BRCA1-deficient mammary tumor cells are dependent on EZH2 expression and sensitive to Polycomb Repressive Complex 2-inhibitor 3-deazaneplanocin A

Julian Puppe; Rinske Drost; Xiaoling Liu; Simon A Joosse; Bastiaan Evers; Paulien Cornelissen-Steijger; Petra Nederlof; Qiang Yu; Jos Jonkers; Maarten van Lohuizen; Alexandra M Pietersen

doi:10.1186/bcr2354

乳腺癌研究。2009; 11（4）：R63。

2009年8月26日在线发布。数字对象标识：10.1186/公元2354年

预防性维修识别码：PMC2750125型

PMID：19709408

BRCA1缺陷型乳腺癌细胞依赖EZH2的表达，对Polycomb抑制复合物2抑制剂3-二氮杂卓霉素A敏感

朱利安木偶,^1,² 林斯克·德罗斯特,^三刘晓玲,^三，⁸ 西蒙·乔西,⁴ 巴斯蒂安埃弗斯,^三保利安·科内利森·斯泰杰,¹ 佩特拉·内德洛夫,⁵ 羌余,⁶ 乔斯·琼克斯,^#^三马尔滕·范·洛胡岑（Maarten van Lohuizen）,^#¹和亚历山大·彼得森^#^1,⁷

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料: 附加文件1一个PDF文件，其中包含一个图，显示DZNep可以防止三个独立的BRCA1缺陷细胞系中球体的形成。KB1P-3.12、30.3和40.1细胞在无血清培养基中培养三天后，在超低结合板上，在5μM 3-二氮杂平面霉素A（DZNep）或二甲基亚砜（DMSO。
bcr2354-S1.pdf号文件（180万）
GUID:DFA3E429-A3DB-4A95-951D-C9C9C17652B4

摘要

介绍

随着对现有治疗方法反应不同的肿瘤亚群的认识，乳腺癌的治疗变得更加个性化。乳腺癌1基因（BRCA1）缺陷型肿瘤通常是基础亚型，与低生存率相关，这突出表明需要更有效的治疗。

方法

我们研究了一种小鼠模型，该模型与巴西航空公司1-突变载体，以更好地了解肿瘤进展的分子机制，并测试靶向多梳组蛋白EZH2是否是BRCA1缺陷肿瘤的假定治疗方法。

结果

基因表达分析表明EZH2在BRCA1缺陷小鼠乳腺肿瘤中过度表达。通过免疫组化，我们发现EZH2蛋白水平的增加在肿瘤中也很明显巴西航空公司1-突变携带者。EZH2负责抑制驱动分化的基因，因此可能参与这些肿瘤的未分化表型。重要的是，我们发现BRCA1缺陷的癌细胞选择性地依赖于其升高的EZH2水平。此外，EZH2的一种化学抑制剂，3-二氮杂卓霉素a（DZNep），在杀死BRCA1缺陷细胞方面的有效性约为纯BRCA1乳腺肿瘤细胞的20倍。

结论

我们通过特定的敲除实验证明，EZH2过度表达与BRCA1缺陷乳腺癌细胞的功能相关。小分子抑制剂的有效性表明EZH2是一个药物靶点。EZH2在所有基底样乳腺癌中的过度表达，需要进一步研究靶向这种特定乳腺癌类型的基因构成的可能性。

介绍

乳腺癌是一种异质性疾病。Perou及其同事和Sorlie及其同事的研究表明，至少可以根据分子图谱识别出五种不同的亚型[1,2]. 这些不同的亚型可能由乳腺中不同细胞类型的转化和/或不同基因的突变引起。很明显，乳腺癌亚型在治疗反应和总生存率方面存在显著差异，这表明每个亚型都应该接受不同的治疗[三]. 在某种程度上，这已经是常见的做法，因为ErbB2过度表达的肿瘤用herceptin和雌激素受体（ER）阳性肿瘤用他莫昔芬或芳香化酶抑制剂治疗[4]. 然而，对于其他组，如缺乏ErbB2、ER和孕酮受体（PR）表达的基底型肿瘤，目前缺乏合理设计的治疗。这些肿瘤的特征是分化程度低，推测它们可能来自未分化的乳腺上皮细胞，或至少在转化过程中获得干细胞样特性[5]. 目前，这些肿瘤的标准治疗是化疗。尽管蒽环类药物等化疗药物具有初步效果，但基底细胞样肿瘤在所有乳腺癌亚型中表现出最差的总生存率。这突出表明需要更有效的治疗。

在目前的研究中，我们调查了一组基底样乳腺肿瘤的分子治疗潜力：这些肿瘤发生在具有遗传突变的女性中巴西航空公司1这些肿瘤的特征是第二个肿瘤的消失巴西航空公司1等位基因，伴随性缺失TP53型功能和未分化的基底样表型[6-9]. BRCA1缺陷型乳腺肿瘤表现出侵袭性行为，与它们的基底样特征一致，并与生存率低相关。在细胞水平上，BRCA1功能丧失的一个重要后果是DNA双链断裂修复受损[10]. 由于未解决的双链断裂将激活p53，导致细胞周期停滞或凋亡，因此在BRCA1相关的乳腺肿瘤发生中，p53功能的丧失面临着巨大的选择压力。此外，最近的证据表明，BRCA1的缺失抑制了向ER-阳性管腔细胞的分化，这可能导致未分化表型[11].

