介绍
炎症反应需要激活一个复杂的基因表达程序，该程序涉及数百个基因的诱导转录，这些基因的产物抑制微生物定植、招募和激活白细胞、增加血管通透性、放大反应并保护炎症细胞和组织细胞免受凋亡(Medzhitov，2008年). NF-kB/Rel、IRF和STAT家族的转录因子(伊瓦什基夫和胡，2004；海登等, 2006；本田和谷口，2006年)是炎症基因表达的成熟调节器。然而，关于炎症的基本转录协同调节因子、染色质修饰物和转录回路的知识仍然相当原始。
我们以前报道过组蛋白去甲基化酶（HDM）Jmjd3在炎症刺激下由NF-kB在小鼠原代巨噬细胞中快速诱导，而其副Utx在低水平和恒定水平上表达(德桑塔等, 2007). 只有LSD1例外(施等, 2004)，所有已知的HDM都属于JmjC家族，其中包括当前人类基因组注释中的27个成员(Klose和Zhang，2007年；Shi和Whetstine，2007年；克洛斯等, 2008). JmjC结构域是从细菌到哺乳动物常见结构基序的变体，即2-组氨酸-1-羧酸面部三联体(科恩托普等, 2005)，用作绑定二价铁的平台。该基序的金属中心用于激活分子氧并将氧原子转移到基底。金属中心受分子氧攻击的启动取决于与底物的结合，在某些情况下，还取决于与2-氧乙酸辅因子（通常是α-酮戊二酸）的结合。尽管加氧酶与2-组氨酸-1-羧酸盐面部三联体进行的代谢转化谱非常广泛(Loenarz和Schofield，2008年)动物体内的JmjC蛋白显然只能催化羟基化反应。如果羟基化的目标是甲基赖氨酸，则会生成一个不稳定的羟基-甲基，作为甲醛分子释放，从而最终恢复赖氨酸残基的非甲基化状态(冢田等, 2006). 总的来说，JmjC家族HDM的特点是对氨基末端组蛋白尾部中的目标赖氨酸具有高度的特异性，并且可以逆转甲基化水平（单甲基化、二甲基化和三甲基化）。
组蛋白H3（H3K27me3）中密切相关的Jmjd3和Utx特异性去甲基化三甲基赖氨酸27，这是一种与转录抑制相关的染色质修饰(阿格等, 2007；德桑塔等, 2007；局域网等, 2007；李等, 2007). 因此，NF-kB诱导的Jmjd3上调将炎症与组蛋白修饰的控制联系在一起，组蛋白修饰涉及谱系决定、分化和组织内环境稳定(基米西斯等, 2004；博伊尔等, 2006；布雷肯等, 2006；李等, 2006；Sparmann和van Lohuizen，2006年；勃艮第等, 2008；森等, 2008)，这可能在慢性炎症和相关分化改变（例如化生，在德桑塔等, 2007). 然而，Jmjd3诱导对先天免疫和炎症的具体贡献（如果有的话）仍然未知。在本研究中，我们研究了Jmjd3的基因组分布，它与H3K27me3、H3K4me3和RNA聚合酶II（Pol_II）占据率的关系，以及它在控制脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞基因表达程序中的作用。我们在这里报道的数据显示，Jmjd3参与调节LPS刺激的巨噬细胞的转录输出，并表明这种活性在很大程度上独立于H3K27me3去甲基化。
结果
LPS活化巨噬细胞Jmjd3基因组分布分析
LPS诱导Jmjd3依赖于转录因子NF-kB的多个进化保守结合位点(德桑塔等, 2007)映射到基因的一个区域，该区域包含一个大CpG岛和H3K4三甲基化的多个峰值(补充图1)，可能代表转录起始的替代位点。炎症转录因子如NF-kB的多个保守结合位点的存在(海登等, 2006)提示Jmjd3可能参与炎症基因表达程序的控制。为了解决这种可能性，我们使用染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）分析了新合成的Jmjd3在小鼠骨髓源性巨噬细胞中的基因组分布。用LPS和干扰素γ（IFNγ）刺激巨噬细胞2小时，对应于这些细胞中Jmjd3诱导的峰值(). 我们生成了一组约800万个高质量且唯一对齐的读取。使用非常严格的错误发现率（FDR）=0.1%（标记簇与⩾9重叠）作为截止值，我们确定了4398个峰，而考虑到\10878»7标记簇，共检测到14013个峰(补充表一). 考虑到FDR=0.1%，进行了后续分析。通过ChIP–qPCR对一组典型的Jmjd3靶点在受刺激巨噬细胞和未受刺激巨噬细胞中的验证表明，与峰值呼叫有良好的相关性，总体验证率约为93%(补充图2A). Jmjd3结合优先发生在转录起始位点（TSS），通常在编码区内延伸不同距离(；补充图3). 百分之五十四的Jmjd3峰在绘制的TSS的±0.5 kb范围内，其中70%以上在2.5 kb范围之内，这一数值远高于随机分布的预期值。
