ATP7B在卵巢癌中的靶向治疗作用

siRNA沉默ATP7A和ATP7B基因

靶向ATP7A和ATP7B的siRNA构建物是从Qiagen设计和购买的。靶序列为5′-CTGGACCGGATTGTTAATTAT-3′（ATP7A）和5′-CAATTGATTGAGCGGTTA-3′（ATP 7B）。体外如前所述进行瞬时转染(28). 简而言之，使用RNAiFect试剂（Qiagen）将ATP7A-和/或ATP7B-特异性或干扰（对照）siRNA转染细胞。在选定的时间间隔，收集细胞，分别使用逆转录PCR和Western blot分析测定ATP7B的mRNA和蛋白质水平。一个与任何人类mRNA没有同源性的寡核苷酸序列（由国家生物技术信息中心BLAST搜索确定的干扰siRNA）作为对照。

逆转录PCR

用Qiagen RNeasy试剂盒分离总RNA。按照制造商的说明，使用SuperScript First-Strand试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。用ATP7A的特异性引物5′-CTGGCAGAGCAGAAGAAGTAAGG-3′（正）和5′-TGCAAGTGGTCATAA-3′（反义）以及ATP7B的5′-GGTGTCTCCCCGTGTGT-3′（正、反义）对cDNA进行PCR；β-肌动蛋白被用作家政基因。PCR使用5至25μg反转录RNA和100 ng/μL正反义引物，总体积为20μL。每个周期包括94°C下45 s的变性、55°C下1 min的退火和72°C下45s的伸长率（22个周期）。扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上用Tris-borate-EDTA缓冲液电泳分析，并用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。

蛋白质印迹分析

如前所述，收集生长至80%汇合处的细胞，并在改良的放射免疫沉淀分析缓冲液（50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸、25μg/mL亮氨酸肽、10μg/mL抑肽酶、2 mmol/LEDTA、1 mmol/L-原钒酸钠）中溶解(29). 从snap冷冻组织中制备裂解物体内肿瘤，～30毫米^三将组织切片在改良的放射免疫沉淀分析缓冲液中匀浆，并将裂解物在4°C下以12500rpm离心20分钟。上清液的总蛋白浓度使用双钦酸蛋白检测试剂盒（Pierce）测定。蛋白质（30-50μg）在6%凝胶上通过SDS-PAGE分离，并电泳转移到硝化纤维素膜上。将印迹在5%奶粉中的TBST[10 mmol/L Tris（pH 8），150 mmol/L NaCl，0.05%吐温20]中封闭1 h，并分别以1:1000和1:500的稀释度在4°C下与抗ATP7A和抗ATP7 B抗体（Novus Biologicals）孵育过夜。ATP7B抗体在165 kDa处识别出一条带，代表ATP7B蛋白，在~195 kDa也识别出一个未知带。在TBST中清洗后，用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体（GE Healthcare）在室温下TBST中检测印迹1h。使用增强化学发光（Perkin-Elmer）观察免疫反应蛋白。所有膜都被剥离，并用抗β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich）以1:2000的稀释度重新制备，以确保蛋白质负载均匀。

细胞毒性[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物]测定

通过测量四氮唑盐[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2的还原能力，测定敏感细胞和耐药细胞对顺铂的细胞毒性H（H）-如前所述，四氮唑，内盐]到甲霜(31). 简言之，A2780-PAR和A2780-CP20细胞在2×10^三在96 well板中的每个孔中，允许过夜粘附。用对照或ATP7A-和/或ATP7-B靶向siRNA转染细胞。转染48小时后，细胞暴露于浓度增加的CDDP(顺式-二氯铂或顺铂；最终浓度范围为0.01-32μmol/L；LKT实验室）。在顺铂暴露72小时后，将细胞与0.15%3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）在37°C下孵育2小时。去除上清液，将细胞溶解在100μL二甲基亚砜中。记录570 nm处的吸光度，IC₅₀已确定。

