细胞因子介导的SDF-1部署通过招募CXCR4诱导血运重建⁺血管细胞

细胞因子缺乏小鼠的新生血管受损

为了研究可溶性细胞因子在缺血性血运重建中的作用，我们使用可溶性造血细胞因子释放受损的小鼠遗传模型，包括Thpo公司^−/−27，TPO受体缺乏(Mpl公司^−/−)²⁸缺乏GM-CSF和G-CSF的小鼠(Csf2型^−/−Csf3型^−/−)²⁹。我们还研究了百万像素9^−/−老鼠^5,30其中，膜Kit-ligand（mKitL）中sKitL的释放受损，导致血运重建严重缺陷³¹。

虽然血小板和巨核细胞Thpo公司^−/−和Mpl公司^−/−小鼠的野生型水平低于90%，这些小鼠没有表现出任何自发性出血素质¹⁹缺血性血运重建受损Thpo公司^−/−(图1b)和Mpl公司^−/−老鼠(补充图1与野生型控件相比。肌肉注射或静脉注射野生型TPO(图1b)或Thpo公司^−/−老鼠(图1c)迅速恢复血运重建。Thpo公司^−/−用重组TPO（rTPO）进行全身治疗的小鼠显示，缺血后肢腓肠肌和收肌的血管密度增加了五倍，肌肉坏死较少(补充图1). 此外，与AdNull处理的对照组相比，腺病毒介导的sKitL（AdsKit L）、mKit L（AdmKitL）、GM-CSF（AdGM-CSF）或EPO（AdEPO）增强了野生型小鼠的血管恢复(图1d，e).Csf2型^−/−立方英尺^−/−小鼠在缺血性血运重建方面表现出轻微缺陷，通过全身注射AdGM-CSF可以有效地挽救这种缺陷(图1f)或AdEPO（未显示数据）。

用各种造血细胞因子治疗的小鼠显示出缺血性血运重建的改善程度。TPO和sKitL使血管恢复率分别提高了1.8倍和2倍，而EPO或GM-CSF仅使缺血性血运重建率提高了1.3倍(图1g). 血浆细胞因子的升高也遵循类似的趋势，诱导后肢缺血3d后TPO和sKitL的水平是EPO和GM-CSF的2.3倍(图1a，h). 这些数据表明，后肢缺血导致血浆造血细胞因子水平的分级升高。

血浆TPO升高促进肿瘤新生血管

为了研究TPO在病理性血管生成中的作用，我们将包括小鼠Lewis肺癌（LLC）、B16黑色素瘤、B6RV2淋巴瘤和EL-4胸腺瘤在内的同基因肿瘤细胞系移植到皮下Thpo公司^−/−,Mpl公司^−/−或野生型小鼠(补充图2在线）。移植瘤的生长速度在Thpo公司^−/−小鼠与野生型对照组的比较。TUNEL检测显示细胞凋亡增加，肿瘤部位新生血管密度降低Thpo公司^−/−与野生型对照相比，用LLC移植的小鼠。肿瘤血管Thpo公司^−/−小鼠组织紊乱，局部出血。移植肿瘤Thpo公司^−/−或Mpl公司^−/−小鼠向肺部和肾脏转移的倾向也降低。静脉注射AdTPOThpo公司^−/−小鼠将肿瘤生长和血管密度恢复到野生型水平，支持TPO通过全身效应促进血管生成的观点，可能是通过动员和招募骨髓源性促血管生成细胞。

sKitL在中恢复血运重建百万英镑9^−/−老鼠

为了了解血浆中造血细胞因子升高支持新生血管形成的机制，我们研究了百万英镑9^−/−小鼠，其膜结合形式（mKitL）的sKitL释放受损³⁰。我们假设百万英镑9^−/−sKitL的系统释放减少会减弱CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞。我们在百万英镑9^−/−老鼠³¹评估sKitL在支持血管细胞动员至缺血肢体中的作用。