我们开发了一种模拟人类BRCA1缺陷乳腺癌的小鼠模型，以深入了解BRCA1缺乏肿瘤的分子进展，并测试假定的治疗方法[12]. 在此模型中布尔卡1和第53页由角蛋白14启动子驱动的Cre重组酶的组织特异性表达会删除基因，角蛋白14在乳腺基底细胞（包括干细胞）中活跃[13]. 随后的乳腺肿瘤显示出一种坚实的生长模式，边缘推高，高度增殖，分化差，类似于人类基底样乳腺癌（ER、PR和人类表皮生长因子受体（HER）2阴性）。

重要的是，我们的小鼠模型允许我们比较BRCA1缺陷的乳腺肿瘤（发生于K14cre；布尔卡1^F类/F类;第53页^F类/F类（KB1P）小鼠）患有BRCA1-精通控制肿瘤（发生于K14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第53页^F类/F类（KP）小鼠）。在比较了BRCA1缺陷小鼠乳腺肿瘤和BRCA1阳性对照肿瘤的基因表达模式后，我们注意到鄂尔多斯2BRCA1缺陷肿瘤的表达尤其高。EZH2是多梳组蛋白家族的成员，是表观遗传阻遏物，可阻止细胞周期抑制剂和分化所需基因的表达[14,15]. 我们和其他人已经注意到EZH2型过度表达与具有高增殖率和不良预后的侵袭性肿瘤有关[16-20].

在本文的研究中，我们着手确定EZH2表达增加是否也是人类BRCA1缺陷型乳腺癌的特征，以及BRCA1缺乏型肿瘤细胞是否依赖高EZH2水平生存。这表明EZH2是BRCA1缺陷型乳腺癌的治疗靶点。EZH2是多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚单位，该复合物还含有SUZ12和EED，并通过组蛋白H3（H3-K27me3）中的三甲基化赖氨酸27启动基因沉默[21]. Tan及其同事最近证实，一种小分子抑制剂3-二氮杂内啡肽a（DZNep）可有效降低PRC2组分EZH2、SUZ12和EED的蛋白质水平，并抑制相关的H3K27三甲基化活性[22]. H3-K27me3缺失导致PRC2-silenced基因的重新激活和一些癌细胞系的凋亡细胞死亡。DZNep等小分子抑制剂的可用性使我们能够测试EZH2功能的药理靶向性是否提供了选择性方法来杀死BRCA1缺陷的乳腺癌细胞。

材料和方法

小鼠肿瘤细胞系的建立与维持

如前所述，从KB1P或KP基因型雌性小鼠体内产生的单个肿瘤中生成肿瘤细胞系[23]. 将建立的细胞系在37°C和5%二氧化碳的DMEM-F12培养基（Gibco，Carlsbad，CA，USA）中培养，该培养基补充有10%FCS、50 U/ml青霉素、50μg/ml链霉素（Gibco，Carlsba，CA，US）、5μg/ml胰岛素（Sigma，St.Louis，MO，USA和5 ng/ml霍乱毒素（比利时布鲁塞尔Gentaur）。

BRCA1缺陷肿瘤细胞中BRCA1的重建

用含有完整人类基因组的细菌人工染色体（BAC）克隆RP11-812O5对100万KB1P3.12细胞进行电穿孔（3μF，0.8 kV）巴西航空公司1基因和调控序列。RP11-812O5 BAC来自美国加利福尼亚州奥克兰儿童医院和研究中心[24]. 通过插入pgk/EM7 Neo/KanR阳性选择盒pCEI1修改载体主干[25]通过细菌同源重组进入sacBII基因大肠杆菌SW102型[26]. 在用300μg/ml Geneticin（Gibco-BRL，Carlsbad，CA，USA）筛选两周后，挑选克隆并通过PCR检测人类BRCA1第11外显子是否存在BAC[27].

瘤球形成试验

含有规定生长因子的干细胞培养基（SCM），如[28,29]每次新鲜制备，并添加DZNep（5μm）或二甲基亚砜（DMSO；无药对照）。将细胞胰酶化，用10%的血清灭活，然后用PBS洗涤以去除血清，并在SCM中重新悬浮。对细胞进行过滤以获得单个细胞，使用Casy计数器（德国罗伊特林根Schaerfe Systems公司）对40000个细胞进行计数，然后将其放在带有平底的超低结合板中（美国纽约州科宁市科宁Corning Incorporated公司）。每天检查球体形成情况，72小时后使用蔡司Axiover 25显微镜（德国戈廷根卡尔蔡司显微成像）在索尼Cybershot（日本东京索尼公司）上获得细胞培养图像。

人类乳腺肿瘤样本的分类

人类乳腺肿瘤组织样本来自荷兰癌症研究所的病理档案。巴西航空公司1-通过常规DNA诊断确定突变状态。使用表达数据确定基底样和管腔状态，根据描述的固有基因集对肿瘤进行分类[30].