Jmjd3在LPS刺激的巨噬细胞中的基因组分布。(A类)Jmjd3在原代小鼠骨髓源巨噬细胞中的诱导作用。western blot（左）和RT-qPCR（右）分析显示。(B类)Jmjd3与TSS相关性的全基因组分析。用LPS+γIFN刺激巨噬细胞2 h，测定Jmjd3峰相对于定位TSS的分布。(C类)Jmjd3与小鼠5号染色体的代表区域结合。这个年axis表示峰值中的标签数。(D类)同一区域的放大图显示了Jmjd3与两个基因的TSS的关联。(E类)Jmjd3招募动力学。Arhgef3的TSS1在ChIP-Seq数据中对Jmjd3为阴性，用作阴性对照。鸟苷酸结合蛋白6（Gbp6）编码一种抗病毒GTPase，代表LPS+γIFN诱导的最丰富的蛋白质之一。误差条：来自三次重复实验的s.e.m。(F类)Jmjd3敲除巨噬细胞中ChIP信号的消减。在野生型和Jmjd3中进行了抗Jmjd 3 ChIP−/−胎儿肝源性巨噬细胞。
以启动子周围±100kb为界点，我们发现4331个Jmjd3峰（98.5%）与3339个基因相关（基于DBTSS数据库中注释的TSS；补充表一). Jmjd3与chr5的一个大型（0.85 Mbp）代表区域的绑定如并且相同区域的放大视图显示在。Jmjd3向单个靶基因募集的动力学曲线密切反映了Jmjd 3蛋白整体水平的行为()和ChIP信号依赖于Jmjd3的存在，正如它们在Jmjd3敲除巨噬细胞中的消除所表明的那样(；补充图2B)。
在活化的巨噬细胞中，新合成的Jmjd3被迅速招募到数千个基因的TSS中(补充表一)包括那些编码LPS诱导的免疫反应和炎症介质，如趋化因子（例如。Cxcl2公司,Cxcl11号机组,Ccl5公司)、细胞因子（例如。天花α，伊尔6,第27页)蛋白质或酶参与微生物识别和杀死(2个,节点1,节点2，多个2′-5′寡腺苷酸合成酶家族成员，抗病毒GTPases，如Gbp2-6)粘附分子和免疫受体(Sdc4公司,图标1,40加元,Cd83号,Cd86号)，补充组件(C3类)，生长因子(素食主义者,素食主义者)、信号转导子和转录因子(雅克2,社会保障1,社会保障3,Nfkbie公司,Nfkbiz公司,Bcl3公司,六月,六月,红外线2,Irf7型)，组织相容性分子(H2-第2季度)和参与前列腺素生物合成的酶(第2部分). 因此，活化巨噬细胞中广泛存在的Jmjd3基因组募集似乎为脊椎动物中Jmjd 3基因表达与NF-kB活化的进化联系提供了一个令人满意的解释。
Jmjd3分布与基因活性相关
为了系统分析Jmjd3结合的TSS的转录状态，我们首先生成了H3K4me3的基因组图谱，这是一种与激活或准备激活的基因TSS相关的组蛋白标记(库扎里德斯，2007年；鲁森伯格等, 2007)在未刺激和4小时LPS+IFNγ刺激的初级巨噬细胞中。在每种条件下获得了1700多万个唯一对齐的测序读数，分别对应21 418和19 631个峰（FDR 0.1%）(补充表二和三); 18 618个（87%）峰在未刺激和刺激的巨噬细胞之间重叠，用于进一步分析(补充表四). 与先前的基因特异性数据一致(培养等, 2007)，H3K4me3在几个LPS+IFNγ诱导基因处快速上调：根据每个H3K4me3簇内的总标签数，H3K4me3强度在173个基因的TSS处增加了2倍以上，在496个基因处增加了1.5倍以上(补充表四；补充图4)从而表明H3K4me3在该系统中具有非常动态的行为（与胚胎干细胞分化过程中发现的情况相反）(米克尔森等, 2007；赵等, 2007). 酵母H3K4me3在不到2小时内完全翻转的观察结果(苏厄德等, 2007)也支持这一修改的动态性质，并表明ChIP测量的稳态水平实际上可能反映了动态平衡。
通过数据的视觉浏览表明Jmjd3结合与H3K4me3阳性和水平之间有很强的相关性(). 为了定量评估Jmjd3和H3K4me3全基因组之间的相关性，我们按照总标签数（形成峰值的标签数）的顺序对LPS刺激细胞中的所有19631个H3K4me3峰值进行排序。然后我们计算了每个箱子中与Jmjd3峰重叠的峰的百分比。几乎100%的最高H3K4me3峰与Jmjd3峰相关(；补充表四). 在标签计数较低的H3K4me3峰值中，与Jmjd3的相关性稳步下降(). 当考虑预刺激H3K4me3水平时，相关性要弱得多（数据未显示）。重要的是，并非所有强阳性H3K4me3基因都与Jmjd3结合(；补充表四)Jmjd3似乎优先与上调H3K4me3水平的TSS结合：在H3K4me3增加2倍的173个基因中，106个基因（61%）与Jmjd结合。一些具体示例如所示和补充图5和6。
Jmjd3与转录活性和诱导型基因的关联。(A类)Jmjd3与H3K4me3阳性基因的关联。图中显示了chr 11代表区域的Jmjd3峰和H3K4me3峰（在未刺激和LPS刺激的巨噬细胞中）。(B类)LPS刺激巨噬细胞中H3K4me3水平与Jmjd3结合的相关性。H3K4me3峰被分为从左到右总标记数递减的区间。这个年轴表示H3K4me3峰与Jmjd3峰重叠的百分比。(C类)代表基因Jmjd3和H3K4me3之间的关联。(D类)Jmjd3结合强度与高水平H3K4me3的相关性。(E类)LPS刺激后2小时Pol_II水平与Jmjd3结合的相关性。基因按Pol_II强度从左到右递减的顺序分组。这个年axis显示与Jmjd3相关的活性RNA Pol_II阳性基因的百分比。