股动脉结扎后四周百万英镑9^−/−小鼠，血流恢复减弱到野生型水平的50%(图2a)导致血管密度降低(图2b)、肿胀、萎缩、坏死，以及随后缺血后肢的自体截肢(图2c). 组织学检查显示百万英镑9^−/−小鼠，而野生型小鼠的新生血管恢复程度正常(图2b、c). 为了确定缺血再血管化的缺陷是否是由于sKitL释放受损所致，我们发现sKitL-的血浆升高百万英镑9^−/−结扎后小鼠数量减少百万英镑9^+/+老鼠(图2d). 这一发现使我们假设，肌肉内注射sKitL（而非mKitL）在百万像素9^−/−小鼠可能会逆转血运重建缺陷，因为我们预计mKitL不会提高血浆sKitL水平百万英镑9^−/−老鼠。sKitL将肌内注射引入缺血肢体(图2e、f)或全身注射(图2g)足以恢复新生血管密度(图2g)并有效扭转血运重建缺陷(图2e，g)英寸百万英镑9^−/−老鼠。相反，直接将AdmKitL局部注射到百万英镑9^−/−小鼠血浆sKitL水平没有增加(图2h)并且对增强灌注恢复没有显著影响(图2e，g)或血管密度(图2g)导致肌肉坏死(图2f，h). 然而，向野生型小鼠注射AdmKitL导致sKitL的血浆升高(图2h)并有效恢复血运重建(图2e). 这些数据表明，sKitL的系统性血浆升高对于加速野生型小鼠的缺血性血运重建和逆转小鼠的血管生成缺陷至关重要百万英镑9^−/−老鼠。

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图2

sKitL而非mKitL恢复血管生成缺陷患者的缺血再血管化百万英镑9^−/−老鼠。(一)激光多普勒灌注率在百万英镑9^−/−小鼠与百万英镑9^+/+控件(n个=每组12人*P（P）< 0.05). (b条)血管密度（CD31⁺细胞/肌纤维）显著减少百万英镑9^−/−小鼠与百万英镑9^+/+控件(n个=每组12人*P（P）< 0.005). (c（c）)结扎后28天，缺血足垫出现严重肿胀、溃疡和坏死百万英镑9^−/−与相比百万英镑9^+/+鼠标（上部面板）。H&E染色百万英镑9^+/+小鼠显示血管肌生成恢复（中间面板；原始放大倍数，×100）。百万英镑9^−/−小鼠出现活组织丢失，随后出现坏死和脂肪替代。后肢肌肉切片的CD31（PECAM-1）染色显示百万英镑9^−/−老鼠（底部面板；原始放大倍数，×400）。(d日)后肢缺血诱导血浆sKitL升高百万英镑9^+/+但不在百万英镑9^−/−(n个=每组6人*P（P）< 0.05). (e（电子）)腺病毒输送mKitL（AdmKitL，单剂量10⁸p.f.u.）增加血流百万英镑9^+/+但不是百万像素9^−/−老鼠(n个=每组5人；P（P）< 0.05). 腺病毒给药sKitL（AdsKitL，单剂量10⁸p.f.u.）加速缺血再血管化百万英镑9^−/−老鼠。对照组小鼠注射10⁸AdNull的p.f.u。(（f）)H&E（左侧面板；原始放大倍数，×100）和CD31（右侧面板；原始扩大倍数，×400）染色百万英镑9^−/−结扎28天后，向小鼠注射AdNull（上面板）、AdsKitL（中面板）和AdmKitL。用AdNull或AdmKitL治疗后，可见脂肪置换和肌肉坏死的活组织丢失，但在AdsKitL处理组中没有，因为在AdsKitL治疗组中，血管新生得到恢复。(克)AdsKitL肌肉内（i.m.）或静脉内（i.v.）给药（单剂量10⁸p.f.u.）转入百万英镑9^−/−小鼠在缺血后肢中加速了血管重建（上图）。AdsKitL处理后血管密度增加百万英镑9^−/−与AdNull或AdmKitL处理的小鼠相比百万英镑9^−/−小鼠（下图）(n个=每组6人*P（P）< 0.05). (小时)观察到缺血诱导血管病变的逆转百万英镑9^−/−用sKitL治疗的小鼠，但不使用mKitL（上部面板）。肌肉内AdmKitL（10⁸p.f.u.）注射到缺血后肢后，sKitL血浆水平增加百万英镑9^+/+但不在百万英镑9^−/−小鼠结扎后3d(n个=每组4人*P（P）< 0.05). 广告工具包（10⁸p.f.u.）血浆sKitL增加三倍百万英镑9^+/+和百万英镑9^−/−小鼠与AdNull的比较(n个=每组4人*P（P）< 0.05).