免疫组织化学

将石蜡包埋的肿瘤样品切片（4μm），用二甲苯处理两次，每次处理10分钟，然后在100%、80%和70%乙醇中水合，使其脱蜡。抗原提取是通过将样品在10 mM柠檬酸钠中在900 W的微波中煮沸1分钟，在250 W的微波下煮沸15分钟，然后在室温下逐渐冷却20分钟来完成的。在PBS中用5%的正常山羊血清封住载玻片。在封住之前，用0.25%Triton对小鼠组织进行额外渗透。样品与抗EZH2的小鼠单克隆抗体孵育过夜（1:100，BD Biosciences San Jose，California，USA）。使用Powervision系统（ImmunoLogic，Duiven，the Netherlands）通过二氨基联苯胺（DAB）氧化进行免疫检测。样品在70%、80%和100%乙醇中脱水。免疫染色后，用Scanscope（Aperio Technologies，Vista，CA，USA）对载玻片进行数字扫描，并由两名观察者（SAJ和JP）以盲法独立计数表达EZH2的上皮细胞核数量。为了进行统计分析，采用Wilcoxon检验比较两个样本和P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

免疫印迹分析

从亚流动板上刮下细胞，并在RIPA缓冲液（150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH 7.5，1%Triton X100，1%DOC，0.1%SDS，1mM EDTA）中裂解。加载等量的蛋白质（10μg），并通过NuPAGE Novex 4至12%SDS-PAGE（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）电泳分离，并转移到硝化纤维膜上。用含有5%牛血清白蛋白（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）的TBST（0.1%吐温20）封闭印迹，并在室温下与一级抗体孵育2小时。用TBST清洗后，用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体培养膜，并用增强化学发光底物检测信号（英国阿默沙姆GE Healthcare）。使用了以下抗体：抗EZH2的小鼠单克隆抗体（1:20，由K.Helin提供）、β-微管蛋白（1:10000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）、抗小鼠IgG-HRP（1:10000）、Biosource International，Camrillo，CA，USA。

定量实时PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA，每个样品用DNase处理1μg。使用SuperScript™第一链合成系统进行RT-PCR逆转录（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；根据制造商的协议）。使用SYBR Green（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司塔克曼通用PCR主混合器）在ABI Prism 7000 SDS（美国加利福尼亚福斯特市适用生物系统公司）上分析生成的cDNA。使用比较C评估产品积累_T型方法（DDC_T型)以Hprt水平作为标准化的内部控制。使用了以下引物（全部用于小鼠转录本）：Hprt（小时）转发：CTGGTGAAAAAGGACCTCG；Hprt（小时）RV:TGAAGTACTCATAGTCAAGGGCA，鄂尔多斯2转发：AAAGACCCTGAATGCAGTCGC；鄂尔多斯2RV:TGATCCAGAACTCTCATCCC。

微阵列分析

的表达式值（Log2比率）鄂尔多斯2从代表18173个基因的寡核苷酸微阵列中获得21个KB1P和32个KP乳腺肿瘤。Liu及其同事描述了RNA提取、RNA扩增、微阵列杂交和数据处理的方法[12]. 用于比较EZH2型小鼠和人类乳腺肿瘤之间的基因表达（Log10比率）特征，我们使用了96例人类乳腺肿瘤的表达谱：18例ER阴性巴西航空公司1肿瘤，34个预后良好的肿瘤和44个预后不良的肿瘤，根据人类70基因特征数据集分类[31].

生长抑制试验

DZNep由YU Qiang（新加坡基因组研究所）提供，曲古菌素A（TSA）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得。这两种化合物均在二甲基亚砜中溶解并储存在-20°C下。在进行生长抑制试验之前，绘制所有细胞系的生长曲线，以确定在五天培养期内确保指数增长的细胞数量。为了进行细胞活性分析，将亚流培养皿进行胰蛋白酶化并过滤，以获得单个细胞。用Casy计数器对细胞进行计数，并在第0天将适当数量的细胞放在96个平板中。在第1天以两倍的连续稀释液加入药物，一式三份。DMSO用作非药物对照。两种药物在细胞上放置120小时。在第5天，使用细胞滴定蓝试验（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测量细胞活力。将细胞滴定蓝试剂直接添加到细胞中（10μl/孔），并在37°C下培养2小时。560时的荧光_前任/590_{相对长度单位}使用帝肯无限m200平板阅读器（奥地利萨尔茨堡帝肯）测量nm。在对仅为中等剂量和非药物对照进行校正后，使用GraphPad Prism 5.00版（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）将数据点拟合到具有可变斜率的乙状结肠剂量-反应曲线：Y=100/（1+10^（（LogIC50-X）*HillSlope）））。至少使用了三个独立的实验来确定半最大抑制浓度（IC₅₀)每个药物/细胞系组合的值。