ATP7B的免疫细胞化学

肿瘤细胞（80-90%融合）在盖玻片上生长（1:20稀释），在37°C下生长24至48 h，并用50μmol/L岩藻烯二磺酸二钠盐（BCS）处理以降低铜水平，然后用CuCl处理₂或CDDP（2或10μmol/L）在37°C下浸泡1 h。通过将细胞在−20°C下的丙酮中浸泡30 s来固定细胞，然后在4°C下在含有1%明胶/1%牛血清白蛋白的PBS封闭缓冲液中隔夜封闭。用抗NH的一级抗体培养细胞₂-ATP7B和syntaxin-6（TGN标记物）的末端结构域在室温下1小时（每种抗体1:500稀释）。用PBS清洗三次30分钟后，用荧光标记的二级抗体（Alexa Fluor 488驴抗鼠ATP7B和Alexa Fluor 555驴抗鼠syntaxin-6；分子探针，Invitrogen）培养细胞1小时。如上所述，用PBS再次清洗细胞，然后使用含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚的安装介质安装细胞（Vector Laboratories）。图像使用100×蔡司共焦扫描显微镜（卡尔蔡司）进行分析；使用多幅图像和蔡司软件包（轨道选项）评估ATP7B和syntaxin的共定位。

DNA加合物形成试验

80%的汇合细胞与浓度高达20μmol/L的顺铂在37°C下孵育4 h。细胞以1000 rpm离心5 min，并用冰镇PBS洗涤两次。细胞颗粒在55°C下用1 mol/L氢氧化苯乙氧基铵（0.075 mL）消化过夜。然后用0.1 mL 1 N HCl酸化样品，并在火焰原子吸收光谱仪（SpectrAA300，Varian）中测定铂含量。为了测定蛋白质含量，首先用裂解缓冲液对平行培养的细胞颗粒进行裂解，然后用双茚四酮酸法测定蛋白质含量。实验共重复三次，并记录平均值。

顺铂与NH的结合₂-ATP7B（N-ATP7B）的末端结构域

如前所述，N-ATP7B（以前称为N-WNDP）作为与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白被表达和纯化(32). 在结合实验之前，用100μmol/L DTT完全还原纯化的蛋白质，然后使用含有25mmol/L磷酸盐和150mmol/L NaCl（pH 7.5）的缓冲液透析过夜。在室温下，将铜或顺铂添加到N-ATP7B中，使其摩尔比超过蛋白质60倍（超过金属结合位点10倍），持续10分钟。接下来，在黑暗中添加7-二乙氨基-3-（4′-马来酰亚胺基苯基）-4-甲基香豆素（CPM；Invitrogen）5分钟（与金属结合半胱氨酸的等摩尔浓度），并用20μmol/L谷胱甘肽淬火。样品在12%莱姆利凝胶上运行，荧光图像使用FluorChem 5500（Alpha-Innotech Corp.）采集。然后固定凝胶，用考马斯染色，并再次成像。通过密度计将CPM标记强度归一化为蛋白质水平，并表示为不含顺铂时蛋白质标记的百分比。该实验重复三次，并记录平均值。

N-ATP7B在A2780-PAR细胞中的过度表达

电镀24小时后，根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用空载体pTriEx-cDNA或pTriEx-N-ATP7B cDNA（ATP7B-WND）转染细胞。简单地说，用无血清培养基稀释cDNA和脂质乙酰胺溶液（1:2.5比例），将两种溶液混合并在室温下培养20分钟。将该混合物添加到细胞中，在培养6到8小时后，用常规含血清培养基替换无血清培养基。48小时后，对细胞进行胰蛋白酶消化，并将其接种在96孔板中。细胞附着后，将顺铂添加到细胞中，并在37°C下培养72小时。如上所述，通过MTT法测定细胞毒性。蛋白质过度表达的程度也通过Western blot分析证实。

脂质体siRNA制备

对于体内如前所述，siRNA被纳入DOPC(28). 简单地说，siRNA和DOPC以1:10（w/w）siRNA/DOPC的比例在过量的叔丁醇中混合。将吐温20以1:19的比例添加到混合物中（吐温20:siRNA/DOPC）。涡流后，将混合物冷冻在丙酮/干冰浴中并冻干。之前体内给药时，用0.9%生理盐水将该混合物水合至25μg/mL的浓度，每次注射使用200μL的混合物。

