介绍
第一种将DNA导入秀丽线虫由Craig Mello开发等。 1在过去的17年里，这种方法没有改变，简单明了：DNA被注射到雌雄同体的性腺中。注入的DNA连接形成染色体外阵列，并最终并入细胞核。因为染色体在秀丽线虫在有丝分裂中是完全定心的，任何DNA片段都可以作为着丝粒，因此这些染色体外阵列在有丝裂中被复制并分离到子细胞。然而，这种产生转基因品系的方法受到一些限制。首先，这些微小染色体的行为不像真正的染色体——它们在有丝分裂或减数分裂中并不完全稳定。因此，转基因动物是镶嵌的——一些细胞携带转基因，而其他细胞则丢失了阵列。其次，这种阵列包含数百份注射的DNA拷贝，并且基因过度表达。这种高拷贝数可能会导致主要的负面或有毒影响2第三，这些重复排列在包括肌肉在内的一些组织中被沉默三,4和生殖系5。即使通过辐射将阵列整合到染色体中，阵列也可能会沉默，这可能是因为阵列的转录沉默6最后，数组会发生变化，并在许多代中显示表达式的“漂移”7,8; 漂移可能由阵列结构的变化或遗传沉默引起。这些局限性使依赖转基因的稳定、组织特异性表达的研究复杂化。
在极少数情况下，通过生物转化后的同源重组，可以在染色体位置产生稳定的变化9或者，更有效的方法是在切除转座子后通过模板定向修复。例如，动员Tc1转座子会在染色体的特定位置诱导双链断裂；断裂可以通过从转基因模板复制DNA来修复10,11这些突变株的缺点是基因组中有数百个转座子的拷贝；许多地点都会发生断裂，任何特定地点的事件发生频率都可能很低。要生成单拷贝转座子插入果蝇属Mos1元素被引入秀丽线虫 12Bessereau小组最近证明，特定的DNA变化可以针对Mos1插入位点13。此技术称为莫斯1励磁感应吨转基因的-我构建基因转化（MosTIC）。这些作者证明，他们可以在特定基因中插入标签或工程删除。MosTIC依赖于要修改的遗传位点是否存在Mos1插入。NemaGENETAG联盟已经建立了一个大规模的Mos1插入文库，该文库在基因组中具有已知位置14.
在本研究中，我们使用MosTIC技术的一种变体，将基因间Mos1元件用于常规插入转基因。我们称之为这种技术莫斯1-介导秒单一的c（c）副本我插入（MosSCI）。我们证明，转基因以单拷贝形式插入到一个确定的染色体位点。该基因座支持明显内源性水平的广泛组织表达。重要的是，在经常沉默转基因的组织中观察到稳定表达，包括雄性和雌性生殖系。插入可以在转基因菌株中有效诱导，也可以直接从注射的动物中获得。
结果
插入方法
一个完美的整合位点应该是遗传中性的，所以我们选择了一个符合以下标准的Mos1插入。首先，插入不应该破坏相邻基因的功能。其次，附近的启动子和增强子不应影响插入的转基因的表达。基于这些原因，我们选择了基因组区域3′到编码区域。我们鉴定了几个插入到尾对尾基因区域的Mos1元素，并在ttTi5605型Mos1等位基因，位于II号染色体中心附近作为测试案例（图位+0.78）。
综上所述，其目标是通过Mos1切除在染色体中产生一个双链断裂，并为修复断裂提供同源模板。我们生成了一个染色体外阵列，其中包含来自Mos1元素两侧的约1.4 kb同源染色体DNA。我们在左右两侧插入了要整合的基因().
