乱涂突变体与致癌Ras或Notch合作，导致肿瘤过度生长果蝇属

JNK通路介导的凋亡消除了scrib突变组织的克隆

尽管划线器^–在三龄幼虫发育过程中，这种组织最终必须通过细胞死亡来清除，因为当幼虫化蛹后羽化时划线器^–成人眼睛中残留的组织（标记为w个^–组织缺乏红色色素），并且有坏死迹象，尤其是在眼睛中部（图2B、 与图中的野生型眼睛马赛克相比2A） ●●●●。事实上，即使在三龄幼虫眼盘发育期间，也会有相当大的细胞凋亡（图2D与图中的野生型光盘进行比较2C） 、和划线器^–组织（GFP阳性）应占眼触角盘的50%，比野生型组织的代表性低得多，尤其是MF后面发生分化的组织（图2F与对照马赛克眼盘进行比较，图2E） ●●●●。

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图2。的克隆划线器JNK通路介导的凋亡可消除突变眼组织。（A和B）通过使用w个⁺标记成人眼睛野生型组织的基因ey飞行计划控制眼包含等量的w个⁺和w个^–组织(A类). 安ey-FLP划线器¹马赛克眼睛几乎没有划线器^–组织(w个^–)在成人中，眼睛尺寸缩小，并且经常在眼睛中央发现坏死点(B类). （C和D）三龄幼虫眼盘的吖啶橙染色显示野生型眼/触角盘中几乎没有凋亡细胞(C)，但在ey-FLP划线器¹马赛克眼/天线盘(D类)检测到许多凋亡细胞。（E–J）MARCM系统用于生成ey-FLP公司在两个野生型对照克隆中表达不同转基因的克隆，其中GFP为阳性克隆标记(E类,G公司和我)或划线器¹克隆(F类,H（H）和J). Elav染色显示三龄幼虫眼盘中发育的感光细胞。在野生型克隆中，仅表达GFP作为克隆标记，克隆组织占组织的约50%（E2和3），成人眼睛正常（E4）。在划线器¹克隆、突变组织的代表性明显低于野生型组织（F2和3），并且成年眼睛通常缩小且无组织（F4）。通过表达JNKK（Hep）活化等位基因对JNK途径的异位激活^ACT公司)在对照组中，野生型克隆（G1-3）几乎消除了所有克隆组织，导致成人眼睛轻微粗糙（G4）。通过表达显性负性JNK（Bsk）阻断JNK通路^{DN（公称直径）})，英寸划线器¹克隆（H1–3）导致划线器^–眼盘组织（H2；与划线器¹克隆，F2）和完全蛹致死。Bsk的表达^{DN（公称直径）}在对照克隆（I1-3）中，结果是成年苍蝇的眼睛只有轻微的紊乱（I4）。泛型蛋白酶抑制剂p35的表达划线器¹突变克隆（J1-3）导致划线器^–克隆组织与无性系的比较划线器¹单独（F2），与之相比，成年苍蝇的眼睛更加杂乱和坏死（J4）划线器¹仅克隆（F4）。

在哺乳动物和果蝇属，JNK可诱导应激反应，导致细胞凋亡（综述Davis，2000年). 因此，我们希望测试JNK通路的异位激活是否在划线器^–眼睛克隆可以解释划线器^–组织。为了做到这一点，我们使用了MARCM系统，这是一种体外和组成性表达任何GAL4依赖性的方法(无人机-)转基因，就在组织的有丝分裂克隆中（标记为无人机–GFP表达），而不是在周围的野生型组织中(Lee和Lou，1999年; 有关系统的更详细描述，请参见材料和方法）。使用此技术ey-FLP公司为了生成克隆，我们观察到一种激活形式的JNKK（半翅目）在其他野生型组织的GFP表达克隆中的异位表达导致了非常小的克隆，这与JNK通路在眼盘中的促凋亡作用一致（图2G；Hep公司^ACT公司). 测试JNK通路的激活是否导致划线器^–组织中，我们通过表达JNK通路活性的显性阴性版本果蝇属JNK同源物，Basket（Bsk^{DN（公称直径）})，特别是在划线器^–眼睛克隆。这导致了粗布^–克隆组织（GFP阳性细胞，图2H） ，与相比划线器^–控制克隆（图2F） 与Bsk的概念一致^{DN（公称直径）}拯救细胞死亡划线器^–组织。此外，当Bsk的表达^{DN（公称直径）}在对照中，眼睛克隆导致成年苍蝇只有轻微的眼睛紊乱（图2I） ，Bsk的表达^{DN（公称直径）}在里面划线器^–细胞导致蛹死亡。相反，使用MARCM系统下调划线器^–克隆具有相反的效果，包括用显性负性EGFR阻断表皮生长因子受体（EGFR）/Ras信号，用显性负型TCF阻断Wingless（Wg）信号，或用异位表达Dad阻断Decapentaplastic（Dpp）信号，显著降低突变组织的生存能力（数据未显示）。因此，阻断JNK通路，特别是导致划线器^–组织。事实上，下调JNK通路的效果甚至比用杆状病毒泛酶抑制剂p35阻断细胞凋亡的效果更有效。尽管p35表达于划线器^–克隆眼也增加了突变组织的大小，一些苍蝇能够隐匿，眼睛显示出明显的坏死迹象（图2J） ●●●●。