血管细胞动员受损百万英镑9^−/−老鼠

sKitL和TPO支持新生血管形成的一个可能机制是CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞。作为Sca1⁺血管内皮生长因子受体1⁺造血细胞也表达功能性CXCR4，sKitL释放受损，CXCR4动员减少⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞可能是导致血管重建延迟的原因百万英镑9^−/−老鼠³¹。

为此，在诱导后肢缺血后百万英镑9^+/+和百万英镑9^−/−小鼠，我们测定了动员CXCR4的数量⁺血管内皮生长因子受体1⁺外周血细胞每4天一次，共14天。CXCR4动员⁺蔬菜1⁺血管细胞(图3a)年受损百万英镑9^−/−这表明这些细胞动员受阻可能是sKitL生物利用度降低的结果。

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图3

可溶性造血细胞因子诱导血小板释放SDF-1和CXCR4募集⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞，加速缺血血运重建。(一)移动化CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺从…的外周血中分离的细胞百万英镑9^+/+和百万英镑9^−/−采用双色流式细胞仪对小鼠后肢缺血诱导后进行分析。CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞受损百万英镑9^−/−与野生型小鼠相比(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (b条)与PBS治疗的对照组相比，静脉注射重组TPO或sKitL后3d血浆SDF-1水平诱导2.5倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (c（c）)随着时间的推移，血浆SDF-1水平对后肢缺血的反应。在百万英镑9^+/+小鼠结扎后血浆SDF-1峰值是百万英镑9^−/−老鼠(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (d日)循环CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺在有或无CXCR4阻断（CXCR4特异性单克隆抗体、非肽类拮抗剂AMD3100或拟肽拮抗剂CTCE-0012）的野生型小鼠中静脉注射重组sKitL（100 ng）后3天，测量细胞。sKitL导致动员的CXCR4数量增加了四倍⁺血管内皮生长因子受体1⁺与PBS或IgG同型治疗对照组相比。使用带有CXCR4特异性单克隆抗体AMD3100或CTCE-0012的sKitL抑制CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺与仅sKitL相比，细胞数量增加了三倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (e（电子）)野生型小鼠静脉注射重组TPO（100 ng）或TPO和CXCR4特异性单克隆抗体的组合（20μg/小鼠，克隆2B11）。3d后，CXCR4特异性单克隆抗体降低了TPO诱导的CXCR4动员⁺蔬菜1⁺细胞减少83%(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (（f）)将重组EPO（100单位）或GM-CSF（100 ng）静脉注射给野生型小鼠，并与经PBS和IgG处理的小鼠作为对照。中和CXCR4特异性单克隆抗体完全阻断EPO和GM-CSF诱导的CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞与细胞因子治疗组的比较(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (克)TPO或sKitL使CXCR4的动员活动增加了2.5倍⁺血管内皮生长因子受体1⁺EPO或GM-CSF以外的细胞(n个=每组4人；P（P）< 0.05). (小时)从野生型小鼠的外周血中分离血小板，用凝血酶或细胞因子刺激，并用ELISA测定血小板释放物中SDF-1的水平。TPO和sKitL诱导血小板释放SDF-1的剂量依赖性相似，而GM-CSF的作用最小。数据表示从1×10的血小板释放液中检测到的SDF-1⁷血小板(n个=每组3人*P（P）< 0.05).

SDF-1升高支持血管细胞动员

由于SDF-1支持造血细胞动员，我们推测sKitL和TPO介导的SDF-1血管内释放可能诱导CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞。静脉注射重组sKitL或TPO可增加血浆SDF-1水平(图3b). 然后我们评估了SDF-1在百万英镑9^−/−小鼠后肢缺血后。虽然野生型小鼠结扎后48小时内血浆SDF-1水平持续升高，但在百万英镑9^−/−老鼠(图3c). 这些数据表明，sKitL和TPO可能通过SDF-1介导的CXCR4动员支持新生血管⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞。