示意图莫斯1个中介S公司单一的C类副本我插入（MosSCI）。NemaGENETAG联盟分离出一个位于非编码位点的Mos1转座子。Mos1元件可以通过转座酶表达被切除，从而导致染色体中的双链断裂。推测左侧（L）和右侧（R）侧翼的3′端侵入并退火到染色体外阵列中的同源区域。然后，可以通过合成相关的股线退火来修复断裂。阳性选择标记unc-119（+）通过基因转换将感兴趣的基因插入基因组。染色体外阵列包含一个转座酶源（hsp:：转座酶）和两个阴性选择标记，第18周（gf）和荧光mCherry标记。第18周（gf）是钾通道中对温度敏感的显性突变，在25°C时会使动物瘫痪，但在15°C时不会。樱桃标记在咽部、身体肌肉和神经系统中表达，用于对携带阵列的动物进行视觉识别。阵列丢失后，分离出单拷贝转基因动物。L和R同源区域=1.4 kb。
为了识别染色体中的插入物，我们还提供了一个阳性选择标记。这个ttTi5605型Mos1插入被交叉到unc-119（第3版）突变背景。unc-119（修订版3）突变动物体型较小，几乎瘫痪，幼崽较小，饥饿时无法形成达斡尔族幼虫15.通过放置野生类型C.布里格斯埃unc-119在侧翼DNA之间的基因，救援结构也将与感兴趣的基因一起并入该位点。因此，在诱导基因转换后，唯一能够在饥饿中存活的动物将是携带染色体外阵列或整合了unc-119（+）基因。
该策略要求切除生殖系中的Mos1元素，以产生双链断裂。在制作染色体外阵列时，我们在热休克启动子的控制下，为Mos1转座酶合成了序列编码hsp-16-48型 12热休克激活转座子的合成，而转座子又被切除。然后，双链断裂通过基因转换修复，至少在某些情况下，使用染色体外阵列作为模板。
主要的挑战是区分靶向插入和携带染色体外阵列的蠕虫，因为这两种蠕虫都会因阳性而被拯救联合国会议-119共插入标记(). 为了区分整合与阵列，我们将感兴趣的DNA与阴性选择标记共同注射：表达红色荧光蛋白的基因和TWK-18（gf），一种活化的K+在高温下导致肌肉麻痹的通道(补充图1). 这些标记被整合到转基因阵列中，但不会复制到靶向整合中。携带该阵列的动物在15°处活动，可以繁殖。25°时，这些动物瘫痪；只有失去阵型的动物才不会瘫痪。
插入频率和转基因拷贝数
为了测试插入策略，我们构建了一个靶向构建物，其中包含一个在体腔细胞中表达GFP的构建物，作为感兴趣的基因(双关语-122:：GFP)以及救人的积极选择标记联合国会议-119(和补充图2). 为了指导基因转换，这两个基因两侧各有1.4kb的基因组序列，与ttTi5605型Mos1站点。靶向载体、转座酶构建体、工作台-18将阴性选择标记和荧光mCherry标记联合注入unc-119（ed3）ttTi5605mos。然后在15°C下培养注射的动物。五个独立的联合国会议-119选择并繁殖获救株系以扩大种群。获救的动物显示出所有的荧光标记，并在25°C时严重瘫痪。对年轻成年动物的半同步种群进行热休克以诱导Mos1切除。对F2代进行转基因指示修复筛选（详细方案见补充方法）。我们总共对来自5个独立转基因系的1000只动物进行了热休克，并恢复了10个假定的靶向插入(). 与转基因阵列的丢失一致，插入线在25°C时没有瘫痪，也没有表达可检测到的mCherry蛋白。正如从基因组插入中所预期的那样，我们可以分离出假定纯合子动物，这些动物从未分离出表现出Unc-119突变表型的后代。我们证实了10个插入系中有7个在体腔细胞中GFP的弱表达().
转基因的单拷贝插入。（a） 包含Punc-122:：GFP公司转基因和unc-119（+）救援标记（总计4.3 kb）两侧为与ttTi5605毫微秒插入位置。（b） 的表达式Punc-122:：GFP公司MosSCI插入株中的转基因仅限于体腔细胞（箭头所示）。剩余可见荧光为非特异性肠道颗粒荧光。图像是一个成年雌雄同体，左前方。上面是DIC，下面是荧光图像。（c） 插入物的PCR验证Punc-122:：GFP公司转基因。正向引物退火到靶向结构中包含的基因组区域之外的基因组区域，而反向引物位于C.briggsae unc-119（+）可选标记。来自所有MosSCI插入菌株（EG4441-EG4450）的预期大小（1.8kb）的PCR带证实插入位于目标位点。我们将携带染色体外阵列的亲本菌株的暗带解释为体细胞基因转换或PCR桥接水平低的证据13（d）Southern分析证实在60%的菌株中存在单拷贝插入。基因组DNA用EcoRI消化并与GFP特异探针杂交。十个菌株中有六个显示了一条大小合适的单一、特异性条带，以验证单拷贝转基因插入。三个菌株是非荧光的（用星号表示），Southern杂交证明这些转基因包含短的缺失和插入。进一步表征了EG4441和EG4448的分子变化(补充图3和补充图4). 菌株EG4449的荧光明显更强，含有两个GFP拷贝。