因此，我们得出结论，尽管Scrib的丢失与异位细胞增殖有关，但JNK介导的凋亡反应可确保突变组织不会过度生长。

周围的野生型组织对限制scrib突变克隆的过度生长很重要

移除划线器^–JNK介导的组织凋亡可能是对细胞极性普遍丧失和基底膜脱离的纯细胞内在反应，或者，它可能受到周围野生型组织环境的调节，从而限制异常细胞的过度生长。为了区分这两种可能性，我们使用了两种不同的基因技术来去除围绕在眼球周围的野生型眼盘组织划线器^–克隆。首先，我们从眼盘驱动器中表达了细胞死亡诱导物Hid(GMR公司)特别是在MF后分化的野生型组织中。引人注目的是，去除野生型组织大大提高了划线器^–MF后面的克隆（GFP阳性细胞）（图三A与图相比2F） ●●●●。这导致组织过度生长和死亡。在第二个更极端的实验选项中，我们不仅去除了MF后面的野生型组织，还通过使用纯合细胞致命突变去除了眼睛/触角盘中的几乎所有野生型组织[l（3）cl-R3¹;Newsome等人，2000年]. 同样，在这种情况下划线器^–组织（GFP阳性）并没有因凋亡而消失，而是过度增殖，失去了可识别的结构（图三B、 以及未显示的数据），导致死亡。

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图3。周围的野生型组织限制了粗布突变组织。(A类) 划线器¹马赛克眼盘形成，MF后面剩余的野生型组织通过表达细胞死亡诱导剂Hid而被清除GMR公司发起人。这个划线器¹以GFP表达为标志的克隆组织并没有在MF后消失。Elav染色标志着感光细胞的发育。(B类) 划线器¹产生了马赛克眼盘，周围的野生型组织被纯合子细胞致死突变消除。这个划线器¹以GFP表达为标志的克隆组织在三维上过度生长，根据发育中感光细胞的Elav染色判断分化有限。

综上所述，这些数据表明，周围的野生型组织负责防止划线器^–组织通过JNK介导的细胞死亡诱导。

癌基因形式的Ras和Notch与scrib突变克隆相结合，导致显著的过度生长

的克隆划线器^–组织具有哺乳动物肿瘤的许多特征，包括细胞极性丧失、分化能力缺陷和异位细胞增殖；然而，划线器^–组织过度生长通过JNK途径介导的凋亡倾向来控制。因此，我们想知道使用MARCM系统表达肿瘤细胞的继发癌基因突变会产生什么后果划线器^–背景。

最引人注目的是Ras（Ras^ACT公司)或槽口（N^行为)英寸划线器^–克隆（图4B和D）。这两种致癌基因都能显著诱导肿瘤细胞的过度生长划线器^–组织（GFP阳性）；野生型组织被击败，突变组织无法分化，并继续在三维空间生长到眼睛/触角盘正常大小的许多倍，与脑叶和其他影像组织融合。许多幼虫没有化蛹，长得像纯合子的巨大幼虫划线器^–幼虫。重要的是，尽管Ras的异位表达^行为或N^ACT公司在其他情况下，组织的野生型克隆产生了过度增殖效应并导致蛹死亡，在没有Scrib的情况下，这两个基因都没有导致大规模协同组织过度生长（图4A和C）。