RNA干扰与DZNep药物治疗

SMARTpool小干扰RNA（siRNA）靶向鄂尔多斯2非靶向对照组购自Dharmacon（美国科罗拉多州拉斐特）。在所有敲除实验之前，确定了所有细胞系的最佳转染条件。在第0天对细胞进行电镀，并根据制造商的协议（Dharmacon，Lafayette，CO，USA）使用DharmaFECT转染试剂转染2μM siRNA，或在第1天提供5μM DZNep。在转染后48、72和96小时采集蛋白质和RNA分析细胞。如上所述，使用细胞滴定蓝细胞活性测定来量化对细胞生长的影响。在第0天将细胞以一定的密度电镀，以便在整个实验期间实现指数增长，并在第1天用siRNA转染或用5μM DZNep处理。转染后24、48、72和96小时记录荧光。细胞培养图像是在索尼Cybershot上使用带有10倍物镜的蔡司Axiover 25显微镜获得的。在所有情况下，数据均来自至少三个独立实验。

结果

在BRCA1缺陷小鼠乳腺肿瘤中Ezh2表达升高

为了确定与BRCA1缺陷型乳腺癌相关的分子变化，我们之前比较了从我们的条件K14cre；布尔卡1^F类/F类;第53页^F类/F类BRCA1-profective乳腺肿瘤（KP）遗传性乳腺癌小鼠模型K14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第53页^F类/F类老鼠。基因表达微阵列分析表明，与KP肿瘤相比，KB1P肿瘤表达基底样乳腺癌标记物，例如p63和角蛋白5[12,32]. 引人注目的是，多梳阻遏物EZH2型在BRCA1缺陷肿瘤中的表达也高于BRCA1阳性对照肿瘤（图（图1a）。1a个). 尽管BRCA1阳性组存在异质性，但几乎所有BRCA1缺陷肿瘤的表现都增加鄂尔多斯2表达，表明在缺乏BRCA1的情况下，可能需要增加EZH2的水平。为了确定mRNA水平的增加是否转化为EZH2蛋白的高表达，我们通过免疫组织化学分析了KB1P和KP肿瘤的组织切片（图（图1b）。1亿). 我们确实发现，BRCA1缺陷小鼠乳腺肿瘤的EZH2蛋白水平高于对照肿瘤，也表明EZH2-表达高于背景值的肿瘤细胞百分比较高（KB1P肿瘤中77%，KP肿瘤中11.5%；WilcoxonP（P）< 0.029; 图图1c1c个).

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图1

鄂尔多斯2在BRCA1缺陷的原发性小鼠乳腺肿瘤中表达升高。（a）mRNA水平鄂尔多斯2BRCA1缺失(K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P）和BRCA1-熟练(K（K）14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第页53^F类/F类（KP））通过微阵列分析分析乳腺肿瘤。平均值（±平均值标准误差）log2比率鄂尔多斯2在21个KP肿瘤中的表达为-0.036（±0.067），在32个KB1P肿瘤中为0.497（±0.054）。这个鄂尔多斯2KB1P肿瘤中的表达明显高于KP肿瘤（*Wilcoxon精确测试）。（b）通过免疫组织化学检测两个独立原发性KB1P和两个独立的原发性KP肿瘤中的EZH2蛋白水平（比例尺代表100μm），代表每个基因型分析的总共四个肿瘤。（c）b中显示的EZH2免疫组织化学定量（*Wilcoxon精确测试）。

EZH2在BRCA1缺陷的人类乳腺肿瘤中过度表达

接下来，我们确定EZH2在人类BRCA1缺陷乳腺癌中是否也过度表达。最近，我们和其他人发现EZH2水平在预后不良的乳腺肿瘤中较高[16,18,33]. 肿瘤来自巴西航空公司1-突变携带者属于这类侵袭性乳腺癌，因此埃兹2 mRNA水平在人类BRCA1缺陷肿瘤中也很高（图（图2a）。2a个). 与我们之前的观察一致，EZH2 mRNA和蛋白质水平相对良好相关[16]，与其他乳腺肿瘤相比，我们观察到人类BRCA1缺陷肿瘤切片中EZH2蛋白水平增加（图（图2b）。2亿). 为了便于直接比较，我们同时对管腔A、基底样和巴西航空公司1-变异的乳腺肿瘤。如前所述[16,18,33]，我们发现基底样肿瘤中EZH2水平高于管腔A型肿瘤（图（图2b）。2亿). 根据相同的检测标准，BRCA1缺陷肿瘤中的EZH2水平至少与散发性基底样肿瘤中的一样高（Wilcoxon无显著差异P（P）<0.164），与管腔A型肿瘤（Wilcoxon）相比显著增加P（P）<0.002，图图2c2厘米).

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图2

EZH2型在BRCA1缺陷的人类乳腺肿瘤中过度表达。（a）平均值（±平均值标准误差）log10比率EZH2型人乳腺癌组织中的表达[45]为-0.15（±0.041；>5年生存期，预后良好）、0.028（±0.046；<5年生存率，预后不良）和0.177（±0.047；BRCA1缺乏）。EZH2型三组之间的表达显著不同（*Kruskall-Wallis检验）。（b）人类乳腺肿瘤组织中EZH2的免疫组织化学（比例尺代表100μm）。每个亚型的单个肿瘤有两个例子，代表了每个亚型分析的总共六个肿瘤。（c）b中显示的EZH2免疫组织化学定量（*Wilcoxon精确测试）。