表1
体腔细胞特异性插入Punc-122:：GFP公司转基因体腔细胞特异性插入双关语-122:：GFP转基因ttTi5605型（左面板）产生了5株携带染色体外阵列的独立转基因菌株，并在热休克后测定了插入频率。（右面板）共回收了10个MosSCI插入物，并将其列在左面板中与其亲本菌株相邻的位置。对菌株进行运动和GFP荧光救援评分。PCR用于验证在ttTi5605型并在插入后测试是否存在Mos1转座子元件（见补充方法）。Southern blot用于验证Punc-122:：GFP公司转基因插入物。
| 外源菌株 | MosSCI菌株 |
|---|
| 亲本菌株 | 插入频率 | 应变 | 表型 | GFP表达 | 聚合酶链反应ttTI5605型网站 | 转基因插入物 | 应变中的Mos1元素？ |
|---|
| EG4380型 | 2/200 | EG4441型
EG4442型 | 野生型
弱Unc | 不
不 | 是的
是的 | 删除1.8 kb
未注明。 | 未注明。
不 |
| EG4381型 | 1/240 | EG4443型 | 野生型 | 是的 | 是的 | 完全 | 不 |
| EG4382型 | 2/240 | EG4444型
EG4445型 | 野生型
野生型 | 是的
是的 | 是的
是的 | 完全
完全 | 不
未注明。 |
| EG4383型 | 2/60 | EG4446型
EG4447型 | 野生型
野生型 | 是的
是的 | 是的
是的 | 完全
完全 | 未注明。
不 |
第4385页 |
3/260 |
EG4448型
EG4449型
EG4450型 |
野生型
野生型
野生型 |
不
是的
（较亮）
是的 |
是的
是的
是的 | 删除0.8 kb，
0.7 kb插入
串联？
完全 |
不
不
不 |
平均 |
1/100 | | 90%
野生型 | 70%
表达 | 100%
对的 | 60%
对的 | 0%莫斯1
要素 |
聚合酶链反应（PCR）用于证明转基因阵列中的DNA已插入ttTi5605型轨迹(). 我们从十个株系中分离出基因组DNA，并扩增了跨越左连接的序列。这个抄送unc-119（+）DNA被插入到ttTi5605型所有十条线路中的大多数站点。野生型和原始靶向菌株（基因型：unc-119（第3版）；ttTi5605型)证实我们的PCR反应是特异性的。
存在双关语-122:：GFP转基因是通过使用GFP特异探针的Southern分析确定的(). 十个插入菌株中有六个显示了预测的带，对应于单一的靶向插入Punc-122:：GFP公司转基因。我们注意到一株EG4449菌株，通过肉眼检查，其荧光强度略高，似乎是串联插入。正如预期的那样，这三种非荧光菌株要么没有带，要么带大小异常。我们通过“PCR行走”进一步表征了这三种非荧光插入事件；一个底漆固定在Cbr-unc-119号救援片段和其他引物沿着转基因每隔500bp交错排列(补充图3). 与缺乏荧光和南方数据一致，这些菌株删除了Punc-122:：GFP公司转基因。对于其中的两个菌株，我们能够通过缺失进行扩增，并对产物进行测序。EG4441是在Punc-122:：GFP公司转基因和EG4448是一个803 bp的缺失，同时在染色体外阵列的其他地方插入1713 bp(补充图3和补充图4). 在MosTIC中观察到类似的缺失13.
这个Punc-122:GFP公司转基因在体腔细胞中特异表达，表明ttTi5605型该部位允许特定组织表达。为了进一步测试组织特异性表达，我们使用Punc-47:：m樱桃和两个Pdpy-30:：H2B:：m樱桃插入(补充图5). 这些结构分别在GABA神经元或普遍表达。
在某些情况下，插入位点位于不同的染色体上是有利的。一个unc-119（+）为在第四染色体上插入Mos1开发了靶向载体(cxTi10882型，地图位置IV:-0.05）。这个Punc-122:：GFP公司构建物作为转基因。与之前的实验一样，我们将该质粒与编码hsp:Mos转座酶和阴性选择标记，形成染色体外阵列。我们选择了一个转基因系，并对一个成年群体进行了热休克。我们从800只热休克蠕虫中回收了8个转基因插入物，其频率与ttTi5605型现场。在我们详细研究的六个品系中，有五个品系的体腔细胞荧光较弱。
总之，这些结果表明，平均每100只热休克动物中就有1只在两个不同的基因组位点发生插入事件。其中，60%是靶向DNA的功能性单拷贝插入。
较大的转基因