为了验证这个假设，我们阻断了CXCR4介导的信号传导，以挑战sKitL的能力(图3d)、TPO(图3e)或GM-CSF(图3f)动员CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞。在野生型小鼠中，血浆sKitL升高(图3d，g)或TPO水平(图3e，g)导致CXCR4动员增加四到五倍⁺血管内皮生长因子受体1⁺单元格。EPO或GM-CSF的疗效较差，并导致动员的CXCR4数量增加2.5或1.8倍⁺血管内皮生长因子受体1⁺单元格，分别(图3f，g). 中和单克隆抗体（克隆2B11）抑制CXCR4信号传导^19,32有效阻止CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺sKitL介导的细胞(图3d)、TPO(图3e)、EPO和GM-CSF(图3f). 此外，CXCR4的拟肽拮抗剂（CTCE-0012）^33,34也抑制了CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺单元格(图3d). 值得注意的是，AMD3100（CXCR4的一种非肽类双环胺拮抗剂）的每日慢性治疗与CTCE-0012和中和单克隆抗体在抑制sKitL诱导的CXCR4动员方面同样有效⁺血管内皮生长因子受体1⁺单元格(图3d). 这些数据表明，细胞因子诱导的血管细胞动员部分是通过血浆SDF-1水平的升高和CXCR4信号通路的激活介导的。

细胞因子诱导血小板释放SDF-1

造血细胞和内皮细胞产生和储存SDF-1(^参考35)表明细胞因子可能刺激造血室释放SDF-1。血小板储存各种血管生成因子，包括VEGF-A³⁶和血管生成素³⁷。它们还共同表达TPO和sKitL受体³⁸因此，我们推测可溶性细胞因子可能会诱导循环血小板释放SDF-1。未经刺激的血小板未释放SDF-1(图3h). 但TPO或sKitL诱导的从野生型小鼠新鲜分离的血小板活化导致SDF-1在释放物中显著增加(图3h). GM-CSF没有诱导血小板释放SDF-1，这与血小板上缺乏GM-CSF-受体表达一致²⁹这些发现表明CXCR4的动员程度⁺蔬菜1⁺造血细胞因子从血小板释放SDF-1的能力在一定程度上决定了细胞(图3h).

由于蛋白酶如弹性蛋白酶被认为参与SDF-1的释放，我们推测MMP9也可能介导血小板释放SDF-1。TPO和sKitL不会导致MMP9缺陷小鼠血小板释放SDF-1(补充图3在线）。这些数据表明，TPO和sKitL，而非GM-CSF，部分通过MMP9介导的循环血小板库的部署增加了SDF-1的血浆水平。

血小板减少小鼠SDF-1升高受损

如果TPO诱导血小板释放SDF-1支持CXCR4的募集⁺血管内皮生长因子受体1⁺血小板减少时SDF-1的血浆升高应受到损害Mpl公司^−/−或Thpo公司^−/−老鼠。在野生型小鼠中，SDF-1在后肢缺血后上调(图4a)从而增加了CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞（22%循环单核细胞；图4b). 相比之下，SDF-1在Mpl公司^−/−和Thpo公司^−/−老鼠被弄钝了(图4a)，导致Sca1动员有缺陷⁺和CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞（5.7%循环单核细胞；图4b). 因此，SDF-1在Thpo公司^−/−小鼠可能是由于血小板水平低。这些结果表明，TPO通过增加血小板水平和促进SDF-1的释放，有助于CXCR4的动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞，从而加速血管重建。