接下来，我们测量了LPS刺激后Jmjd3和H3K4me3水平之间的相关性。显示了Jmjd3峰值中重叠标签数的方框图，以及相关H3K4me3集群的总标签数。LPS处理后，Jmjd3 ChIP信号强度似乎与H3K4me3 ChIP强度呈正相关，表明Jmjd 3以某种程度上与基因活性强度成正比的方式与活性基因结合。由于H3K4me3和Jmjd3的分布经常重叠，并且由于新合成的Jmjd 3暂时并入H3K4 HMT络合物中(德圣塔等, 2007)一个简单的可能性是，Jmjd3通过与H3K4组蛋白甲基转移酶的结合，优先被招募到活性H3K4me3沉积或周转的位点。事实上，一些表现出最高水平Jmjd3募集的基因是那些在刺激后经历大量H3K4me3增加的基因（例如。Ccl5公司,2个,40加元) (；补充图6； 补充表四)。
为了更直接地评估Jmjd3募集与基因活性之间的相关性，我们在未刺激、2小时和4小时LPS刺激的初级巨噬细胞中生成了总Pol_II的基因组图。在未刺激的巨噬细胞中获得了约900万个唯一对齐的测序读数，而在这两个时间点，在刺激的巨噬细胞上获得了超过1200万个读数。Pol_II转录活性通过检测几个诱导基因内部区域的Pol_II信号来指示，包括2个,Ccl5公司和红外1(补充图7). 使用高强度截止值（FDR=0.1%），我们在未刺激巨噬细胞库中发现总计55600个Pol_II峰，在2和4 h刺激的库中分别发现57 201和57 514个峰值。在每个库中，>70%的峰位于已知TSS的±10 kb处，而在模拟实验中与随机峰的关联度为26%。此外，>99%的波峰与基因区域有关（基因的±100 kb），而在基因沙漠中发现的Pol_II波峰不到1%。
在与Pol_II相关的17389个基因中，有3992个基因（23%）在LPS模拟后2小时相应Pol_II峰值内的总标签数增加了两倍以上，其中1510个基因（1510/3992；38%）也与Jmjd3结合。反过来，当考虑与Jmjd3结合的3339个基因时，其中73%（2438个）的基因在LPS后2小时Pol_II活性增加（峰值总标签数增加>25%），因此表明Jmjd 3结合偏向于LPS诱导或增加其转录的基因子集。为了定量测量转录活性和Jmjd3结合之间的相关性，我们首先将基因分组在Pol_II标记数减少的基因箱中，然后计算每个基因箱中与Jmjd 3结合的基因的百分比。LPS刺激后2小时Pol_II标记总数最高的78%基因是Jmjd3靶基因(). 在标签数较低的基因中，与Jmjd3的关联性稳步下降。与预刺激Pol_II库的相关性要弱得多，与4小时LPS刺激库的相关性略弱（数据未显示）。总的来说，这些数据表明Jmjd3优先被招募到Pol_II占用率和基因活性高且可诱导的位点。
Jmjd3靶基因的H3K27me3状态
Jmjd3唯一已知的底物是H3K27me3，最简单的预测与其作为H3K27脱甲基酶的生物化学活性相一致，即Jmjd 3被征募到与基础H3K17me3水平相关的基因中，以减少它们并启用或增强转录激活。
为了验证这一预测，我们在未刺激和LPS刺激的巨噬细胞中生成了H3K27me3基因组图；在未经处理和LPS处理的细胞中，从抗H3K27me3 ChIP抗体中分别获得970万和1400万个唯一对齐的序列，对应于59 684和89 093个峰，FDR为0.1%(补充表五和不及物动词). 与其他系统类似，H3K27me3峰值实际上通常是宽区域的一部分（以前定义为b条路本地铝富集，BLOC）(保勒等, 2009)平均大小为21.2 kb和27.8 kb（分别在未经处理和经LPS处理的巨噬细胞中）(补充表七和补充数据). 在未经处理和经LPS处理的巨噬细胞中，5733个BLOC中H3K27me3峰的百分比分别为72.3%和66.6%。然而，这些广阔区域内外的峰值行为是可比较的（参见补充数据)因此，在手稿的下一节中，我们将提到波峰，而不是BLOC。大多数病例（2963/3339；88%）中的Jmjd3靶基因在LPS刺激之前，因此在Jmjd诱导之前，与±1 kb范围内的任何H3K27me3峰无关(；补充表七). 在少数具有多个TSS的基因中，具有不同的H3K27me3关联，Jmjd3似乎在H3K27me3阴性TSS处被选择性募集(补充表八). 因此，Jmjd3对靶基因的募集不依赖于预先存在的H3K27me3，并且在大多数募集位点Jmjd3不会遇到H3K27me3。考虑到所有（基因和外源）Jmjd3峰，只有少数（511/4398；11.6%）与相邻（±500 bp）H3K27me3峰相关(补充表八). 在这些峰值中，只有83（16.3%）在LPS刺激4小时后下降了两倍以上。该值与LPS处理后在基因组其他地方观察到的H3K27me3峰值减少两倍的频率相似（17.6%，相当于59173个峰值中的10385个）。显示了整体H3K27me3峰（以红色显示）和与Jmjd3重叠的峰（以蓝色显示）之间的强度变化比较。两组受刺激时H3K27me3模式的变化非常相似。