BRCA1缺陷细胞依赖于EZH2

为了确定增加的EZH2水平在BRCA1缺陷的肿瘤细胞中是否具有功能相关性，我们使用了来源于KB1P和KP小鼠乳腺肿瘤的细胞系[23]. 总的来说，我们使用了一组由三个BRCA1缺陷细胞和三个BRCA高效细胞组成的细胞系，这些细胞系均来自单个原发性肿瘤。虽然DZNep是EZH2功能的选择性抑制剂，但已经报道了对其他表观遗传标记的一些影响，例如H4K20甲基化[22]. 为了确定观察到的DZNep的作用是否是由于其对EZH2的特异性抑制，我们纳入了靶向siRNA鄂尔多斯2在我们的实验中。

定量PCR证明高效敲除鄂尔多斯2BRCA1-profective和BRCA1-deficient细胞中的mRNA水平（图（图3a）。3a年). DZNep不影响鄂尔多斯2mRNA水平，如前所述[22]. 然而，使用任何一种药物进行治疗鄂尔多斯2-特定的siRNAs或DZNep导致KB1P和KP细胞中EZH2蛋白水平显著降低（图（图3b）。3亿). 治疗48小时后，当靶向DZNep或siRNAs降低EZH2水平时，KB1P细胞出现明显毒性鄂尔多斯2，但在用非靶向对照siRNA处理的KB1P细胞中没有（图（图3c）。3立方厘米). 相反，EZH2水平降低也没有明显效果鄂尔多斯2敲除或DZNep治疗，在BRCA1-profective肿瘤细胞中。通过生长抑制试验对治疗效果进行更定量的评估表明，DZNep对KP细胞有一些不利影响。然而，DZNep的这种作用与EZH2无关，因为鄂尔多斯2不会抑制这些细胞的生长（图（图3d，三维，蓝线）。这可能是由于DZNep对H4K20或其他甲基化事件的影响。相反，KB1P细胞受到EZH2水平降低的严重影响，用靶向siRNAs处理的KB1 P细胞的生长受到强烈抑制就证明了这一点鄂尔多斯2（图（图3d，三维，红线）。在BRCA1缺陷细胞中，用DZNep处理抑制生长甚至比敲除鄂尔多斯2这可能是由于DZNep比siRNAs更有效地消耗EZH2，或者是由于DZNep可能对其他表观遗传标记产生影响。然而，与BRCA1阳性肿瘤细胞相比，DZNep在抑制BRCA1缺陷肿瘤细胞方面表现出显著的选择性（图3c、d).

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图3

EZH2是BRCA1缺陷但不精通BRCA1的肿瘤细胞生存所必需的。（a）鄂尔多斯2用定量RT-PCR测定BRCA1缺陷细胞（红色，K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P））和BRCA1-profective细胞（蓝色，K（K）14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第页53^F类/F类（KP））用siRNAs治疗后鄂尔多斯2或5μM 3-二氮杂卓霉素A（DZNep；显示为相对于Hprt（小时）).（b）靶向siRNAs处理KB1P和KP细胞后用western blot分析EZH2水平鄂尔多斯2或非靶向siRNAs（siNTC）和5μM DZNep或载体（二甲基亚砜（DMSO））。（c）用对照（ctrl）siRNAs、siRNAs-鄂尔多斯2或5μM DZNep（原始放大10倍）。（d）对照（ctrl）siRNAs处理的KB1P（用红色表示）和KP细胞系（用蓝色表示）的生长曲线鄂尔多斯2或5μM DZNep。用细胞滴定蓝测量的数据，表示为平均值的平均值±标准误差（三个独立实验）。所示细胞系代表所有三种KB1P和KP细胞系。

BRCA1缺乏使细胞对EZH2-抑制剂DZNep敏感，但对TSA不敏感

为了更好地量化KB1P和KP细胞对DZNep敏感性的差异，我们进行了剂量-反应曲线（图（图4a）。4a类). 引人注目的是，平均IC₅₀BRCA1缺陷细胞为163 nM，而BRCA1阳性细胞50%的生长抑制需要高出近19倍的剂量（平均IC₅₀2944 nM，P（P）<0.0001，t检验；表表11).

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图4

化学EZH2抑制剂DZNep选择性杀伤BRCA1缺陷的肿瘤细胞。（a）BRCA1缺陷细胞系的代表性生长抑制曲线(K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P），蓝色）和BRCA1-profective细胞系(K（K）14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第页53^F类/F类（KP），红色）。将DZNep系列稀释液添加到细胞中，五天后测量细胞活力（每个数据点代表三个独立实验的平均值（SEM）的平均值±标准误差）。（b）用曲古抑菌素A（TSA）处理的BRCA1缺陷细胞系（蓝色为KB1P）和BRCA1高效细胞系（红色为KP）的代表性生长抑制曲线。将TSA连续稀释液添加到细胞中，五天后测量细胞活力（平均值±SEM）。

表1

集成电路₅₀DZNep和TSA对BRCA1-profective和BRCA1-deficient乳腺肿瘤细胞的价值

细胞系	nM DZNep（扫描电镜）	nM TSA（扫描电镜）
*BRCA1-熟练*
KP-3.33型	3202 (284)	27 (1.2)
KP-6.3型	3467 (277)	35 (1.5)
KP-7.7型	2163 (63)	25 (3.8)
*BRCA1缺陷*
KB1P-3.12型	154 (14)	26 (2.4)
KB1P-30.3型	163 (13)	17 (0.6)
KB1P-40.1型	171 (9)	36 (3.4)