卵巢癌原位模型及组织处理

雌性裸鼠（NCr-nu）购自美国国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究与发展中心（弗雷德里克，MD）。所有小鼠均在美国实验动物护理认证协会批准的设施中，按照美国农业部、美国卫生与公众服务部和NIH的现行法规和标准，在特定的无病条件下进行饲养和维护。所有研究均由德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准和监督。所有小鼠在8至12周龄时用于这些实验。

注射前，用PBS清洗肿瘤细胞两次，用0.1%冷EDTA分离，离心7分钟，并在HBSS（Invitrogen）中重组。通过台盼蓝排除法确认细胞活力。通过腹腔注射1.0×10建立肿瘤⁶A2780-CP20或3.0×10⁶RMG2细胞。一旦建立，该肿瘤模型反映了晚期卵巢癌的生长模式(33,34).

使用两种耐铂卵巢癌细胞系A2780-CP20和RMG2进行长期治疗实验。为了评估siRNA治疗对肿瘤生长的影响，在腹腔注射肿瘤细胞1周后开始治疗。小鼠被分为五组(n个=每组10只小鼠）：(一)空脂质体（DOPC；载体）(b条)对照siRNA DOPC（150μ(c（c）)对照siRNA DOPC+顺铂（每周腹腔注射160μ(d日)ATP7B siRNA-DOPC（每周两次150μg/kg i.p.），以及(e（电子）)ATP7B siRNA-DOPC+顺铂（剂量与个别治疗相同）。继续治疗，直到对照组小鼠奄奄一息（通常在肿瘤细胞注射后4-6周）。在处死时，记录小鼠体重、肿瘤重量、结节数量和肿瘤分布。组织样品被快速冷冻以制备裂解物或固定在福尔马林中以进行石蜡包埋。进行尸检、肿瘤采集和组织处理的个体对治疗组分配不知情。

免疫组织化学

如前所述，使用福尔马林固定石蜡包埋肿瘤切片（8μm厚）进行增殖细胞核抗原（PCNA）、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色和微血管密度（MVD）(35). 简言之，在脱蜡和复水后，在微波中使用柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L；pH 6.0）进行抗原回收。内源性过氧化物酶和非特异性表位被3%H阻断₂O（运行）₂/甲醇作用12分钟，5%正常马血清和1%正常山羊血清作用20分钟。切片与初级抗PCNA（PC-10，小鼠IgG；Dako Corp.）或抗CD31（Pharmingen）在4°C下培养过夜，二级辣根过氧化物酶结合抗体（Serotec Bioproducts）在室温下培养1小时。用3,3′-二氨基联苯胺（Phoenix Biotechnologies）底物检测辣根过氧化物酶5分钟，洗涤，用Gill’s 3号苏木精（Sigma-Aldrich）复染15秒并固定。

为了量化凋亡，我们对8μm厚石蜡包埋的肿瘤切片进行了TUNEL染色，如前所述(35). 简言之，在脱蜡后，用蛋白酶K（1:500）处理玻片，阳性对照玻片用DNase处理。内源性过氧化物酶活性被3%H阻断₂O（运行）₂甲醇中。在用TdT缓冲液（30 mmol/L Trizma，140 mmol/L.二甲氨基甲酸钠，1 mmol/L-氯化钴）冲洗玻片后，用末端转移酶（1:400；罗氏诊断公司）和生物素16-dUTP（1:200；罗氏诊断公司）培养玻片，并用2%牛血清白蛋白封闭。然后将载玻片与过氧化物酶链霉亲和素（1:400）在37°C下孵育40分钟，用3,3′-二氨基联苯胺显色剂显影，并用吉尔苏木精复染。凋亡和增殖指数以及MVD由五个随机选择的高功率场（不包括坏死区）中的阳性细胞数确定。为了量化PCNA表达、MVD和凋亡细胞，在10个随机0.159 mm的样本中计数阳性细胞数（3,3′-二氨基联苯胺染色）²放大倍率为100倍的场。两名研究人员以盲法对所有染色进行量化(35).