Jmjd3绑定和H3K27me3。(A类)Jmjd3-结合基因缺乏基础H3K27me3。Jmjd3和H3K27me3在chr5和chr11两个代表区域的ChIP-Seq剖面图。(B类)Jmjd3结合区和非结合区H3K27me3的减少在统计学上相似。这个x个轴表示H3K27me3水平在LPS刺激下的折叠变化。这个年轴显示H3K27me3峰值的分数。(C类)LPS刺激后Nos2和Upp1的H3K27me3降低。LPS后H3K27me3峰值下调由阴影框指示。(D类)LPS刺激巨噬细胞Upp1和Nos2处H3K27me3的减少反映了核小体丢失。使用针对H3K27me3或总H3的抗体进行ChIP–qPCR。H3K27me3/H3比值是通过将H3K17me3信号除以用抗H3抗体获得的信号来计算的。数据是指四个具有代表性的实验中的一个实验，其结果在性质上相似。
综上所述，这些数据表明，与远处的峰值相比，靠近Jmjd3的峰值H3K27me3减少的概率在统计上没有显著增加。
然而，一些H3K27me3峰在LPS刺激后迅速减少，并且这些峰中的一部分与Jmjd3相关。因此，我们试图了解这种减少的分子基础，以及是否是由于酶去甲基化。LPS后这些峰值的H3K27me3信号减少可能反映了酶去甲基化、组蛋白交换或核小体丢失。为了区分这些可能性，我们分析了两个Jmjd3相关基因，其中两个基因表现出最高的刺激诱导减少，2个和向上1(；补充图6). 在这两种情况下，H3K27me3下调完美地反映了伴随基因诱导的总H3水平的降低(、上部和中部面板）。事实上，当H3K27me3 ChIP数据归一化为总H3时，未经处理和处理的细胞没有发现差异(，底部面板），表明核小体丢失而不是酶去甲基化是H3K27me3减少的机制。对所有其他基因进行分析后，也观察到类似的数据（数据未显示）。因此，诱导基因的核小体耗竭在LPS刺激的巨噬细胞中广泛发生，可能是因为与Pol_II大量延长相关的大量核小体置换(补充图7); 相反，我们无法获得证据支持在LPS处理后的前4小时内发生H3K27me3去甲基化。Jmjd3介导的H3K27me3去甲基化，我们之前在Bmp2型基因，事实上发生的动力学要慢得多(德圣塔等, 2007). 我们推测H3K27me3脱甲基反应的速度较慢在体外需要较高的酶底物比和较长的培养时间(阿格等, 2007；德桑塔等, 2007；局域网等, 2007；李等, 2007)再加上与Jmjd3的短暂接触，使得Jmjd 3在LPS后的最初几个小时内介导H3K27me3去甲基化的可能性极低。迄今为止发表的关于JmjC催化组蛋白去甲基化反应的少数动力学研究与这一解释相一致，因为它们报告了非常缓慢的底物周转率（0.01分钟−1) (Culhane和Cole，2007年)。
最后，应该注意的是，H3K27甲基化增加（新峰或BLOC的出现以及先前存在的峰强度的增加）比其丢失或减少更常见(；补充表七). 然而，H3K27甲基化的增加严格来说是基因特异性的，并且H3K27me3和Ezh2水平没有任何全局变化，在LPS刺激后这两个水平保持不变(德桑塔等, 2007)。
总的来说，这些数据表明，在这个系统和这个时间窗口中，Jmjd3独立于H3K27me3去甲基化调节转录。这种可能性与之前的观察结果一致，即通过逆转录病毒RNA干扰使Jmjd3耗竭的巨噬细胞中的大多数基因下调，但并不明显，也没有报道多梳靶点(德桑塔等, 2007)以及神经承诺期间所选靶基因的脱甲基依赖性控制(勃艮第等, 2008)。
Jmjd3对活化巨噬细胞转录程序的贡献
为了确定Jmjd3缺失对LPS刺激触发的基因表达程序的功能影响，我们从基因捕获产生的Jmjd 3敲除小鼠胎肝（14.5 dpc）中提取巨噬细胞（将在别处描述）。从这些小鼠获得的巨噬细胞缺乏Jmjd3 mRNA和蛋白质(). 从western blot分析来看，Jmjd3的缺失并未严重影响H3K27me3/2/1和H3K4me3/2/1的整体水平(). 此外，巨噬细胞的分化和对LPS激活的反应没有受到干扰，正如所测试的巨噬细胞标记物所示()。
Jmjd3组蛋白甲基化和分化分析−/−巨噬细胞。来自Jmjd3胎儿肝脏的巨噬细胞−/−分析小鼠Jmjd3蛋白和mRNA的表达(A类)H3K4和H3K27组蛋白甲基化(B类). Jmjd3中的分化和激活标记−/−巨噬细胞如图所示(C类). 上面板：巨噬细胞限制性LysM和Fms基因的mRNA水平。下面板：巨噬细胞标记CD11b和F4/80以及LPS刺激前后的激活标记CD86的FACS分析。
使用LPS+IFNγ处理（4 h）的生物复制品中的RNA进行三次微阵列分析（Affymetrix 1.0 ST阵列）重量或Jmjd3−/−胎儿肝源性巨噬细胞。以2倍变化（FC）为界，Jmjd3中只有33个基因差异表达−/−细胞，其中20.5%为Jmjd3直接靶点。考虑到FC为1.5，237个基因的表达受到影响，而当阈值为1.4时，478个基因受到Jmjd3缺失的影响(；补充表九). 在所有阈值下，Jmjd3直接目标的百分比保持可比性。直接靶点与间接靶点的比例与之前显示的其他共调节因子的比例相似：例如，在polycomb蛋白缺失时差异表达的基因中，只有10%是它们的直接靶点(布雷肯等, 2006). 数据通过20个基因的定量RT-PCR验证(数据未显示），表明微阵列结果的高可靠性。总的来说，所选阈值的降低导致受影响基因的数量大幅增加，而直接Jmjd3靶点的百分比保持可比性，这一事实表明，在大多数基因中，Jmjd 3只会带来小的转录效应，与JmjC家族的其他转录辅调节器类似，Jmjd3调节转录输出，而不是绝对必要的任何基因表达。