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图4。Ras和Notch信号通路的异位激活，但Wg、Dpp、Hh或PI3激酶途径的异位激活划线器突变眼克隆诱导大规模合作过度生长。（A–L）体外使用MARCM系统激活EGFR/Ras途径（Ras^ACT公司;A类和B类); 缺口路径（N^ACT公司;C和D类); Wg通路（手臂^ACT公司;E类和F类); Dpp通路（Tkv^ACT公司;G公司和H（H）); Hh途径（Ci-155；我和J); 或PI3激酶途径（PI3K；K（K）和L（左）)野生型对照眼克隆（A、C、E、G、I和K）或划线器¹克隆（B、D、F、H、J和L）。所有克隆均以GFP的表达为标志。Elav染色显示发育中的感光细胞（A1–L1；与A2–L2中的GFP合并）。在适用的情况下，显示了从蛹壳（C3）上解剖出的成人眼睛（A3–L3）或法利特成人。Ras的表达^ACT公司在对照克隆中（A）在MF（箭头）之前诱导早熟的光感受器分化。在划线器¹克隆（B），Ras^ACT公司未能启动分化，反而导致大量三维组织过度生长，导致眼/触角盘以及脑叶（箭头）相互融合。插页（B1）显示了野生型脑叶（箭头）和眼触角盘（箭头）在相同放大倍数下（放大倍数是图中其他面板的一半）进行比较。N的表达^ACT公司对照组克隆（C）干扰感光细胞分化（箭头），成年苍蝇在羽化前死亡，眼睛过度生长。在划线器^–克隆（D），N^行为诱导类似程度的三维过度生长和缺乏分化，如Ras^ACT公司（图中显示的是一个平面截面，但过度生长是三维的）。Wg通路信号的异位激活有效地阻止了对照克隆（E；箭头）的感光细胞分化，这种情况在划线器¹克隆（F）。Dpp或Hh信号的异位激活在两个对照克隆（G和I）以及划线器¹克隆（H和J）。异位PI3激酶信号转导划线器¹克隆（L）的作用不大。

体外激活刺猬（Hh）、Dpp和Wg的主要生长和模式途径的后果划线器^–克隆（GFP阳性）与Ras的效果有很大不同^ACT公司和N^ACT公司.一种致癌的激活型β-连环蛋白（Arm^ACT公司)它模拟了异位Wg通路信号，有效地阻止了对照克隆中的感光细胞分化，并使组织保持在增殖状态（图4E） ，但在划线器^–克隆，尽管感光细胞分化仍然被Arm的表达所阻断^ACT公司，的划线器^–组织没有表现出无限制的过度生长，偶尔成虫会隐匿，尽管眼睛严重紊乱（图4F） ●●●●。激活任一Dpp（Tkv^ACT公司; 图4G和H）或Hh（Ci-155；图4I和J）信号也会导致图案缺陷，但在划线器^–导致蛹死亡的克隆没有诱导与划线器^–用Ras观察^ACT公司或N^ACT公司此外，Wg、Dpp或Hh信号通路的异位激活粗布^–克隆通常会增加克隆组织的大小，这与阻断JNK途径诱导的一致性和程度不同。

总之，这些数据表明，广泛的肿瘤过度生长可以在果蝇属通过肿瘤抑制因子丢失之间的协同作用，划线器尤其是Ras或Notch的致癌形式。

细胞周期蛋白E的上调和scr突变克隆的过度增殖

划线器^–克隆体外表达细胞周期蛋白E并经历异位S期和有丝分裂。因为cyclin E是发育中眼睛细胞周期进展的速率限制(Richardson等人，1995年)，很可能细胞周期蛋白E在划线器^–克隆是异位细胞增殖的关键。事实上，我们最初分离了划线器和lgl公司作为低形态的主要抑制物细胞周期蛋白E等位基因，DmcycE公司^日元（A.M.Brumby、J.Secombe、J.Horsfield、M.Coombe、N.Amin、D.Coates、R.Saint和H.E.Richardson正在准备中），这表明这些细胞极性基因通常在限制cyclin E表达方面起着关键作用。我们目前正在研究哪些信号通路在划线，dlg或lgl公司可能导致细胞周期蛋白E上调。最近对人类肺上皮细胞的一项研究表明，破坏细胞极性可以使heregulin-α配体和erbB2-4受体混合，这两种配体通常是物理分离的，从而激活通路和细胞增殖(Vermeer等人，2003年). 需要进一步研究，以确定在没有Scrib的情况下观察到的细胞周期蛋白E的异位表达是否仅仅是由于破坏细胞极性导致的组织结构紊乱的结果，或者Scrib是否在限制细胞增殖方面发挥直接作用，而不受细胞极性的影响。有趣的是，在没有Scrib的情况下，细胞的聚集似乎主要是一种细胞自主效应，但很明显，非细胞自主缺陷也很明显，包括细胞周期蛋白E的上调。这表明野生型和突变型细胞之间细胞-细胞相互作用的改变也可以改变野生型细胞内的信号通路，顶端-基底极性的丧失和柱状上皮的塌陷并不是细胞周期蛋白E表达失控的内在原因。深入了解上皮细胞极化和细胞增殖之间的关系对于理解癌症的发展显然很重要，因为细胞极性的丧失往往伴随着肿瘤的进展和转移。