酶联免疫吸附试验

为了检测ATP7B沉默肿瘤中血管内皮生长因子（VEGF）的水平，我们根据制造商的说明，使用研发诊断公司的VEGF Quantikine试剂盒进行了ELISA。实验做了两次。

顺铂不会改变ATP7B的细胞内定位

为了更好地了解铜转运ATP酶介导顺铂耐药的机制，我们更详细地检测了顺铂对A2780-CP20细胞中ATP7B的影响。在肝细胞中，ATP7B对铜的流出与ATP7B从TGN向囊泡的转运有关(36). 因此，我们询问顺铂是否会诱导TGN中ATP7B的贩运，这是金属流出之前的一个步骤。为了更好地显示顺铂的潜在作用并避免金属竞争，首先用铜螯合剂BCS去除细胞中的铜，然后用顺铂处理细胞(图2). 正如预期的那样，在铜缺失细胞中，ATP7B发现于核周隔室，与TGN标记突触蛋白-6共定位。用顺铂或铜（2或10μmol/L）治疗后，ATP7B模式没有明显变化(图2A). ATP7B与突触蛋白-6保持共定位，并保持在核周位置，这表明在所有实验条件下，ATP7B大部分与TGN标记物共定位。

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图2

顺铂对ATP7B细胞内定位的影响。A、，用抗ATP7B和抗syntaxin-6抗体对A2780-CP20细胞进行免疫染色。显示同位化的叠加图像(白色)ATP7B的(绿色)和syntaxin-6(粉红色).B中，用铜螯合剂BCS（50μmol/L）处理HepG2和A2780-CP20细胞以耗尽细胞中的铜，然后将其保存在BCS中或用CuCl处理₂或顺铂。为了验证在A2780-CP20细胞中缺乏对顺铂反应的ATP7B贩运，我们使用多幅图像和Zeiss软件包评估了ATP7B和syntaxin之间的共定位。HepG2中铜的贩运被用作阳性对照。箭头指示密度测定扫描的方向和长度。

为了验证在A2780-CP20细胞中缺乏对顺铂反应的ATP7B贩运，我们使用多幅图像和Zeiss软件包评估了ATP7B和syntaxin之间的共定位。HepG2中针对铜的贩运被用作阳性对照(图2B). BCS处理后，ATP7B在两种细胞类型中均与TGN标记物共定位。铜升高导致HepG2细胞失去这种共定位，表明存在贩运。然而，在A2780-CP20细胞中ATP7B和TGN标记物的共定位没有显著变化(图2B).

ATP7B沉默增加DNA加合物的形成

虽然ATP7B没有显示出明显的贩运，但它可能通过缓慢地将药物隔离在TGN中或通过在其金属结合位点结合顺铂并使药物不可用来增加细胞对顺铂的耐药性。无论哪种情况，ATP7B的下调都会增加“活性”顺铂的细胞内浓度。为了确定ATP7B基因沉默的效果，我们比较了A2780-PAR和A2780-CP20细胞中的铂含量和DNA加合物形成(图3A). ATP7B基因沉默对全细胞铂积累没有影响（数据未显示），这与缺乏ATP7B转运和金属流出一致。然而，ATP7B沉默导致A2780-PAR和A2780-CP20细胞中DNA加合物形成增加30%(P（P）与未经处理和对照siRNA处理的细胞相比，<0.05；图3A)，提示ATP7B在调节顺铂的细胞内分布中发挥作用。