Jmjd3对LPS激活巨噬细胞基因表达的贡献。(A类)微阵列结果总结，表明以wt和Jmjd3表示的差异基因数量−/−不同阈值的巨噬细胞及其与Jmjd3的结合。显示了选定Jmjd3目标在热图上的位置。(B类)通过qPCR定量选择差异表达的Jmjd3靶基因的mRNA水平。(C类)使用每个基因的两组引物（在基因图中用编号为1和2的小矩形表示）对相同基因的初生转录物进行分析。数据是相对于管家核仁蛋白基因的新生转录物表达的。RNA Pol_II ChIP(D类)和H3K27me3 ChIP(E类)单位：wt和Jmjd3−/−巨噬细胞。HoxA11的H3K27me3水平显示为阳性ChIP对照，并用作参考。
接下来我们关注一组差异表达基因，即Ccl5公司（FC-2,7），伊尔12b（FC-2,3），Cxcl11号机组（FC-1,63）和Ccl9公司（FC-1,48）更详细地分析Jmjd3缺失对其转录的影响，以及转录变化与H3K27me3和H3K4me3水平变化之间的相关性。在以下情况下伊利12b，Jmjd3结合仅在最近定位的可诱导DNAse超敏位点上游检测到(周等, 2007)而其他基因则显示出与其TSS相关的信号。mRNA水平的降低()通过对新生（未片段化）染色质相关转录物的分析，在刺激后2小时和4小时，这些基因中检测到的RNA Pol_II伸长减少与此密切相关(). 使用ChIP对相同基因的TSS的Pol_II招募进行分析，结果显示敲除细胞中的信号减少相当()，尽管早期Pol_II招募到Ccl5明显未受影响（数据未显示）。因此，似乎Jmjd3的缺失导致Pol_II的招募缺陷，继而导致穿过靶基因的Pol_II分子数量减少。虽然Jmjd3和它的paralog Utx之间的功能关系和相似性目前尚不清楚，但值得注意的是黑腹果蝇Utx与延伸形式的RNA_Pol II共定位，因此提示在正在进行的转录中发挥积极作用(史密斯等, 2008)。
对相同基因的H3K27me3的分析表明，这种组蛋白修饰在其启动子和周围区域不存在(和). 最重要的是，Jmjd3缺失并未导致H3K27me3信号的任何增加，这表明Jmjd 3不会阻止刺激后H3K26me3的增加(). 其他几个Jmjd3靶基因也证实了这一点(补充图9). 我们还检查了H3K27me3在2个和向上1，是与高H3K27me3水平相关的Jmjd3靶点，刺激后迅速降低（参见). 与之前的观察结果一致，H3K27me3的减少是由于核小体丢失而非去甲基化所致，Jmjd3缺失在这些基因上没有引起H3K17me3的任何可检测的变化(补充图9). 最后，目标基因的H3K4me3信号在很大程度上不受Jmjd3缺失的影响(补充图10). 综上所述，这些数据表明，在LPS刺激的早期阶段，Jmjd3缺失对巨噬细胞靶基因的转录影响与对H3K27me3的可测量影响无关。
全基因组分析的一个有趣结果是，大多数与Jmjd3结合的基因在Jmjd 3中没有显示明显的转录变化−/−巨噬细胞。一个简单的可能性是，由其他协调剂提供的功能冗余可能会阻止转录缺陷的发生。另一种可能性（并非相互排斥）是，小幅度的转录变化加上成熟mRNA的稳定性可能掩盖了Jmjd3缺失导致的转录变化。事实上，已有研究表明，炎症细胞因子对诱导mRNA的稳定是最终mRNA水平的主要决定因素，通常会压倒转录变化的后果(郝和巴尔的摩，2009). 因此，我们分析了一组经验证的Jmjd3靶基因的Pol_II招募和新生转录物(伊尔6,Oasl1号机组,第2部分,2个,CD83型,兆位（Gbp6）,干旱5a,如果是1)在微阵列分析中，似乎不受Jmjd3缺失的显著影响。我们发现这些基因的一个子集(伊尔6,Oasl1号机组,2个和第2部分)Jmjd3敲除细胞中Pol_II招募减少(); 对于Il6和Oasl1，我们在新生转录物水平上证实了这种影响(). 然而，在测试的其他基因中，Jmjd3缺失对Pol_II没有任何影响()从而表明Jmjd3在其激活中没有发挥任何作用，或者系统配备了提供功能冗余的机制。因此，在某些情况下，由于缺乏Jmjd3而导致的小转录损伤在mRNA水平上可能不明显，很可能是因为mRNA稳定的影响。
RNA_Pol II和新生转录物分析显示Jmjd3的转录效应在mRNA水平上不明显。(A类)Pol_II ChIP是在一组经验证的Jmjd3靶基因上进行的。P（P）-当达到统计显著性时，显示值。(B类)IL-6和Oasl1基因的新生转录物分析。使用了两组对应于每个基因的5′和3′的引物，如黑色矩形所示（#1和#2）。
讨论
Jmjd3介导的LPS激活巨噬细胞的转录控制