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图4

SDF-1逆转新生血管生成缺陷百万英镑9^−/−和Thpo公司^−/−小鼠的剂量依赖性。(一)股动脉结扎术后后肢缺血百万像素^−/−,Thpo公司^−/−或野生型小鼠。在指定的时间点用ELISA测定SDF-1的血浆水平。与对照组相比，野生型小鼠血浆SDF-1水平持续升高（48小时时为3.2倍）Mpl公司^−/−或Thpo公司^−/−小鼠股动脉结扎后72h内(n个=每组6人*P（P）< 0.05). (b条)循环CXCR4的数量⁺血管内皮生长因子受体1⁺野生型小鼠的细胞是野生型小鼠细胞的5.5倍，比野生型小鼠高5倍Mpl公司^−/−小鼠股动脉结扎后3天和8天(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (c（c）)服用AdSDF-1（低剂量，10⁸p.f.u.静脉注射）至Thpo公司^−/−与AdNull治疗的对照组相比，结扎股动脉后的小鼠缺血后肢的灌注恢复了两倍。较高剂量（5×10⁸p.f.u.静脉注射）与AdNull治疗的对照组相比，缺血灌注改善了2.8倍(n个=每组4个*P（P）< 0.05). (d日)血管密度增加（CD31⁺血管/腓肠肌或内收肌纤维，n个=4/组），SDF-1治疗组肌肉坏死较少Thpo公司^−/−小鼠与AdNull处理的对照组的比较(n个=每组4个，数据代表五个独立高功率场（HPF）的平均值）。原始放大倍数，×400。(e（电子）)AdSDF-1注射液（低剂量，10⁸p.f.u.静脉注射）百万英镑9^−/−与AdNull治疗的对照组相比，小鼠缺血后肢的灌注恢复了1.95倍。较高剂量（5×10⁸p.f.u.静脉注射）与AdNull治疗的对照组相比，缺血灌注进一步改善了2.5倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05).

SDF-1升高的程度决定血运重建

如果SDF-1的释放在Thpo公司^−/−和百万英镑9^−/−然后SDF-1应该可以恢复这些小鼠的血管生成。血浆SDF-1水平升高恢复了血管重建Thpo公司^−/−(图4c、d)和百万英镑9^−/−(图4e)小鼠剂量依赖性。增加AdSDF-1的剂量可提高缺血后肢血运重建的速度和程度(图4c、e). 组织学检查显示CD31密度增加⁺血管和腓肠肌和内收肌无坏死区Thpo公司^−/−(图4d)和百万英镑9^−/−老鼠(补充图1). 总的来说，这些数据表明血浆中SDF-1升高的幅度是血管生成缺陷患者血管重建程度的主要决定因素Thpo公司^−/−和百万英镑9^−/−老鼠。

VEGF-A通过CXCR4激活动员血管细胞

TPO通过刺激缺氧诱导因子1α（HIF-1α）诱导VEGF-A表达³⁹为了确定TPO是否通过血浆SDF-1水平的升高而在正常毒性条件下独立于VEGF-A直接诱导血管生成，我们将低剂量重组TPO（rTPO）皮下注射到野生型小鼠的耳廓。TPO诱导的新生血管系统发芽与VEGF-A诱导的相当(图5a). 与VEGF-A相比，rTPO引起的组织水肿更少(图5a).体内加载rTPO的Matrigel塞植入物也显示出血管通道的形成，且分支丰富，类似于加载VEGF-A的植入物(图5b). 耳廓注射rTPO后，血浆TPO和SDF-1水平分别增加了2倍和2.4倍(图5c). rTPO治疗可诱导与VEGF-a治疗相似的新生血管模式，提示TPO可能通过上调VEGF-a和诱导SDF-1释放而发挥促血管生成作用。