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图3

ATP7B基因沉默对A2780敏感和A2780耐药细胞DNA加合物形成的影响。A、，将A2780-PAR和A2780-CP20细胞与顺铂孵育4h，然后用1mol/L氢氧化苯乙氧铵消化并用1 N HCl酸化，然后使用火焰原子吸收光谱仪测定铂含量。列，三个独立实验的平均值；条，东南*，P（P）与未经处理或对照siRNA处理的细胞相比，<0.05。B中，顺铂与NH结合₂-ATP7B（N-ATP7B）的末端结构域。重组NH₂-ATP7B的末端结构域与铜或顺铂浓度的增加一起孵育（铜和顺铂添加到N-ATP7B中，以增加摩尔比，使其超过蛋白质60倍）。用半胱氨酸定向探针CPM标记N-ATP7B中的金属配位半胱氨酸。最重要的是，铜/顺铂可以在不影响蛋白质总量的情况下防止CPM标记；底部，三个重复的平均荧光强度，定义100%为荧光/蛋白质比率，标记前未使用配体。荧光凝胶的密度测定表明，这种保护是部分的，因此不是N-ATP7B结合顺铂的所有金属结合位点。C中，N-ATP7B的过度表达增加了铂敏感细胞中的顺铂耐药性。使用Lipofectamine 2000将空载体pTriEx-cDNA或pTriEx-N-ATP7B cDNA（WND cDNA）转染A2780-PAR细胞。48 h后，细胞在37°C下与顺铂（2μmol/L）孵育72 h，并进行MTT分析以确定IC的差异₅₀水平。列，IC的平均值₅₀三个独立实验；条，东南*，P（P）<0.03，与A2780-PAR细胞相比。D、，NH过度表达的Western blot分析₂-A2780-PAR细胞中ATP7B的末端结构域。用上述pTriEx-cDNA或pTriEx-N-ATP7B cDNA转染细胞，通过SDS凝胶电泳分离蛋白质。β-肌动蛋白作为负荷对照。

顺铂与NH结合₂-ATP7B的终端域

ATP7B有一个很大的NH₂-包含六个铜结合位点的末端结构域（N-ATP7B）(37). 此外，N-ATP7B可以结合其他金属，例如锌，尽管亲和力较低(38). 因此，我们接下来检查了N-ATP7B结合顺铂的能力。以前，铜与重组N-ATP7B结合可以保护金属配位半胱氨酸残基不被荧光CPM标记(39). 因此，我们测试了在顺铂浓度增加的情况下是否会发生这种保护作用(图3B). 用铜和顺铂孵育N-ATP7B降低了荧光标记，表明这两种金属都可以与ATP7B中的金属结合位点相互作用。这种与过度表达的ATP7B的结合可能有助于增加A2780-CP20细胞对顺铂的耐药性。检查顺铂是否与NH结合₂-ATP7B的末端结构域足以增加对顺铂的耐药性，我们在顺铂敏感的A2780-PAR细胞中过度表达重组N-ATP7B，这导致耐药性增加2倍（IC5₀)将A2780-PAR细胞转化为顺铂(P（P）< 0.03;图3C). 当用空载体（pTriEx）转染A2780-PAR细胞时，正如预期的那样，与A2780-CP20细胞相比，没有表达ATP7B蛋白（A2780-PER-pTriExs）。在A2780-PAR细胞（A2780-PER-WND）中过度表达重组N-ATP7B（70kDa）产生的蛋白质水平与A2780-CP20细胞中全长ATP7B的蛋白质水平相当(图3D)并产生了增加的阻力，这表明NH的结合₂-末端结构域是引起抗性的因素之一。我们试图从经荧光顺铂处理的细胞中分离出His-tagged N-ATP7B，以评估顺铂结合的化学计量比；然而，我们的分析灵敏度不足以进行此类测量。

体内ATP7B抑制对卵巢癌的影响

检测ATP7B基因沉默逆转铂耐药性的治疗潜力体内DOPC使用ATP7B siRNA递送(28). 在治疗实验之前，我们确定了在DOPC中静脉注射ATP7B siRNA后ATP7B基因沉默的持续时间。将携带A2780-CP20肿瘤的裸鼠注射单剂量ATP7B siRNA-DOPC（150μg/kg），24、48、72和96小时后收获肿瘤(图4A). ATP7B siRNA-DOPC在48小时内减少了ATP7B（60%）的表达，并在96小时后恢复到基线水平。基于这些结果，我们每周两次给药ATP7B siRNA DOPC，用于随后的治疗实验。检查siRNA产生的非特异性炎症反应体内，我们在小鼠静脉注射生理盐水、空脂质体（DOPC）、对照siRNA-DOPC或ATP7B siRNA-DOPC后2小时测量血浆中细胞因子水平。在任何一组中，IFN-γ、白细胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和肿瘤坏死因子-α的诱导均不显著(补充表S2)，表明siRNA的给药没有诱导非特异性炎症反应，这与以前的报道一致(40).