在最初的实验中，我们选择插入Punc-122:：GFP公司因为它的大小很小（3kb），并且表达模式有限。在大多数情况下，更大的转基因是可取的。为了测试较大转基因的整合频率，我们构建了一个6.8kb的unc-18号机组包含上游和下游调控元件以及C末端mCherry标签的基因片段(). 我们选择了unc-18号机组因为突变表型很容易评分，所以表达模式仅限于神经元，表达水平可以通过Western分析确定。将该基因与unc-119（+）生成9 kb的最终插入长度(). 用负选择标记生成了一个数组。我们选择了一个单一的转基因株系，在一个成年群体中通过热休克诱导转座酶表达。从500只热休克动物身上，我们发现了四种靶向整合物(补充表1). 从这个有限的数据集中，插入频率似乎不会受到转基因大小增加的不利影响。四种菌株中有三种具有神经系统特有的均匀暗红色荧光(和补充表1). 要测试unc-18：：m樱桃色转基因是有功能的，我们将荧光线与功能丧失等位基因交叉unc-18（e81）; 所有三个插入都挽救了不协调的突变表型。
独立unc-18：：m樱桃色转基因在近内源性水平上表达。（a） 的示意图unc-18：：m樱桃色和unc-119（+）靶向构建体（9.0kb）。这个unc-18：：m樱桃色转基因包含延伸到相邻基因的上游和下游调控区域。（b） 的比较unc-18：：m樱桃色由MosSCI和生物枪击插入。unc-18:：m樱桃由MosSCI（左）和生物枪轰击（右）插入。在相同的设置下拍摄共焦图像，以比较荧光强度。表达是神经系统特有的，但在生物性菌株UZ566中更为明亮。（c） 转基因拷贝数在荧光MosSCI株系中是一致的。与mCherry特异探针杂交的Southern杂交显示三个荧光MosSCI中预测大小的单拷贝插入物unc-18：：m樱桃色两个生态型品系中的品系和可变拷贝数。MosSCI线UZ557是非荧光的，用星号标记。（d） 用UNC-18多克隆抗体进行的蛋白质印迹显示出均匀的、接近内源性的蛋白质表达水平。全虫从野生型中裂解，unc-18（md299）用UNC-18抗体对无效突变株、MosSCI株和生物抑制株进行印迹。在所有荧光菌株中观察到与内源性位点的野生型UNC-18和转基因的mCherry-tagged UNC-18相对应的适当大小的特异带。MosSCI产生的转基因菌株显示出一致的、接近内源性的蛋白质水平，而来自生物性菌株的可变、更高的表达。unc-18：：m樱桃色降解带用星号标记。
产生稳定转基因的另一种方法是使用DNA包裹的金粒子进行生物转化16。为了比较单拷贝插入和生物转化生成的插入，我们生成了两个unc-18：：m樱桃色整合子（UZ566和UZ567）unc-119（第3版）动物。我们通过基因图谱证实了整合。UZ566表现出比目标插入菌株更明亮的mCherry荧光，并且生长缓慢(). UZ567具有非常明亮的荧光和dauer结构。这些结果与先前的观察结果一致，其中生物转化产生可变的转基因表达，偶尔干扰内源性基因16.我们对所有的unc-18：：m樱桃色测试荧光强度差异是否反映转基因拷贝数差异的整合子(). 用标记的mCherry特异DNA进行杂交，在三个成功靶向插入菌株中检测到一条大小合适的单条带，表明存在单拷贝转基因插入。在生物性菌株中，我们检测到转基因的多个拷贝。
这些单拷贝插入的表达水平与Western blot分析的内源性基因相似(). 我们从野生型动物的整个蠕虫裂解物中检测到一个合适大小的单一条带。正如荧光显微镜所预期的那样，在四个单拷贝插入物中的三个的裂解液中观察到UNC-18:：mCherry融合蛋白。三个荧光菌株的蛋白质水平一致，强度与野生型带相当。相反，与野生型相比，生物型菌株中的蛋白质表达水平彼此不同，并且过度表达。
我们的结论是，至少7kb的转基因可以作为单拷贝插入，而插入频率或保真度没有明显降低。此外，与多拷贝插入相比，基因表达更接近内源性水平。
种系表达
众所周知，在秀丽线虫使用标准方法的生殖系。生殖系中的RNA干扰有效地沉默了重复阵列5,17。即使通过联合注射复合载体DNA或通过生物转化整合DNA来减少阵列的重复性，也很难获得持续许多代的种系表达。虽然还不清楚，但单拷贝定向插入有望绕过此限制先验的那个ttTi5605型该位点允许种系表达。