在本研究中，我们分析了Jmjd3对LPS激活的小鼠巨噬细胞基因表达程序的贡献。本研究的主要发现如下：（i）Jmjd3与活性（Pol_II-和H3K4me3阳性）和诱导型基因的TSS广泛相关；（ii）大多数Jmjd3靶基因不受其缺失的影响；（iii）数百个基因在Jmjd3中的mRNA水平发生了轻微（不到两倍）的变化−/−巨噬细胞，而只有少数基因（如Il12b和Ccl5）表现出对Jmjd3的强烈依赖性；（iv）没有基因完全依赖Jmjd3进行诱导或表达；（v） Jmjd3的转录效应似乎在很大程度上或完全独立于H3K27me3去甲基化。
广泛分布和有限转录效应的反直觉组合常见于与蛋白编码基因TSS相关的几个转录协同调节器（尤其是组蛋白修饰酶），特别是MLL/SET H3K4 HMT复合物和多梳群（PcG）蛋白的组成部分。在芽殖酵母中，删除Set1（基因组中唯一的H3K4 HMT酿酒酵母)对转录的影响非常有限，只有20个基因受到1.5倍以上的影响(米勒等, 2001)尽管它与活性基因的TSS广泛相关(Ng公司等, 2003). Menin，MLL复合物子集的成分(横山等, 2004)与活性基因的TSS广泛相关；然而，在所有分析过的细胞类型中，它的耗竭并没有引起转录水平的显著变化(斯卡凯里等, 2006). H3K4me2转化为三甲基化状态所需的MLL和SET复合物组分Ash2L的耗竭仅导致剪接率的轻微降低，而对Pol_II招募和转录水平没有任何可检测的影响(模拟人生等, 2007)。
PcG蛋白也有同样的行为，它们与沉默或受抑制的基因广泛相关。人类成纤维细胞中H3K27 HMT Ezh2的耗竭使约350个基因的表达改变了1.2倍以上，其中约10%是直接靶点。然而，Ezh2结合的1000个基因中的大多数在转录水平上甚至没有受到轻微影响(布雷肯等, 2006)。
除了一些协调剂带来小的转录变化的内在趋势外，在特定的系统和反应中，我们研究了一个额外的因素，即mRNA稳定，可能有助于降低协调剂缺失对mRNA水平的可检测影响的程度：如前所示，对炎性细胞因子反应的信使核糖核酸稳定是最终转录水平的主要决定因素，在某些情况下，它可以掩盖或掩盖转录率的变化(郝和巴尔的摩，2009)。
考虑到这些前提，Jmjd3等转录调控因子的生物影响可能是什么？很容易推测，与其他协调剂类似，Jmjd3可能对系统产生最终影响，该系统反映了大量同时发生的微小变化的组合，而不是有限数量的高强度效应（如用几个序列特异性转录因子观察到的效应）。有人提出了一个类似的概念来解释microRNA的生物效应，在大多数情况下，microRNA会改变数十或数百个靶点的mRNA和蛋白质水平，但变化幅度不超过10-20%(贝克等, 2008)。
尽管数百个基因仅受到Jmjd3缺失的轻微影响（不到两倍），但少数基因在表达上对Jmjd 3表现出更高的依赖性，例如Ccl5公司和IL12b级（分别调节T淋巴细胞的募集和Th1极化）。总的来说，Jmjd3缺失直接或间接影响其表达的基因列表包括一些已知的炎症和免疫反应参与者，如趋化因子(Ccl3公司,第4类,Ccl5公司,Ccl9公司,Cxcl11号机组)、细胞因子（例如。伊利12b,伊尔6)和抗菌分子（例如GTPaseIgtp蛋白); 然而，很明显，定义Jmjd3对微生物反应（以及一般炎症反应）的生物影响需要详细说明体内突变小鼠的分析。
活化巨噬细胞中H3K27me3标记物的稳定性
尽管组蛋白甲基化是一种不可逆修饰的长期教条已被HDM的鉴定打破(施等, 2004；冢田等, 2006)，生物化学研究支持这样的观点，即这种修饰的周转总体上相当缓慢(Byvoet公司等, 1972). 此外，在某些特定情况下，组蛋白甲基化非常稳定：例如，在细胞核体细胞移植到卵母细胞中时，供体细胞核中的H3K9me3在几天内不会被清除(桑托斯等, 2003)。
对于人类基因组中编码的27个JmjC家族蛋白中的一些，组蛋白尾部的甲基化赖氨酸是将这些酶与其生物效应联系在一起的相关底物这一概念得到了一些证据的支持：组蛋白氨基末端肽去甲基化的能力，分离的组蛋白和在某些情况下组装的核小体在体外和体内; 参与多蛋白复合物介导染色质修饰和转换；单个JmjC蛋白缺失后，基因和位点特异性组蛋白赖氨酸甲基化增加(Klose和Zhang，2007年；Shi和Whetstine，2007年；克洛斯等, 2008). 对于rbr-2秀丽隐杆线虫H3K4me3脱甲基酶Jarid1a/Rbp2的直系同源基因，表达缺乏JmjC结构域蛋白的突变蠕虫显示H3K4me3水平增加，表明rbr-2在平衡同源H3K4 HMT的作用中起着全局作用(克里斯滕森等, 2007). 同样，在酵母中，H3K4甲基转移酶Set1和JmjC蛋白Jhd1作为拮抗对调节H3K4me3/2的全球水平(苏厄德等, 2007)。
然而，HMT和HDM的非组蛋白底物和/或非酶活性（例如多分子复合物中的结构功能）可能介导这些酶的几种生物作用的可能性也在慢慢出现(黄和伯杰，2008). 例如，p53中选定赖氨酸残基的甲基化状态由H3K4me2/1特异性去甲基化酶LSD1控制(黄等, 2007). 很明显，尽管对每种JmjC蛋白的整个底物补体的最终鉴定将是一项复杂而持久的工作，但组蛋白代表其作用的唯一底物的假设是限制性的，可能总体上是不正确的。