比率（KP/KB1P）	18.1*	1.1
重要性	< 0.0001	0.5

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注：括号内的值表示至少三个独立实验的平均值（SEM）的标准误差。比率：平均半最大抑制浓度（IC₅₀)3-二氮杂卓霉素A（DZNep）和曲古抑菌素A（TSA）的值K（K）14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第页53^F类/F类（KP）线与平均IC进行比较₅₀的值K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P）管线*意义：P（P）<0.01（t检验）。

为了排除KB1P细胞通常对表观遗传抑制剂更敏感的可能性，我们在相同的生长抑制试验中测试了组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的作用（图（图4b）。4b个). TSA对KB1P和KP细胞系的影响程度相似（平均IC₅₀26 nM vs 29 nM），无显著差异(P（P）= 0.5; t检验，表表1）。1). 当细胞系在非粘附条件下生长时，DZNep也抑制球体形成，这表明没有BRCA1缺陷细胞的亚群对DZNep[参见附加数据文件1]. 然而，体内实验应该证明靶向EZH2是否抑制所有的肿瘤起始潜能。

重组BRCA1部分恢复了对DZNep的抗性

由于BRCA1功能丧失导致基因组不稳定，我们想确定对EZH2的依赖是否是布尔卡1或者这是否是由致瘤过程中累积的突变引起的次要影响。为了测试这一点，我们重新引入了包含完整人类的BAC克隆巴西航空公司1基因导入BRCA1缺陷细胞系（KB1P-3.12）中，并衍生出几个克隆，这些克隆显示可以重新表达巴西航空公司1（图（图5a）。5a级). 这些细胞对顺铂治疗的敏感性降低，表明引入的BRCA1具有功能（数据未显示）。值得注意的是，我们没有观察到重组细胞系中EZH2水平的下降，这表明BRCA1并不直接影响鄂尔多斯2表达式（图（图5b）。5亿). 然而，用DZNep治疗可将所有细胞系中的EZH2水平降低到类似程度（图（图3b3亿和和5d，5天和数据未显示）。

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图5

BRCA1的恢复部分缓解了对DZNep的敏感性。（a）人体检测巴西航空公司1通过PCR扩增重组亚克隆KB1PR-3.12 E3和F4中第11外显子的等位基因。以人乳腺癌细胞系T47D作为阳性对照。（b）EZH2蛋白水平（未经处理）K（K）K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P）、KB1PR和K（K）14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第页53^F类/F类western blotting分析（KP）细胞系。对应鄂尔多斯2通过定量RT-PCR测定KB1P、KB1PR和KP细胞系的mRNA水平（显示为相对于Hprt（小时）).（c）BRCA1-deficient cell lines（KB1P，蓝色）、BRCA1-profective cell line（KP，红色）和巴西航空公司1-用3-二氮杂卓霉素A（DZNep）处理的重组细胞系（紫色的KB1PR E3和F4）。向细胞中加入一系列稀释的DZNep，五天后测量细胞活力（平均值±标准误差）。（d）EZH2蛋白水平hBRCA1型-用DZNep或靶向EZH2的siRNA处理48小时后重建的KB1P细胞。

有趣的是，当用DZNep处理重组细胞系时，我们观察到DZNep诱导的细胞死亡得到了实质性的挽救（图（图5c）。5厘米). IC₅₀中DZNep的值巴西航空公司1-重组细胞系与IC更相似₅₀KP细胞的值，比KB1P细胞的值（平均IC₅₀1391 nM，表表2）。2). 这表明BRCA1缺陷细胞对DZNep的敏感性主要是由于BRCA1功能的丧失，而不是由于二次突变。这也表明存在合成致死效应；靶向一个基因的效果（例如。EZH2型)如果没有另一个基因（例如。巴西航空公司1) [34].

表2

集成电路₅₀DZNep对BRCA1缺陷与BRCA1重组乳腺肿瘤细胞的作用

细胞系	nM DZNep（扫描电镜）
*BRCA1-熟练*
KP-6.3型	3523 (463)
*BRCA1-重组*
KB1PR-3.12 E3型	1954 (744)
KB1PR-3.12 F4型	829 (331)
*BRCA1缺陷*
KB1P-3.12型	135 (13)
KB1P40.1型	187 (33)

比率（BRCA1-重建与缺陷）	8.7*
重要性	0.003

在单独的窗口中打开

注：括号内的值表示至少三个独立实验的平均值（SEM）的标准误差。比率：平均半最大抑制浓度（IC₅₀)3-deazaneplanocin A（DZNep）的值K（K）14cre；B类区域协调委员会1^F类/F类;第页53^F类/F类（KB1P）线与平均IC进行比较₅₀KB1P线的值*意义：P（P）<0.01（t检验）。

尽管重组细胞对DZNep的抵抗力提高了八倍以上，但救援工作尚未完成。这可能是由于老鼠和人类的不同巴西航空公司1或实现正确数量的巴西航空公司1表达式。另外，其他突变可能在DZNep敏感性中起到次要作用。

