim和Bad介导伊马替尼对CML细胞的杀伤，与ABT-737联合治疗可能会增加一些难治性疾病患者的反应[47*]。因此，BH3模拟物可能允许低剂量的常规药物或更持久的反应，除非出现严重的不良反应。口服ABT-737衍生物的一期临床试验已经开始，特征不太明显的GeminX广谱BH3模拟物GX15-070的二期临床试验也已开始[48].

Bcl-2家族与自噬和线粒体形态的联系

自噬是一种古老的机制，饥饿的细胞通过逐渐将细胞器和细胞质元素靶向溶酶体进行消化来产生能量并阻止死亡。过度的自我蚕食可能是程序性细胞死亡的第二种形式[49*,50]。值得注意的是，Bcl-2和Bcl-x_L（左）与进化保守的自噬诱导因子Beclin-1相关，Beclin-1是一种单倍体不足的肿瘤抑制因子[51]，并抑制自噬[52**]。抑制可能需要Bcl-2定位于内质网（ER）[52个**,53]。值得注意的是，Beclin-1中的BH3域调节其关联[54].

自Beclin-1:Bcl-x_L（左）关联性低（对于BH3-蛋白，1–2μM与低nM）[54]推测由应激（或某些BH3模拟物）诱导的BH3-only蛋白可以取代Beclin-1，使细胞容易自噬和凋亡(图4). 奇怪的是，如果凋亡被阻断，例如由于缺乏Bax和Bak，对营养素/细胞因子缺乏的自噬反应会延长生存期，尽管不是无限期的[49*,52**]而对细胞毒性化合物（如足叶乙甙）的作用主要是自噬细胞死亡[55**] (图4). 因此，操纵自噬可能会影响治疗，但无论是促进还是抑制[56]将更加有效，有待确定。

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图4

通过Beclin 1和Bcl-2同源物实现凋亡和自噬的潜在耦合。该模型假设，在有利的环境中，诸如Bcl-2和Bcl-x等促生存蛋白_L（左）通过隔离Beclin 1，防止其诱导自噬，似乎在ER上[52**,53]。如果是这样的话，仅BH3蛋白（或BH3模拟物）与促存活蛋白的结合应该会触发自噬和细胞凋亡。在营养限制或细胞因子缺乏等情况下，自噬通过确保足够的ATP水平暂时延长生存期[49*,52**]但对细胞毒性药物，包括一些用于化疗的药物，它似乎反而促进了自噬细胞的死亡[55**]。这种二分法是如何控制的尚不清楚。

Bcl-2家族独立于其凋亡作用，似乎影响线粒体形状，反映了持续分裂和融合过程之间的平衡[57]。然而，矛盾的是，尽管Bax和Bak的缺失或生存前亲属的表达抑制了细胞凋亡，但前者促进了细胞分裂[58]和后一种融合[59,60]。无论如何，大多数证据表明线粒体的裂变机制对线粒体的通透性或凋亡是不需要的[57,61].

难题和争议

令人惊讶的是，大多数Bax分子可能会从细胞质转移到细胞膜之后半胱天冬酶被激活[62*,63,64]。在缺乏Caspase-3和-7的细胞中，Bax移位和细胞色素c释放较慢，这意味着存在蛋白水解扩增环[62个*]。可以想象，这些活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶通过裂解Bcl-2生存前蛋白或通过全长Bid生成tBid来增强初始反应。无论如何，这些发现表明，即使在缺乏Bak的情况下，细胞凋亡只需要很小比例的Bax[63].

一些Bcl-2家族成员，包括Bcl-2和Bak，不仅存在于线粒体上，还存在于内质网/核膜上，在那里它们可以调节细胞溶质钙²⁺水平。Bcl-2/Bcl-x协会_L（左）据报道，肌醇三磷酸受体1型（InsP3R）增加了钙的渗漏²⁺离子进入胞质溶胶[65,66]。Bax和Bak还可以通过与肌醇需要的内核糖核酸酶1alpha（IRE1alpha）的细胞溶质域结合来调节ER未折叠蛋白反应[67]。内质网的凋亡信号是否必须通过线粒体传递尚不确定。

Bid丢失主要影响外源性途径，但最近有相互矛盾的报告表明，Bid可能对抗或增强复制应激或基因毒性损伤导致的细胞凋亡[68,69]与这些报道相反，Bid似乎对DNA损伤诱导的凋亡和细胞周期阻滞都是不可或缺的[70].

结束语

生物化学和遗传学证据现在都有力地支持了这样一种假设，即BH3蛋白主要通过与它们的亲生性亲属接触来触发细胞凋亡(图1B)，释放Bax和Bak(图2) [10**,19**,20**,21]。然而，在体外脂质体破坏的数据[12*,14*]和一些突变蛋白[16*]，认为某些BH3-only蛋白质，如tBid，可以直接激活Bax/Bak(图1A). 因此，直接激活可能仍有作用，可能在线粒体渗透开始后放大凋亡信号。促生存蛋白究竟是如何抑制Bax和Bak的，目前尚不清楚，因为需要更多的证据来证明推定的“启动”Bax/Bak(图2)并阐明上述假设的“非关联”约束的机制。

BH3-模拟物的临床前研究，尤其是ABT-737，表明这些新制剂将为肿瘤学家的医疗设备提供有价值的补充(图3). 最终，我们设想了一组BH3模拟物，针对不同的Bcl-2同源物或其组合。目前尚不清楚针对多个或个别家庭成员的战略是否最有效，但两者都可能找到重要的利基。BH3模拟物也可能触发自噬(图4)提出了新的问题和前景。

致谢

脚注

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