总的来说，我们的数据表明，H3K27三甲基化是巨噬细胞LPS激活后最初几个小时内的一种稳定组蛋白修饰，这与它在执行分化和维持细胞类型特异性基因表达程序中的主要作用相一致。具体而言，在LPS刺激后的前4小时内，H3K27me3的变化在两个方向上都出现峰值，增加比减少更常见。当考虑到H3K27me3富集的广泛区域时，只有3个区域在刺激下表现出高于两倍的减少，而113个区域则增加了两倍以上。虽然H3K27me3的增加可能反映了与LPS触发的终末分化相关的基因抑制和沉默，但要了解减量的本质以及Jmjd3在其发生中的参与，需要进行仔细的分析。LPS刺激后，超过10 000个H3K27me3峰值（在全基因组检测到的近6万个峰值中）减少了两倍（或更多）。考虑到与Jmjd3相关的511 H3K27me3峰组，其中83个峰的降幅超过两倍。两组中H3K27me3减少的百分比分别为17.6%和16.3%，表明H3K26me3峰与Jmjd3峰的相邻性并不会增加H3K17me3被擦除的机会。更重要的是，确定H3K27me3峰值中检测到的下降是否反映了真正的酶脱甲基事件。在我们研究的所有案例中，H3K27me3的减少完全是由于与强转录诱导相关的核小体耗竭所致。与这一解释一致，我们研究的Jmjd3相关基因的H3K27me3减少完全不受Jmjd 3缺失的影响。因此，目前我们没有任何直接证据表明酶促H3K27me3脱甲基发生在这一早期窗口。这些观察强烈表明，在微生物刺激后的第一个小时内，早期转录程序的展开独立于H3K27me3去甲基化，尽管需要更多数据来确定这一结论。
在这种情况下，Jmjd3被招募到活跃的TSS，在大多数情况下，它没有机会遇到H3K27me3。此外，受其缺失影响最大的基因（如Ccl5）为H3K27me3阴性，在Jmjd3-ko细胞中H3K26me3没有增加。总的来说，鉴于先前证明Jmjd3可以使H3K27me3去甲基化，对本研究中描述的结果最简单的解释是，尽管在一些特定的情况下（例如需要H3K27me3基因去表达的发育转变）(阿格等, 2007；杰普森等, 2007；伯戈尔德等, 2008；米勒等, 2008；森等, 2008)Jmjd3可能通过清除H3K27me3标记而起作用，在活化的巨噬细胞中（Jmjd 3诱导迅速且短暂），其作用在很大程度上独立于H3K17me3去甲基化。目前，我们仅发现一个基因（Bmp2）在H3K27me3去甲基化过程中经历Jmjd3依赖性减少(德桑塔等, 2007)但值得注意的是，在这种情况下，去甲基化反应的动力学相对较慢（刺激后4到8小时）。
Jmjd3的酶活性是否需要参与炎症基因表达的控制，仍然是一个悬而未决的问题，需要使用合适的方法进行实验来解决。虽然可以重建Jmjd3−/−巨噬细胞重量以及使用病毒载体（数据未显示）对Jmjd3无催化活性，到目前为止，我们还无法复制其表达的生理性、高度调节的时间曲线；此外，通过这种方法获得的表达水平远高于内源性表达水平，因此这种实验不可靠。
结论
这里显示的数据表明，除了在发育和组织更新中所描述的作用外，Jmjd3还参与LPS刺激巨噬细胞所诱导的炎症转录反应。总的来说，Jmjd3对转录输出的影响（在这个系统中，它在很大程度上独立于H3K27me3去甲基化）相当广泛，但在大多数情况下强度较低，这表明它的主要作用是对几个基因的转录速率进行微调，而不是对它们的诱导做出重要贡献。
材料和方法
细胞培养
将从雌性Fvb小鼠分离的骨髓细胞置于10 cm的板中，置于5 ml BM-介质中（高糖DMEM补充20%低内毒素胎牛血清、30%L929条件培养基、1%谷氨酰胺、1%Pen/Strep、0.5%丙酮酸钠、0.1%β-巯基乙醇）。培养物每2天喂2.5 ml新鲜培养基。第7天进行刺激。
Jmjd3敲除巨噬细胞是通过分化从E14.5胚胎获得的胎肝源性细胞获得的（在混合129SvEv-C57BL/6背景中）。细胞首先在细菌（无涂层）培养板上培养2天，然后在刺激前将其转移到标准细胞培养板上再培养5-6天。敲除小鼠将在其他地方介绍。LPS来自大肠杆菌血清型055:B5（Sigma）以10 ng/ml的浓度使用；γ-干扰素（R&D）的剂量为10μg/ml。
染色质免疫沉淀
本研究中生成的ChIP-Seq库如所示补充表十对于Jmjd3 ChIP-Seq实验5×108用LPS+γIFN刺激巨噬细胞2小时。如前所述，使用甲醛和超声波进行固定(德桑塔等, 2007). 将裂解液分为5份3 ml的等分样品，以便进一步处理。对于所有其他测序实验，从1×108细胞。