总之，我们已经证明，DZNep选择性地抑制BRCA1缺陷但不抑制BRCA1-profective乳腺肿瘤细胞，并且这种作用主要是由于BRCA1-defective细胞依赖于EZH2，而BRCA1-rofectives细胞则不依赖于这一事实。

讨论

乳腺肿瘤巴西航空公司1-突变携带者在生命早期出现，表现出与整体生存率低相关的侵袭性、基底样表型。深入了解这种乳腺癌亚型的分子构成将有助于开发更有效的治疗方法。在这项研究中，我们证明EZH2在来自巴西航空公司1-突变携带者，与我们在BRCA1缺陷型乳腺癌小鼠模型中观察到的情况类似。此外，敲除实验表明BRCA1缺陷型乳腺肿瘤细胞的生存依赖于EZH2。有趣的是，尽管EZH2水平在BRCA1阳性对照细胞中也降低到了类似的水平，但这些细胞似乎受EZH2-缺失的影响较小。这表明靶向EZH2与BRCA1缺乏症相结合具有合成致死性。可以想象，对高EZH2水平的依赖源于体内仅发生在BRCA1缺陷而非BRCA1精通细胞中的肿瘤发生过程。BRCA1的恢复并没有降低EZH2水平，这一观察结果表明，表达增加是由更多永久性变化引起的。然而，这种突变或表观遗传改变不一定要针对鄂尔多斯2直接，但也可能发生在EZH2的上游调节器中。请注意，选择鄂尔多斯2过度表达可能发生在其他乳腺肿瘤中，如图中一些主要的BRCA1阳性小鼠肿瘤所示图1a。1a个这项研究的中心问题是，乳腺癌细胞的生存是否需要EZH2的过度表达，或者这是否是致癌过程的副产品，我们的数据表明，尽管BRCA1缺陷细胞仍然依赖于其EZH2的表达，但在BRCA1完整的细胞中，EZH2-的丢失具有更好的耐受性。

既然我们已经确定了EZH2在BRCA1缺陷细胞中表达的功能重要性，那么我们很有兴趣了解为什么这些肿瘤选择性地依赖EZH2，以及这种依赖性是否是BRCA1功能丧失的特异性，或者更多地与这些肿瘤的基础样特征有关。选择EZH2/EZH2型肿瘤发生过程中过度表达。

关于BRCA1缺乏的特定作用，EZH2可能对DNA修复有影响。据报道EZH2型过表达抑制Rad51家族的基因[35]，可能减弱BRCA1缺陷细胞的DNA损伤信号。这表明EZH2型过度表达可能在BRCA2缺陷肿瘤中发挥类似的作用，这些肿瘤与BRCA1缺陷肿瘤在同源定向双链断裂修复中受到相同的损伤。然而，我们没有观察到EZH2在乳腺肿瘤中的表达增加巴西航空公司2-突变携带者（数据未显示），表明EZH2的主要致癌作用与DNA修复无关。另一种可能的解释是，在BRCA1缺陷的乳腺肿瘤中，EZH2选择性过度表达可能与EZH2在起源细胞中的作用有关。具体来说，BRCA1的缺失与干细胞的特性有关，而BRCA1缺失与管腔分化不相容[11]. EZH2是维持胚胎和成人干细胞所必需的，在乳腺中相对较少的细胞中表达，并且仅在具有未分化表型的乳腺肿瘤中过度表达[16,19,36]. 此外，EZH2沉默的基因的很大一部分包括调控谱系特异性分化的转录因子[37,38]. 因此，可以设想EZH2型需要保持转化细胞的未分化状态。通过DZNep或siRNAs降低EZH2水平可能导致诱导分化的基因表达，这种结果可能与BRCA1的缺失不相容。

然而EZH2型似乎不会引起典型PcG靶基因的过度抑制[16,39]，表明它具有不同于沉默其正常靶基因的后果。一些研究小组确实发现了肿瘤细胞中以PcG蛋白标记的基因的证据[22,40]. 然而，这些基因的沉默是否导致了EZH2型BRCA1缺陷肿瘤细胞中的过度表达，以及这些基因是否包括更经典的肿瘤抑制因子或特异性分化因子。

EZH2在更多未分化的基底样细胞中的特定功能模型与我们的KB1P肿瘤确实比KP对照肿瘤更基础的观察结果一致[12]. 这就提出了一个问题，即是否不仅BRCA1缺陷型乳腺肿瘤，而且散发性基底样肿瘤都依赖于EZH2型过度表达。我们的观察表明，BRCA1功能的恢复否定了肿瘤细胞对DZNep的敏感性，这可能与此相反。然而，尽管巴西航空公司1散发性乳腺癌的突变很少见，有迹象表明，相当大比例的散发性乳腺肿瘤与BRCA1缺陷肿瘤有共同特征，这一特征被称为BRCAness[41]. 与BRCA1相同的生化途径中功能基因的改变可能会有效地导致BRCA1功能的丧失[9]. 表现出这种特征的零星基底样肿瘤可能对EZH2抑制特别敏感。最近，冈萨雷斯和同事们[42]表明击倒EZH2型减少两种ER阴性人类乳腺癌细胞系的增殖。有趣的是，这种效应似乎部分归因于BRCA1蛋白水平的上调。这与我们的数据不一致，我们的数据显示，没有BRCA1的细胞对EZH2的减少特别敏感，这表明抑制布尔卡1不是EZH2的主要致癌功能。此外，乳腺肿瘤巴西航空公司1-突变携带者总是会失去其他携带者巴西航空公司1等位基因，表明选择丢失巴西航空公司1高水平的EZH2不能实现表达。然而，观察到这两种基底样乳腺癌细胞株也对EZH2抑制敏感，并且反复观察到EZH2型过度表达是基底样乳腺肿瘤的特征，需要进一步研究EZH2作为药物靶点。