确定周围区域ttiTi5605钛允许种系表达，我们插入带有种系特异性启动子元件的转基因，并检查表达模式。通过插入一个含有GFP：：组蛋白融合蛋白的转基因基因来检测两性生殖系的表达pie-1型发起人(第1页：：GFP:：H2B). 从三个独立的染色体外阵列线中，我们从3060个热休克P0蠕虫中生成了37个独立的插入物。这相当于每80只热曲棍球蠕虫的平均插入频率为1，在亲本菌株之间存在一定的差异(). 在含有插入物的37个品系中，只有10个表现出强大的种系荧光(). 有趣的是，在一些菌株中分离插入物后，生殖系荧光在三到四代内逐渐增强。低初始表达与Vastenhouw之前描述的重复阵列的残余沉默一致等。 18.在紧张的传递过程中，沉默最终会消失。一旦完全脱细胞的动物被克隆挑选出来，我们在观察了两个品系十多代后，没有观察到生殖系中GFP的重新表达。使用第1页：：GFP构造可能是由基因转换中的错误引起的。与前面的构造不同pie-1型启动子含有几个反向重复序列，可能干扰合成依赖性链退火。
MosSCI插入物在雌性和雄性生殖系中表达。（a） a类Ppie-1:：GFP:：组蛋白转基因在雌性生殖系中表达。比例尺=100μm。（b） A类Pspe-11:：m樱桃：：组蛋白转基因在雌雄同体精子中表达。左，mCherry表达式来自Pspe-11:：m樱桃：：组蛋白是雌雄同体精子特有的。右侧，覆盖DIC图像。大多数精子存在于受精囊中，但也有少数精子存在于性腺（左）和子宫（右）中。比例尺=10μm。右插图中，mCherry表达定位于细胞核。放大4倍。
表2
插入种系特异性P图1：：GFP转基因插入种系特异性Ppie-1:：GFP:：组蛋白在ttTi5605型。我们产生了三个独立的菌株，其中包含Ppie-1:：GFP:：组蛋白在染色体外阵列上。对每个染色体外阵列的传播率进行量化，并对每个菌株进行两次热休克转基因插入测试。我们无法检测到传输速率和插入频率之间的任何明显相关性。插入菌株在25°C的解剖显微镜上进行3-4代后的种系GFP荧光评分。
| 亲本菌株 | 变速器 | 插入频率 | 生殖系荧光？ |
|---|
| EG4855型 | 69% | 12/800 = 1.50%
5/500 = 1.00 % | 4/12
0/5 |
| EG4856型 | 38% | 4/400 = 1.00 %
1/500 = 0.20% | 1/4
1/1 |
| EG4857型 | 44% | 5/360 = 1.39%
10/500 = 2.00% | 1/5
3/10 |
| 平均 | 50% | 37/3060=1.2% | 10/37 = 27% |
为了测试精子中的表达，我们在精子的控制下插入了一个mCherry-histone融合物第11章发起人(Pspe-11:：m樱桃：：H2B). 我们获得了5个独立插入。五个菌株中有三个在雌雄同体精子中表达mCherry标记的组蛋白2B(). 雄性精子中的mCherry:：H2B表达仅限于性腺末端（数据未显示）。总之ttTi5605型该基因座允许在雌性和雄性生殖系中稳健表达。
其他试剂
为了促进基因插入和克隆，我们开发了针对ttTi5605型轨迹(补充图6). 标准克隆载体pCFJ151包含多个克隆位点以及靶向和选择所必需的元件（重组和选择的侧翼区域）Cbr-unc-119（+）). 网关多站点载体pCFJ150在目标序列和选择序列之间包含一个attR4-attR3目的盒。这种靶向载体与Orfeome兼容19和促销员20矢量工具包。
为了便于遗传操作，我们制作了一个菌株（EG4887），可用于平衡插入的转基因ttTi5605型轨迹。我们将表达mCherry-tagged组蛋白的转基因插入肌氨酸-2发起人。牛津Is322在咽肌细胞核中表达mCherry，相对较亮，因此在荧光解剖显微镜上很容易识别。这个标记的染色体可以用于跟踪插入到ttTi5605型轨迹，因为它完美地平衡了十字架上的轨迹。
直接插入
在筛选注射动物的饥饿F2后代时，我们偶尔观察到假定的直接插入。这些动物从来没有被热曲棍球，但他们被救出联合国会议-119没有表达mCherry标记或工作台-18（ts）阴性选择标记的麻痹表型。重要的是，这些菌株表现出相关插入转基因的特异性表达，包括第1页：：GFP:：H2B转基因。我们通过PCR靶向插入证实了这些事件的发生(). 直接插入具有相当大的优势，可以在一周内将其隔离，并且步骤比热冲击协议少得多(). 因此，我们详细描述了直接事件的特征，并测试了优化插入频率的条件。
MosSCI插入可以通过注入直接生成。（a） 靶向含有转基因的示意图unc-119（+）拯救基因和Punc-122:：GFP公司体腔细胞特异性表达转基因。转基因可以通过与种系特异性基因共同注射直接插入P0动物体内Pglh-2:：转座酶如果没有第18周（gf）阴性选择标记。（b） 通过PCR验证转基因在靶位点的插入。在直接注射产生的所有菌株中获得预测大小的PCR产物。（c） Southern杂交证实了在靶点的单拷贝插入。用GFP特异探针对EcoRI消化的基因组DNA进行了探测，并确认八个菌株中有七个含有预测的单拷贝插入物。EG4893含有两个GFP片段，GFP荧光明显更亮。