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图5

抑制CXCR4和VEGFR1（在较小程度上）可以阻止VEGF-a诱导的血管细胞动员和缺血性血运重建。(一)在小鼠耳廓血管生成模型中，皮下重组TPO（每3天200纳克）诱导新生血管大量形成和萌芽，类似于皮下注射VEGF-A，但水肿形成较少（原始放大倍数×10）。以PBS注射耳廓作为对照。(b条)与VEGF-A（原始放大倍数×400）相比，具有重组TPO的Matrigel栓塞显示出大量血管通道的形成和分支。使用装有PBS的Matrigel塞作为对照。(c（c）)与PBS治疗的对照组相比，耳廓皮下注射低剂量重组TPO导致血浆TPO和SDF-1水平增加两倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (d日)静脉注射AdVEGF-A后三天（单剂量10⁸p.f.u.），循环CXCR4减少五倍⁺蔬菜1⁺细胞也表达Sca1Mpl公司^−/−流式细胞术检测小鼠与野生型小鼠的比较。Sca1的上部细胞分布⁺血管内皮生长因子受体1⁺CXCR4系列⁺细胞。更低，对应的荧光信号强度等值线图。(e（电子）)凝血酶和VEGF-A诱导野生型血小板释放SDF-1的剂量依赖性在体外数据表示从1×10中获得的1 ml血小板释放物中SDF-1的数量⁷血小板(n个=每组3人，*P（P）< 0.05). (（f）)CXCR4单克隆抗体（克隆2B11，20μg静脉注射）阻断VEGF-A诱导的CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺与AdNull处理的小鼠相比，野生型小鼠的细胞数增加了80%(n个=每组4人*P（P）< 0.05). (克)野生型C57Bl/6小鼠股动脉结扎后静脉注射AdVEGF-A（单剂量10⁸p.f.u.）单独或与CXCR4特异性单克隆抗体（克隆2B11，每3天静脉注射20μg）或AMD3100（每天两次腹腔注射1.25 mg/kg）联合使用。用CXCR4特异性单克隆抗体（2B11）或AMD3100阻断CXCR4使血管内皮生长因子-A增强的血管恢复中止。与单独使用AdVEGF-A治疗相比，同时使用2B11或AMD4100治疗AdVEGF-A可使灌注恢复分别减少36%和42.3%(n个=每组4人*P（P）< 0.05). 对照小鼠用IgG和AdNull治疗。(小时)CXCR4特异性单克隆抗体（每3天静脉注射20μg）使野生型小鼠的灌注恢复减少50%(n个=每组4个*P（P）<0.05），而与IgG同型对照组相比，联合使用CXCR4特异性抗体（每3d静脉注射20μg）和VEGFR1特异性抗体（每3 d腹腔注射400μg）进一步降低了63%的灌注恢复。

VEGF-A诱导CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺野生型小鼠的血管细胞Mpl公司^−/−老鼠(图5d)，增加了VEGF-A也可能通过诱导血小板释放SDF-1来调节血管生成的可能性，血小板减少时SDF-1的释放Mpl公司^−/−老鼠。血小板表达功能性VEGFR1(^参考号40). 与TPO和sKitL类似，VEGF-A也能诱导血小板释放SDF-1(图5e). 此外，用CXCR4的中和单克隆抗体治疗足以阻止VEGF-A介导的CXCR4动员⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞。这一结果强烈表明VEGF-A通过血浆中SDF-1的升高支持血管细胞的动员(图5f).

VEGF-A通过CXCR4激活诱导血运重建

与以前发布的数据一致⁶血浆VEGF-A水平的升高可以加快缺血再血管化的速度和程度(图5g). 将AdVEGF-A与CXCR4的中和单克隆抗体或CXCR4拮抗剂AMD3100的慢性每日治疗联合注射给野生型小鼠，可部分阻断野生型小鼠的血管恢复或通过递送VEGF-A提供的增量血运重建(图5g).

然而，单独阻断CXCR4并不能完全消除VEGF-A的促血管生成活性。此外，抑制CXCR4和阻断VEGFR1对于有效阻止野生型小鼠缺血后肢的血运重建是必要的(图5h). 因此，CXCR4激活在介导VEGF-a中起着关键作用——CXCR4的独立动员和招募⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞，VEGFR1的参与对这些细胞的促血管生成功能很重要。

VEGF-A支持血管细胞的促血管生成活性

一旦被招募到新血管生成生态位，CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞可能通过释放血管生成因子或通过定位于血管周围部位来稳定新生血管，从而促进血管重建。胎盘生长因子（PlGF）通过VEGFR1发出信号，诱导骨髓源性CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞形成纺锤形细胞(补充图3). 这些细胞表达具有造血祖细胞特征的标记物，包括Sca1、c-Kit、Tie-2和髓系细胞，如CD11b和PECAM(补充表1在线和数据未显示）。他们没有表达平滑肌细胞（即平滑肌α-actin）或内皮细胞（VE-cadherin、von Willebrand因子或E-selectin）的特征标记。VEGFR1的刺激⁺CXCR4系列⁺含有PlGF的血管细胞导致血管生成素-2（Ang-2）的释放(补充图3和补充方法在线），这表明这些细胞可以通过详细阐述血管生成因子，在功能上促进新生血管的形成。