补偿性JNK介导的scrib突变组织的消除

过度增殖划线器^–JNK介导的细胞凋亡补偿了眼盘中的克隆。阻断JNK通路活性划线器^–眼克隆大大增加了克隆组织的比例，导致对宿主的致死。由于下调其他野生型组织克隆中的JNK通路活性并没有诱导细胞增殖增加（A.M.Brumby和H.E.Richardson，未发表的数据），我们认为JNK途径活性在划线器^–克隆诱导细胞凋亡。这与之前关于JNK通路在细胞内促凋亡作用的报道一致果蝇属眼睛(Takatsu等人，2000年)以及我们自己的观察结果（图2G） ●●●●。最近对哺乳动物的研究也表明，JNK通路的激活可以限制肿瘤的生长就地可能是通过增加细胞凋亡(Kennedy等人，2003年).

JNK介导的细胞凋亡是如何在划线器^–克隆未知。虽然Scrib可以在抑制JNK通路活性方面发挥直接作用，但JNK途径也可能间接激活，以应对其他细胞缺陷。在翼盘中，通过JNK介导的凋亡去除细胞与细胞对形态原梯度反应的不连续性有关，最显著的是前后模式调节因子Dpp，这一过程可能与细胞竞争有关，目的是消除异常或生长缓慢的细胞(Adachi-Yamada等人，1999年;Adachi-Yamada和O'Connor，2002年;Moreno等人，2002a). 虽然这种形式的补偿性JNK介导的细胞凋亡尚未在眼盘内得到证实，但观察到周围的野生型组织环境在限制视网膜过度生长方面起着重要作用划线器^–组织反对一种简单的细胞内凋亡反应粗布^–细胞对细胞极性丧失的反应，并且更符合由肿瘤细胞和周围野生型细胞介导的整合反应，如细胞竞争所示。这是否取决于划线器^–转导Dpp信号的细胞尚不清楚；然而，其他有趣的可能性也值得进一步调查。值得注意的是，最近发现一种肿瘤坏死因子诱导的凋亡信号通路涉及JNK通路(Igaki等人，2002年;Moreno等人，2002b). 我们还注意到JNK通路参与协调背部和胸部闭合形态发生运动期间的细胞形状变化（由Kockel等人，2001年)和伤口愈合(Ramet等人，2002年). 我们注意到划线器^–组织表达Bsk^{DN（公称直径）}（JNK公司^{DN（公称直径）})与表达凋亡抑制剂p35的细胞形态不同；最值得注意的是，克隆通常比那些表达p35的克隆更大，更不圆（图2H、 和数据未显示）。这意味着p35没有Bsk有效^{DN（公称直径）}或JNK通路的其他效应器在抑制划线器^–肿瘤过度生长。我们目前正在研究JNK激活可能在消除划线器^–上皮组织在一个让人联想到伤口愈合的过程中。

此前有报道称数据链接组和lgl公司突变克隆也显示出很差的生存能力(伍兹和布莱恩特，1991年;Agrawal等人，1995年)这表明JNK介导的凋亡可能是对缺乏这些肿瘤抑制因子导致的细胞极性丧失和过度增殖的共同反应。事实上，虽然其他上皮细胞极性调节因子，如Crumbs和E-cadherin，在果蝇属当细胞死亡被阻断时，这些突变对细胞增殖的影响值得进一步研究。有趣的是，在哺乳动物系统中，上皮细胞的极化性质在保护细胞免受凋亡反应方面也很重要，当极性被破坏时，这对肿瘤的发展起到了制动作用（综述Jacks和Weinberg，2002年).