表3
注射生成的直接插入基因表达的转座子酶更有效地产生直接插入。将注射的P0动物分别放置在一个小NGM板上，对F1后代进行评分联合国会议-119获救的动物数了起来。根据救援和缺乏共注射mCherry标记，对F2子代进行直接插入事件评分。将插入菌株的一个子集纯合子化，并对适当组织中的GFP荧光进行评分。所有选择的菌株都很容易纯合。在与Punc-122:：GFP公司转基因对RNAi细菌的直接插入没有影响。使用种系表达的转座子酶明显更有效(第2页)与热休克诱导转座酶的比较(Phsp-16-48号) (第2页与Phsp-16-48号，p=0.015，双侧Fischer精确检验）。插入频率计算为包含挽救F1子代的平板中导致插入的部分。
| 构造 | Mos T'ase源 | 否定选择？ | RNA干扰(工作台-18) | 注入的数量 | P0s w/resc'd F1 | 平均挽救F1s/注射P0 | 直接积分 | 插入频率（Integr/P0） | GFP？ | Mos1存在吗？ |
|---|
| 第1页：：GFP | Phsp-16-48号 | 年 | 年 | 20 | 未注明。 | 未注明。 | 1 | 未注明。 | 100% | 未注明。 |
| Pspe-11:：绿色荧光蛋白 | Phsp-16-48号 | 年 | 年 | 27 | 17 | 未注明。 | 三 | 18% (3/17) | 未注明。 | 第2页，共3页 |
| n个 | 100 | 63 | 10.6 | 11 | 17% (11/63) | 未注明。 | 第6页，共10页 |
| Punc-122:：GFP公司 | Phsp-16-48号 | n个 | 年 | 137 | 91 | 15.8 | 8 | 8% (8/91) | 100% (5/5) | 第1页，共2页 |
| n个 | 110 | 61 | 13.2 | 5 | 7% (5/61) | 100% (2/2) | 未注明。 |
| 第2页 | 年 | 102 | 63 | 13.2 | 13 | 19% (13/63) | 83% (10/12) | 未注明。 |
| n个 | 130 | 75 | 13 | 13 | 17% (13/75) | 100% (4/4) | 未注明。 |
为了确定直接插入的频率，我们将每一个P0注射到一个平板上。在F1代中，我们计算了产生拯救后代的P0数量；我们认为这些“注射成功的动物”。在F2代中，我们确定了这些P0中有多少产生了直接插入事件。注意，引起直接插入的P0也引起染色体外阵列。当我们注射Pspe-11:：绿色荧光蛋白：：H2B转基因。我们通过PCR和Southern分析验证了这些转基因是真正的插入事件(和补充图7).
插入的频率足够高，因此不使用阴性选择标记直接用注射动物筛选单个平板是可行的。尽管工作台-18（ts）对染色体外阵列提供了强大的阴性选择，在15°C或室温下并不完全良性，因此直接插入更加困难。从63只未使用阴性选择标记的成功注射动物中，我们回收了11个经验证的插入物（17%）。因此，阴性选择标记对恢复直接插入是不必要的（对照组为17%对18%，).
这些动物从未被加热过，但转座酶基因的自发表达能够刺激Mos1的切除。生殖系启动子在性腺中的表达可能比热休克启动子更好。我们在控制种系特异性的情况下，将靶向结构与含有Mos1转座酶的质粒结合glh-2型发起人(Pglh-2:：转座酶)或者，像以前一样，在一个热休克促进剂下(Phsp:：转座酶). 在可直接比较的实验中，种系表达的Mos1转座酶在产生直接插入物方面显著更有效(Pglh-2:：转座酶：26/138个P0（18.8%）vsPhsp:：转座酶：13/152（8.6%），p=0.015，费希尔精确值）。直接整合，使用热休克或生殖系启动子表达转座酶，导致F2子代通常是纯合的。F2纯合子的存在表明，整合发生在注射P0动物的生殖系中，而不是F1子代的生殖系。
直接集成似乎产生了很高比例的完美插入。24人的视觉筛查unc-119（+）注射有Punc-122:：GFP公司靶向载体，证明只有2株菌株在体腔细胞中不能表达GFP，2株菌株表达GFP更明亮，20株菌株似乎是单拷贝插入（通过热休克诱导，分别为83%和60%）。对体腔细胞中表达GFP的8株菌株进行了进一步分析，其中一株为“明亮”表达菌。PCR证实Cbr-unc-119（+）插入正确的基因组位点(). Southern分析表明，其中7株菌株插入了一个转基因副本，另一株也表达相对明亮的GFP（EG4893），插入了两个转基因副本().