SDF-1将血管细胞保留在缺血壁龛内

VEGF-A通过上调SDF-1的表达来募集内皮祖细胞(^参考41)提示CXCR4的表达可能对缺血区内血管细胞的滞留至关重要。因此，我们着手评估CXCR4的容量⁺修复血管重建缺陷的细胞百万英镑9^−/−老鼠。我们隔离并扩展了CXCR4⁻和CXCR4⁺E13.5胎肝细胞Cxcr4号机组^−/−和Cxcr4号机组^+/+胚胎。随后，我们注入5×10⁵PKH26标记的CXCR4⁻或CXCR4⁺细胞分别进入缺血肢体百万英镑9^−/−老鼠。与CXCR4相比⁺细胞，CXCR4的本地递送⁻细胞在恢复缺血后肢血运重建方面的效果较差百万英镑9^−/−老鼠(图6a). 此外，CXCR4增加了五倍⁺与CXCR4相比，缺血后肢保留了细胞⁻结扎和植入后15d的细胞(图6b、c). 这些数据表明，CXCR4的激活对于血管细胞在新生血管龛内的滞留很重要。

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图6

CXCR4的保留和合并⁺血管内皮生长因子受体1⁺单元格，但不是CXCR4⁻或VEGFR1⁻细胞，恢复功能性新生血管生成百万英镑9^−/−老鼠。(一)肝造血细胞Cxcr4号机组^+/+或Cxcr4号机组^−/−胚胎（E13.5）扩增体外用PKH26荧光标记的KitL，随后局部移植到百万英镑9^−/−小鼠股动脉结扎后24h。植入Cxcr4号机组^+/+电池（5×10⁵，填充圆），但不是Cxcr4号机组^−/−电池（5×10⁵，开放正方形）或载具中等（填充三角形）百万英镑9^−/−小鼠灌流恢复增加33%(n个=每组3人*P（P）< 0.05). (b条)荧光标记PKH26Cxcr4号机组^+/+和Cxcr4号机组^−/−股动脉结扎后15天局部缺血肢体内的细胞（白色箭头）。原始放大倍数，×200。(c（c）)造血系统的保留Cxcr4号机组^+/+缺血后肢内的细胞百万英镑9^−/−老鼠比Cxcr4号机组^−/−单元格(n个=每组3人，*P（P）< 0.05). (d、 e（电子）)CXCR4的交付⁺血管内皮生长因子受体1⁺电池（3×10⁵)，但不是CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁻电池（3×10⁵)，肌肉注射(d日)或静脉注射(e（电子）)进入缺血后肢，显著提高了百万英镑9^−/−老鼠(n个=每组6人；P（P）< 0.05). (（f）)供体衍生CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺用CD31（PECAM-1）-PE（红色）对细胞（绿色，用PKH2GL标记）进行共免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染色。CXCR4系列⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞主要定位于侧支CD31基底部的血管周和间质区⁺移植后7d新生血管(（f），上部面板中的箭头；原始放大倍数，×100）。在所有测试的缺血后肢中观察到相同的模式(n个=每组6人）。上面板中指示区域的放大倍率在下面板中显示（原始放大倍率，×400）。(克)示意模型：SDF1-CXCR4作为造血细胞因子诱导新生血管的分子中枢。

血小板释放SDF-1

我们从从逆行神经丛采集的750μl小鼠血液中获得富含血小板的血浆，并将其与450μl小鼠生理盐水（165 mM NaCl）和50μl 3.2%柠檬酸钠混合作为抗凝剂。我们将稀释的血液混合物在1000 r.p.m.、24-27°C下离心5分钟，并收获上清液作为富血小板血浆（PRP）。PRP中的血小板计数由自动Advia-120血液学系统测定。我们通过在2500转/分、24-27°C下离心PRP 5分钟收集血小板，然后通过凝血酶（Sigma）和各种细胞因子激活血小板。用定量因子ELISA（R&D）测定SDF-1水平，并以血小板释放物pg/ml表示（含1×10⁷血小板/ml释放）。

流式细胞术抗体

我们用以下单克隆抗体标记小鼠循环单核细胞：来自BD-PharMinen的PE-结合Sca1特异性（E13.161.7和D7）、PE-结合CD11b-特异性（克隆M1/70）和PE-结合CXCR4-特异性（clone 2B11）；和FITC-共轭VEGFR1特异性（克隆MF-1，ImClone系统）抗体。