致癌Ras和Notch诱导的协同肿瘤发生

在果蝇属，激活的Ras通过Raf和MAPK途径发挥其致癌作用（图5A和B）。先前研究表明，眼盘MAPK的下游靶点可以促进分化、细胞存活和细胞增殖。我们的研究还表明，Ras可以增加眼盘中的cyclin E蛋白水平。结合使用划线器^–，Ras的微分输出^ACT公司信号似乎减弱，增殖和抗凋亡反应盛行。

激活的Notch还与划线器^–导致肿瘤过度生长，尽管之前没有描述过Notch信号在眼睛中的抗凋亡作用，但N^ACT公司对苍蝇产生超增殖效应(Go等人，1998年;Baonza和Garcia-Bellido，2000年)和Notch信号是眼盘细胞增殖所必需的(Cho和Choi，1998年;Dominguez和de Celis，1998年). 虽然我们不知道N^ACT公司诱导与Ras相同的关键下游目标^ACT公司使…过度生长划线器^–组织，移除拉斯中的函数划线器^–过度表达N的细胞^ACT公司拯救了过度生长表型，表明N^ACT公司至少部分依赖于Ras（A.M.Brumby和H.E.Richardson，未公开数据）。

起初，Ras的合作效应似乎^ACT公司或N^ACT公司在粗布^–组织可以通过这些致癌基因在阻断细胞凋亡的同时促进细胞增殖的能力来解释。然而，与凋亡抑制剂p35（或与JNK通路活性抑制剂Bsk^{DN（公称直径）})，能够复制Ras的作用^ACT公司或N^ACT公司在里面划线器^–克隆。因此，我们认为，除抗凋亡和细胞周期调节因子外，其他下游效应器在介导Ras的致癌作用中也必须发挥重要作用^ACT公司或N^ACT公司事实上，在果蝇属Ras也被证明是细胞生长的有效诱导剂(Prober和Edgar，2000年)而cyclin E和E2F1主要促进细胞周期进展(Neufeld等人，1998年). 是否为N^ACT公司也促进细胞生长果蝇属尚未详细检查。如果增长促进目标是Ras下游^ACT公司或N^ACT公司对促进划线器^–肿瘤，这些可能独立于PI3激酶途径，因为异位PI3激酶信号在粗布^–克隆没有诱导协同过度生长，Raf^ACT公司能够诱导与Ras同样广泛的过度生长^ACT公司.

最后，我们注意到，在哺乳动物系统中，有证据表明Ras信号在调节细胞连接复合体和增强上皮-间充质转化（例如。Chen等人，2000年;Janda等人，2002年)中的、和果蝇属此外，构成Ras^ACT公司克隆中的信号传导改变了细胞亲和力并改变了E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的水平(Prober和Edgar，2002年). 是否Ras^ACT公司或N^ACT公司信号转导破坏粘附连接果蝇属这增强了划线器^–肿瘤的过度生长，或者由于缺乏Scrib而导致的粘附连接结构的改变是否改变了细胞对这些癌基因组成性激活的反应，这些都是未来重要的问题。

有丝分裂眼克隆的产生

有丝分裂眼克隆是通过交叉产生的，以GFP或LacZ的缺失为标志ey-FLP1；；FRT82B P【Ubi-nlsGFP】苍蝇或ey-FLP1；；FRT82B P[mini-w]P[arm-lacZ]飞到FRT82B划线器¹或FRT82B划线器²股票。

要生成划线器¹去除周围野生组织的克隆眼，ey-GAL4，UAS-FLP1；；FRT82B GMR隐藏或ey-FLP2；；FRT82B l（3）cl-R3型¹苍蝇被交叉到FRT82B P[Ubi-nlsGFP]标记¹苍蝇。划线器¹通过GFP的表达标记突变组织。

为了在突变克隆中表达不同的转基因，使用了MARCM系统(Lee和Lou，1999年). 在MARCM系统中，转录激活物GAL4和阻遏物GAL80在微管蛋白发起人，但FLP公司-介导重组FRT公司场地侧翼GAL80管确保克隆中GAL80的丢失，以及随后GAL4依赖性转录的去表达，包括无人机-mCD8-GFP转基因作为阳性克隆标记，特别是在突变克隆组织内。ey-FLP1，UAS-mCD8-GFP；；管-GAL4 FRT82B管-GAL80苍蝇与携带无人机-用任何一种转基因FRT82B型作为控件，或FRT82B划线器¹将转基因表达于划线器¹克隆。表达Ras^ACT公司在里面e2f1型⁹¹突变克隆，FRT82B e2f1⁹¹或FRT82B e2f1⁹¹ 划线器¹使用了库存。如果无人机-转基因位于第三条染色体上，产生携带无人机用任何一种转基因FRT82B型或FRT82B粗布¹.