直接集成事件不是特定于ttTi5605型Mos1等位基因。我们测试了插入Punc-122:：GFP公司在cxTi10882型第IV号染色体上的Mos1等位基因Pglh-2:：转座酶从67只成功注射的动物中，我们获得了12次插入，成功率为17.9%。总之，这些数据表明，只要将DNA注入性腺，单拷贝DNA就可以高保真地导入基因组。
讨论
我们开发了一种技术，MosSCI，它将单拷贝转基因插入到一个定义明确的基因组环境中秀丽隐杆线虫。在该位点，插入的转基因不会引起明显的突变表型；它们似乎也不受内源性启动子的影响，因为荧光标记在体腔细胞、两性生殖系、精子和神经系统中实现了特异性表达。插入频率是有效的，大约每20只注射动物中有1只，或者每100只热休克动物中有一只。对于大多数测试的构造，在目标位置完成单拷贝插入的比例很高（>60%）。至少可以为两个不同的基因组位点以相似的频率产生插入。
我们描述了两种产生MosSCI插入的方案：直接从注入的DNA插入，或在转座子动员后从染色体外阵列插入。热休克方案较慢，需要更多的实验步骤，但在某些情况下可能是有利的。首先，当一个人学习这项技术时，注射是无效的——对于初学者来说，单一的转基因品系是一种胜利。其次，一些转基因可能很难正确插入，例如，如果转基因很大，或者如果重复性元素影响基因转换。第三，对于赋予显性表型的转基因，阵列中的阴性选择将为具有单拷贝插入物的动物提供选择性优势。
并非所有插入都是完美的。错误的存在表明插入是通过合成相关的链退火（SDSA）进行的21Robert和Bessereau对MosSCI中使用的插入机制进行了描述13。修复过程似乎与中的间隙修复具有许多相同的功能果蝇属 22,23在P元件切除后，对于高达8kb的构建体，插入频率在很大程度上与转基因大小无关，大约25%的插入是包含重复或缺失的复杂转换事件23.我们的结果相似；4kb和9kb插入的插入频率相似(Punc-122:：GFP公司和Punc-18:：m樱桃和10-40%的转基因包含缺失或插入。这些异常结构是如何产生的？我们观察到的结构(补充图4)建议至少通过SDSA进行部分修复21在这种机制中，两个断裂的DNA末端从同源修复模板独立合成DNA，直到这些单链重叠，并可以退火以桥接双链断裂23过早终止或DNA合成不当，继而断裂的非同源末端连接将分别产生缺失或插入。另一方面，这些复杂的结构可能反映了染色体外模板中DNA的结构，因为大约20%的质粒从染色体外重新分离出来秀丽线虫数组包含插入和删除24在这种情况下，基因转换只是复制了染色体外阵列中预先存在的错误。
模板DNA的结构也可能影响错误的频率。在大多数情况下，我们发现只有不到25%的插入包含错误。然而第1页启动子结构导致大量非荧光插入物（73%）可能存在缺陷。这个第1页启动子包含许多来自大内含子的简单反向重复序列pie-1型基因。反向重复序列可以在单链DNA中形成发夹，并可能破坏两条修复的DNA链的退火。或者pie-1型启动子可能只是简单地维持了转基因阵列的遗传沉默效应。携带重复转基因阵列的动物发生遗传沉默18.
MosSCI技术开辟了许多实验可能性。首先，依赖于种系表达的转基因表达和拯救可以比生物基因轰击更快、更可控的方式实现。其次，在相同的基因组背景下，单拷贝插入将有益于结构-功能研究。携带不同结构变体的菌株可以进行比较，因为拷贝数和DNA上下文是相同的。在以下情况下秀丽线虫突变体可以通过其人类直系基因来拯救，这将允许利用蠕虫遗传学的实质优势来分析人类基因。
材料和方法
试剂
菌株EG4322、EG5003和EG4887已存放在卡氏杆菌属遗传中心。转基因插入所需的质粒已经与Addgene一起沉积。
遗传学
线虫菌株：在虫酶中通过目测筛选Mos1等位基因(网址：www.wormbase.org)由NemaGENETAG联合体提供的合适位置的转座子插入。Mos1插入是纯合的，然后通过PCR进行杂交。除Ahringer实验室细菌RNA干扰克隆X-4F11工作台-18用于提高增长率。如前所述准备RNAi板25.