CD31的识别⁺容器

我们将5μm的甲醛固定石蜡包埋肌肉（腓肠肌和内收肌）切片脱蜡，并将其与CD31的一级抗体（PECAM-1；1:300；BD PharMinen）在4°C下孵育过夜。然后，我们按照制造商的建议用大鼠特异性兔IgG（1:200）和Vectastain Elite ABC试剂培养切片。用3-3′二氨基联苯胺底物建立免疫组织化学信号，苏木精复染。

Hindlimb缺血模型

对于后肢缺血模型，如前所述，对小鼠进行左股血管结扎和节段切除⁶为了诱导后肢缺血，我们在左侧腹股沟区的皮肤上开了一个切口，并沿组织平面横向进行腹膜外剥离，以暴露股骨血管。然后，我们用6-0丝线结扎股骨近端和远端血管，并在不损伤股神经的情况下切除结扎血管之间的结扎血管。然后，我们使用4-0多芯缝合线闭合左侧腹股沟切口。

我们在不结扎或切断股骨血管的情况下，仅对皮肤进行切开和缝合，进行了假手术。我们用激光多普勒灌注扫描仪（PeriScan系统，Perimed）测量结扎后每3d同一小鼠缺血和非缺血后肢的血流速度。然后，我们通过将激光多普勒衍生的缺血后肢灌注除以非缺血后肢的灌注来计算相对血流比率。

耳廓血管生成模型及Matrigel栓试验

我们使用LLC、B16黑色素瘤、EL2肉瘤或B6RV2淋巴瘤建立了小鼠同基因肿瘤移植模型，方法是将相应的肿瘤皮下注射到Thpo公司^−/−,Mpl公司^−/−或2×10剂量的C57Bl/6J（野生型）小鼠⁶每次接种的细胞数。我们每周用卡尺测量两次肿瘤，计算肿瘤体积为（w1×w2×w3），其中w1和w2分别代表最大和最小的肿瘤直径；w3代表肿瘤的厚度。对于转移研究，我们如上所述移植LLC细胞。随后处死小鼠，取出器官，称重并检查以测量转移结节的数量。

在小鼠耳廓血管生成模型中，我们研究了重组TPO和VEGF-A的血管生成反应(n个=3–5）在耳廓底部皮下注射体积为50μl的重组小鼠VEGF-A（每3天50 ng）、重组TPO（每3天后200 ng）或PBS（阴性对照）。注射后14天处死小鼠，并在解剖显微镜下检查耳廓的血管。

对于体内Matrigel试验中，我们将小鼠麻醉，并在腹部中线皮下注射0.5 ml生长因子耗尽的Matrigell（BD Biosciences），补充100 ng小鼠重组TPO或10μg VEGF-A。我们在不添加外源性生长因子的情况下，给对照小鼠注射Matrigel。我们在植入后21天取出Matrigel塞，对其进行拍照并准备进行组织学检查。

CXCR4的分离和移植⁺蔬菜1⁺细胞

我们分离出骨髓衍生CXCR4⁺蔬菜1⁺或CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁻使用针对CXCR4（2B11）和VEGFR1（MF-1）的生物素结合的鼠特异性单克隆抗体从8周龄小鼠中提取的细胞，然后通过MACS（Miltenyi Biosystems）分离亲和素微球。我们标记为CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺带有绿色荧光膜连接剂（PKH2-GL，Sigma Chemical Co）并使用CXCR4的细胞⁺血管内皮生长因子受体1⁻单元格作为控件。我们重新悬浮了300000个细胞（CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺或CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁻)在100μl无血清X-VIVO 20培养基（Cambrex Biosciences）中，然后将其肌肉注射到缺血肢体区域股四头肌下方的四个单独区域，或使用27.5号针头通过尾静脉静脉注射(n个=每个植入组6个）。

我们要感谢P.Lau、M.Choy、G.Kanhai、R.Tejada、G.Lam和A.Intrator的技术援助。我们还要感谢Genentech的F.de Sauvage提供Thpo公司^−/−和Mpl公司^−/−老鼠。S.R.是霍华德·休斯医学研究所的研究员，得到了美国癌症学会、淋巴瘤和白血病学会以及美国国立卫生研究院（RO1-HL075234、HL59312、HL66592和HL67839）的支持。D.K.J.由赫敏基金会资助。D.L.得到了多丽丝·杜克慈善基金会、儿童血液基金会和国家癌症研究所的资助。