每个1×108用10μg以下抗体免疫沉淀小份：抗H3K4me3（Abcam Ab8580）、抗H3K27me3（Upstate Biotechnology#07–449）、抗Pol_II（anti-Rbp1，Santa Cruz Biotechnology，供应链-899). 在兔体内制备抗Jmjd3抗体，以对抗小鼠蛋白的C末端，并纯化亲和力。将抗体与100μl G蛋白偶联顺磁性微球（Dynabeads）在0.5%PBS/BSA中预先结合过夜。然后将珠状物添加到裂解液中（省略了预清理步骤），并让孵育过夜。珠在改良的RIPA缓冲液（50mM Hepes pH 7.6、500mM LiCl、1mM EDTA、1%NP-40、0.7%脱氧胆酸钠）中洗涤六次，并在含有50mM NaCl的TE中洗涤一次。DNA在含有2%SDS的TE中洗脱，并在65°C下培养过夜以逆转交联。然后通过Qiaquick柱（Qiagen）纯化DNA，并使用PicoGreen（Invitrogen）进行定量。产量为～300纳克/108细胞（H3K4me3），～10 ng/108电池（H3K27me3和Pol_II），～2.5 ng/108单元格（Jmjd3）。用于ChIP验证的引物–qPCR位于补充表十一。
ChIP DNA文库的制备、测序和计算分析
根据制造商的说明（Illumina），使用T4 DNA聚合酶、DNA聚合物I和T4激酶的混合物同时钝化、修复和磷酸化末端，为Solexa 1G测序制备ChIP DNA。DNA在3′端进行腺苷酸化，并根据制造商的建议使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）回收DNA。通过连接添加基因组分析仪适配器，将连接的片段进行有限的PCR扩增周期（17个周期），并用Qiagen柱对扩增片段进行凝胶纯化。纯化后的DNA用微克林（Invitrogen）定量，并稀释至10 nM的工作浓度。执行聚类生成并加载到流单元的各个通道中；在Illumina 1G分析仪上进行36次碱掺入循环。我们通常为每个ChIP样本生成超过1000万个唯一映射的标记，通过从标记映射位置延伸200 bp推断出每个ChIP片段的位置，并将多个重叠ChIP片段覆盖的区域视为假定的结合位点。
1G分析仪软件包提供的ELAND程序用于将36 bp的读取映射到小鼠基因组（mm8），最多允许两个不匹配。只有在基因组中唯一定位的读数才用于进一步分析。将标签定位坐标向3′方向延伸200 bp，以获得mm8基因组上的ChIP DNA片段位置。因此，获得了全基因组的强度分布。中描述的峰值查找算法陈等(2008)将其应用于该强度剖面以确定可靠的结合区域。基于0.1%的计算估计的FDR，仅选择高于最小强度阈值的峰值。此外，使用抗阴性对照库（anti-GFP）强度FC筛选出标记积累异常高的基因组区域中的高强度峰值，例如卫星重复区域。
库的FDR通过蒙特卡罗模拟确定，其中使用从mm8基因组中随机提取的200 bp片段（具有均匀分布）来估计具有不同强度值的随机峰值的数量。随机片段的数量等于库的排序深度。FDR的强度第页估计为R（右）第页/O（运行）第页哪里R（右）第页和O（运行）第页分别是随机峰值和实际峰值的数量，强度为⩾第页。选择满足FDR标准的最小强度作为调用置信峰的下限。
为了根据阴性对照文库（抗GFP）过滤ChIP DNA文库中的峰，比较了ChIP DNA和对照文库中峰强度的比值，并且只保留强度为FC⩾5的峰。在比较中，根据测序深度将峰值强度归一化。让我炸薯条(x个)我控制(x个)代表以基因组位点为中心的峰值强度x个分别在ChIP DNA和对照库中。那么该峰值的FC由下式给出
哪里N个炸薯条和N个控制分别是ChIP DNA和阴性对照文库的测序深度，以及d日表示此处设置为1的Dirichlet先验值。5.0的FC截止值相对严格。
ChIP_排序数据保存在GEO公共存储库中(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并且可以使用登录号进行检索{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE17631”，“term_id”：“17631”}}GSE17631。
定量RT-PCR和新生转录分析
使用Trizol（Invitrogen）从巨噬细胞中提取RNA，并用随机六聚体逆转录。为了分离新生转录物，细胞在含有0.3 M蔗糖和0.8%NP40的HB缓冲液（10%甘油、60 mM KCl、15 mM NaCl、1.5 mM HEPES pH 7.9、0.5 mM EDTA）中溶解。然后将细胞核通过HB中的0.9 M蔗糖垫制成丸，再悬浮在100μl NRB中（75 mM NaCl，20 mM Tris–HCl pH 7.5，0.5 mM EDTA，50%甘油，100μg/ml酵母tRNA），并通过添加750μl NLB（0.3 M NaCl.，20 mM HEPES pH 7.6，0.2 mM EDTA.，7.5 mM MgCl）进行裂解2，1 M尿素，1%NP-40，100μg/ml酵母tRNA）。然后将染色质在4°C的微型离心机中造粒，并在Trizol中提取新生转录物。为了控制基因组DNA污染的缺乏，还对未逆转录的RNA进行了qPCR。所用引物的序列为补充表十二。