插入技术
将转基因蠕虫注射到EG4322中制成(ttTi5605；unc-119（第3版）)或EG4316/EG5003(unc-119（第3版）III；cxTi10882 IV型)动物1标准注射混合物由50 ng/μl修复模板、50 ng/微升Mos1转座酶（pJL44(Phsp-16-48:：转座酶)或pJL43.1(Pglh-2:：转座酶))，10 ng/μl pCFJ70(Pmyo-3:：twk-18（cn110）)，5纳克/μl pGH8(Prab-3:：m樱桃)，5ng/μl pCFJ104(Pmyo-3:：m樱桃色)和2.5 ng/μl pCFJ90(Pmyo-2:：m樱桃色). 在后来的直接插入实验中pCFJ70(Pmyo-3:：twk-18（cn110）从注射混合物中删除。联合国会议-119动物严重瘫痪，卵子发育不良。因此，将L1-L2动物手动分布在OP50的草坪上，并选择非常年轻的成年人进行注射。将注射的动物分别转移到标准NGM板上，并放置在15°C下。在注射后3天，对表型挽救的F1动物的数量进行平板评分。
热休克协议
从F2后代中挑选出稳定阵列传输系的克隆群体。为了加快人口增长速度工作台-18室温下的RNAi板。我们测试了由以下因素导致的负温度选择Pmyo-3:：twk-18（cn110）通过在OP50上繁殖动物两代，并将其转换为25°C。阴性选择良好的动物几乎完全瘫痪，在25°C下1-2天后无法产卵。一旦建立了具有足够负选择和可见荧光标记的转基因株系，年轻成年人群体在34°C的水浴中热休克1小时，并在15°C的温度下恢复数小时。将20只成年热休克动物转移到10 cm接种OP50细菌的NGM板上，并在室温下繁殖。当这些盘子上的动物挨饿时，大约四分之一的盘子被切成块，放入一个新鲜的、有种子的10cm NGM盘子中，并置于25°C。两到五天后（但在饥饿之前），根据非水解野生型动物的存在，对这些平板进行了插入事件的视觉筛查。插入菌株在荧光解剖显微镜上通过缺乏荧光mCherry联合注射标记进行验证，随后纯合。
直接插入协议
单个注射的蠕虫被允许耗尽食物来源。一旦饥饿，含有转基因株系的平板在荧光解剖显微镜上根据野生型运动进行插入事件筛选，但完全缺乏荧光共注射标记。含有插入事件的平板通常有很大比例的非荧光移动动物，尽管有些平板只有少数。
同源区长度：对于大多数实验，我们在Mos1插入的每一侧插入了大约1.5 kb同源的转基因13我们还测试了具有较短500 bp同源区域的构建物，以最小化克隆载体。转基因插入是可能的，但初步实验表明，同源臂更短的情况下，频率似乎降低了近五倍。由于只实现了矢量大小的微小减小，我们在试点实验后没有继续这些实验。
生物转化
如前所述，使用Biorad PDS/HE-1000通过生物枪轰击获得整合菌株16.
分子生物学
许多质粒是使用Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）MultiSite Gateway三片段试剂盒（目录号：12537-023）构建的。根据制造商的说明进行反应，酶直接从Invitrogen购买。
所有克隆PCR扩增均使用高保真聚合酶进行（芬兰埃斯波Finnzymes）。
Southern印迹
虫子生长在接种NA22细菌的2YT琼脂糖平板上。基因组DNA用Qiagen（德国希尔登）基因组尖端100/g试剂盒或DNeasy试剂盒分离。使用标准技术在低压（50mV）下用EcoRI和随后的琼脂糖（0.7%）凝胶电泳进行过夜基因组限制性消化。将DNA条带转移到Millipore（马萨诸塞州贝德福德，美国）Immobilion NY+膜上。使用美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室NEblot试剂盒合成化学发光探针。根据制造商的指示进行杂交和洗涤，并使用新英格兰生物实验室（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）的Phototope-Star核酸检测试剂盒进行检测。
蛋白质印迹
用M9冲洗，从食物消耗量为50%至75%的盘子中采集蠕虫。蠕虫被允许沉降，上清液被清除。用M9清洗蠕虫3次。将蜗杆重新悬浮在M9中，以提供50%的蜗杆颗粒体积。添加等体积的2x SDS-page样品缓冲液，将样品煮沸5分钟，将50μl等分煮沸的裂解液滴入50%M9培养基中透析10分钟（Millipore，VSWP02500）。回收透析的裂解液（～50μl），添加等体积2x SDS-page样品缓冲器，将样品煮沸5分钟，和20μl样品加载在10%和15%的SDS-page凝胶（Biorad，迷你凝胶）上。加载20μl等分试样，运行50mV 30分钟，然后运行150mV 1小时。使用半干燥设备（20mV，2小时）将其转移到PVDF膜上。用适当的一级抗体探测膜：抗UNC-18（gift James Rand，抗兔血清，亲和力纯化）和抗Tubulin（DSHB，抗鼠单克隆，“12G10”上清液）在1:2000的1x PBS-Tween（Tween 20，0.1%）中使用。用抗鼠IgG-HRP和抗兔IgG-HRP（GElifescience）在1:10000的条件下进行二次探测。使用ECL试剂开发膜(GElifescience.com)，在胶片上成像(Piercenet.com网站)，并进行处理（ImageJ，凝胶分析插件）。