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图4

ATP7B基因沉默对卵巢癌的影响。A、，单次给药后0、1、2、3和4天收集的原位肿瘤样品裂解物的Western blot，或DOPC中纳入的对照siRNA。蛋白质水平通过密度测定法定量，表达以任意单位表示。B中，siRNA-介导的ATP7B下调的治疗效果。裸鼠腹腔注射1.0×10⁶A2780-CP20或3.0×10⁶RMG2细胞，随机分配至以下组之一：空脂质体组、对照siRNA-DOPC组、对照siRNA-DOPC+顺铂组、ATP7B siRNA-DOPC组和ATP7B-siRNA-OOPC+顺铂。在肿瘤细胞注射后1周开始治疗，每周两次以150μg/kg体重的剂量给予siRNA/脂质体。当任何组的动物出现垂死（A2780-CP20，3周后；RMG2，5周开始治疗）时，处死所有动物，并进行尸检，记录小鼠重量、肿瘤重量和位置。Student’s对肿瘤重量进行了统计分析t吨测试*，P（P）<0.05，与空脂质体或对照siRNA-DOPC相比；**，P（P）<0.001，与对照siRNA-DOPC+顺铂或ATP7B siRNA-DOPC相比。

为了模拟晚期小体积疾病的治疗，我们在肿瘤细胞注射后1周开始使用A2780-CP20和RMG2模型进行治疗(图4B). 小鼠被分为以下五组(n个=每组10只小鼠）：(一)空脂质体(b条)控制siRNA-DOPC(c（c）)对照siRNA-DOPC+顺铂(d日)ATP7B siRNA-DOPC，以及(e（电子）)ATP7B siRNA-DOPC+顺铂。当任何组的动物出现垂死时（根据细胞系的不同进行3-5周的治疗），所有动物都被处死。与空脂质体或对照siRNA-DOPC治疗相比，单独使用ATP7B siRNA-DOPC治疗两种模型的肿瘤重量减少了40%至60%(P（P）< 0.05; RMG2肿瘤）。联合治疗（ATP7B siRNA-DOPC和顺铂）导致更大程度的减少（A2780-CP20和RMG2模型分别为70%和88%；图4B)肿瘤重量比顺铂/对照siRNA-DOPC或ATP7B siRNA-DOPC单独(P（P）与空白脂质体或对照siRNA-DOPC相比，A2780-CP20和P（P）RMG2肿瘤中与对照siRNA-异构化或ATP7B siRNA-DOPC相比<0.001）。

为了进一步评估ATP7B治疗对肿瘤生长抑制的影响，我们分析了肿瘤发生率、肿瘤重量分布和结节数量。同样，联合治疗效果最好，肿瘤结节减少60%(P（P）与空脂质体和对照siRNA DOPC组相比<0.05），且减少75%(P（P）与空脂质体和对照siRNA DOPC组相比<0.05）(表1；补充图S2). 根据行为、饮食习惯和活动能力的变化评估，在治疗实验期间，动物没有发现明显的毒性。两个治疗组的平均体重也相似（数据未显示）。

我们感谢Robert R.Langley、Donna Reynolds和Fang Wang的技术专长和有益讨论。

赠款支持：卵巢癌研究基金会、扎罗基金会、得克萨斯大学M.D.安德森卵巢癌卓越研究专业计划的项目开发拨款P50 CA 083639、贝蒂·安·阿舍·默里杰出教授和马库斯基金会（A.K.Sood）；国家癌症研究所F31CA126474少数民族学生奖学金（G.N.Armaiz-Pena）；NIH通过贝勒医学院（M.M.K.Shahzad）赞助的女性生殖健康研究拨款HD050128；国立癌症研究所-卫生与公众服务部NIH 32培训拨款T32 CA101642（Y.G.Lin和A.M.Nick）；NIH拨款DK071865（S.Lutsenko、V.Zuzel和E.S.Leshane）；和NIH拨款CA16672（Z.H.Siddik）。