不幸的是，我们的初步体内对DZNep的研究表明，其对小鼠具有显著毒性（数据未显示）。我们目前正在研究这是否是由于某些正常细胞类型依赖于EZH2型或者这是否是由于DZNep的化学性质。前者将使EZH2抑制作为乳腺癌的治疗策略复杂化，而后者可以通过使用其他EZH2-抑制剂或DZNep类似物来解决，目前正在开发中。此外，尽管DZNep抑制BRCA1缺陷肿瘤细胞的球形形成，并且考虑到EZH2在干细胞和癌症中的作用[43],体内需要进行研究以确定靶向EZH2本身或结合其他治疗方法是否能彻底根除肿瘤。

结论

铂类药物与聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂联合应用的临床前研究和临床试验巴西航空公司1-突变型乳腺癌是一个例子，说明了解肿瘤亚型的基因构成如何提供有针对性的、可能更有效的治疗[34,44]. 我们的数据表明，BRCA1缺陷的肿瘤细胞选择性地依赖EZH2的表达，并表明EZH2-的药物破坏可以为治疗巴西航空公司1-突变型乳腺癌，也可能是散发性基底样乳腺肿瘤。

缩写

BAC：细菌人工染色体；BRCA1：乳腺癌1基因；BSA：牛血清白蛋白；DAB：二氨基联苯胺；DMEM：Dulbecco的改良鹰介质；DMSO：二甲基亚砜；DZNep:3-去氮那普霉素A；ER：雌激素受体；EZH2：果蝇zeste基因增强子的人类同源物；FCS：胎牛血清；HER：人表皮生长因子受体；HRP：辣根过氧化物酶；IC50：半数最大抑制浓度；KB1P公司：K14cre；布尔卡1^F类/F类;第53页^F类/F类，来自该基因型小鼠乳腺肿瘤的细胞是BRCA1缺陷的；KP公司：K14cre；布尔卡1^{w个.t吨/w个.t吨};第53页^F类/F类，来自该基因型小鼠乳腺肿瘤的细胞是BRCA1-profective细胞；PARP：聚ADP-核糖聚合酶；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PcG：Polycomb集团；PR：孕酮受体；PRC2：多梳压制杂岩2；逆转录聚合酶链反应；SCM：干细胞培养基；siRNA：小干扰RNA；TSA：曲古菌素A。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

AP发起了这项研究，与MvL和JJ一起构思设计，并与JP一起撰写手稿。JP参与了设计，并进行了大部分实验和数据分析。RD用她创建的重组细胞系进行了实验。XL提供了细胞系和微阵列数据的面板。就IC的设置和分析提供建议₅₀研究。PC进行了western blot和定量PCR。PN提供了人体肿瘤样本。SA参与了这些样本的免疫组织化学分析。QY提供了DZNep。MvL和JJ在整个研究过程中提供了专家建议。所有作者阅读并批准了最终手稿。

补充材料

附加文件1：

一个PDF文件，其中包含一个图，显示DZNep可防止三个独立的BRCA1缺陷细胞系中的球体形成。KB1P-3.12、30.3和40.1细胞在无血清培养基中培养三天后，在超低结合板上，在5μM 3-二氮杂平面霉素A（DZNep）或二甲基亚砜（DMSO。

单击此处获取文件^{（180万，pdf）}

致谢

作者感谢安克·斯巴曼（Anke Sparmann）和马蒂杰斯·沃霍夫（Mathijs Voorhoeve）对手稿的批判性阅读，以及乔普·维瑟斯（Joep Vissers）的有益讨论。我们感谢海顿·普洛瑟提供pgk/EM7 Neo/KanR-阳性选择盒（pCEI1）。这个大肠杆菌SW102菌株是Neal Copeland和Nancy Jenkins送给我们的礼物。我们感谢Peter Bouwman和Hanneke van der Gulden提供修改后的RP11-812O5 BAC。作者的资助如下：JP（Roland-Ernst Foundation奖学金）、RD、XL、BE和JJ（荷兰癌症协会，NKI 2007-3772）、SA（荷兰癌症学会，NKI2007-3749）、PC、，AP和MvL（荷兰癌症协会，NKI 2007-3803和生物医学遗传学中心），PN（NKI/AvL）和QY（A*STAR）。没有一个资助机构在研究设计中有发言权；数据的收集、分析和解释；撰写手稿时；或者决定将手稿提交出版。

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文章来自乳腺癌研究：BCR由以下人员提供BMC公司