小鼠X灭活中心含有几个非编码基因，包括西斯特(1,2)及其反义阻遏物，Tsix公司(三). 关于未来Xa（主动X），Tsix公司阻碍西斯特上调并防止沉默因子的招募顺式。关于未来Xi（非活动X），Tsix公司被下调，使西斯特Xist RNA在染色体上的反式激活和扩散(4). Xist转录物的积累与染色质级联变化相关(5)，但如何西斯特指示这些更改是未知的。原则上，转录的行为西斯特可以引起结构变化，从而改变染色体的功能(1). 可替换地，西斯特可以作为成绩单(1,2)通过招募染色质修饰剂或将X定位到特定的隔间(6). 虽然普遍具有吸引力，但基于RNA的模型仍然是假设的，因为Xist相互作用蛋白尚未确定。
为了避免提纯Xist相互作用蛋白的传统困难，我们进行了RNA免疫沉淀（RIP），并询问是否可以在特定的蛋白质复合体中发现Xist RNA。我们分离出天然状态下的核RNA及其结合蛋白，以避免固定伪影，并测试了两种细胞类型——小鼠胚胎干细胞（ES），它们存在于XCI前状态，但在诱导分化时会重演XCI；小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）忠实地维持Xi。因为H3-K27三甲基化（H3-K27me3）与Xist上调和下调密切相关(6——9)，我们询问Xist RNA是否结合H3-K27甲基化酶、PRC2、包括Eed、Suzl2、RbAp48和催化亚基Ezh2的多梳复合物(10). 事实上，α-Ezh2和α-Suz12抗体共同免疫沉淀Xist RNA(). 相比之下，在α-H3-K27me3、α-H4Ac和非抗体对照中未检测到Xist序列。用消化单链（RNase I）和双链（RNase V1）RNA的RNase预处理可消除RIP信号，而用RNase H（消化RNA:DNA杂交体中的RNA）、DNase I或无核酸酶预处理则无影响(). 通过推断，RIP产物必须是单链或双链RNA。
PRG2复合体包含XistA.地图西斯特。
B、 指示细胞中的C，D.RIP，α，抗体。
核糖核酸酶预处理对RIP信号的影响。
F.通过实时PCR将R1处的链特异性RIP归一化为输入RNA。误差栏，1个标准偏差（SD）。
G.通过实时PCR在R1–R5位置定量RIP。
H.DNA ChIP使用指示抗体，显示为输入的一部分，并标准化为正常IgG ChIP。
在雌性细胞中，即使在XCI前状态（第0天，d0），当每个细胞有<10个转录物时，也可以在复合体中检测到RNA(11). 在d0上，PRC2仅绑定重复A（R1），这是沉默所需的基序(12,13). 有趣的是，定量链特异性RIP表明，正链和反链在PRC2复合物中高度富集(). 直到细胞分化和西斯特上调PRC2可以共同免疫沉淀Xist的更多3′区，这表明Xist其他区域最终与PRC2接触，尽管Repeat A仍然是结合中心(). 为了确定PRC2何时加载到染色质上，我们进行了DNA染色质免疫沉淀（ChIP）(). 虽然PRC2与d0野生型细胞中的RNA结合，但在分化（d3，d6）时，当Eed/Ezh2水平增加约10倍时，PRC2才在DNA上富集。因此，H3-K27me3水平上升了10倍以上。RIP和ChIP共同表明，尽管PRC2结合了前XCI细胞中的重复序列A，但在分化之前染色质的H3-K27me3并不明显(). 对于男性，PRC2共免疫沉淀的Xist序列仅在ES细胞中出现，而在MEF中没有出现()，与XCI的缺失一致。在Tsix公司δCpG/+预先确定并加速XCI选择的雌性细胞(三)，PRC2传播更早，与先发制人的H3-K27me3一致()(11). 因此，RNA招募PRC2及其对染色质的活性在生化上是可分离的。
检查Tsix公司δCpG/+细胞使我们能够确定何时西斯特相对于PRC2的募集，发生了反式激活。在这个突变体中，XCI总是发生在突变的X和H3-K27甲基化抢占上西斯特上调，表明H3-K27me3和西斯特反式激活在基因上是可分离的(11). 事实上，DNA ChIP在d0重复序列A上表现出高Eed/Ezh2富集，伴随着H3-K27me3().西斯特分化前表达一直很低(11). 因此，RNA招募PRC2以西斯特的5′端在d0，但PRC2转移到染色质，只有在分化被触发后才能催化H3-K27me3。这些事件发生在西斯特交易激励。
有趣的是，PRC2在所有时间点优先与Repeat A关联()尽管一个完整的Xist分子理论上应该在天然RIP期间与PRC2共免疫沉淀，而不管哪个RNA结构域与PRC2结合。为了进行更高分辨率的分析，我们在西斯特启动子P1和P2在ES细胞中，在R7和R8位置观察到的RNA水平是R6和R9位置的3-4倍(). 在分化过程中，Xist在雌性中上调了100倍以上，但在雄性中几乎检测不到().
Xist中的一个小RNAA.地图回购协议和的5′端西斯特。
B、 C.链特异性实时PCR定量ES细胞（B）或MEF（C）中R6–R9处的RNA拷贝，标准化为标准曲线。
D.使用RepA探针的RNA FISH。
E.RepA和Tsix（5′和3′位置）的Northern分析。
F.3′RepA种族。
G.荧光素酶报告子瞬时转染构建比较RepA（bp79-320）和Xist P1启动子，每个启动子均归一化为载体控制。P（P），学生t吨-在指示的两两比较中进行测试。
H.DNA鱼类回购协议转基因雌性ES细胞。Xist P1启动子不在转基因中。箭头，转基因。Tsix公司由pSx7检测。
I.代表性克隆B5和C5+/-多西环素诱导中的定量RIP。无抗体对照未产生可检测的RNA。
R6-R9的数量差异暗示了一种新的启动子活性。事实上，RNA荧光原位杂交（FISH）在d0上检测到一个精确信号(). Northern分析显示约1.6 kb的转录本，除了已知的Tsix转录本外，没有明显的反义对应物()(14). 3′RACE的终点位于P1下游bp 1948处()这意味着转录起始点位于~bp300。荧光素酶报告子分析证实bp79-320内的启动子活性，在XCI前和XCI后的细胞中同样活跃，而P1活性在XCI后增加(). 竞争性RT-PCR先前在d0雌性ES细胞的该区域发现了约10个正义RNA的绝对拷贝(11). 当前的化学计量数据表明，3-4个拷贝来自全长Xist，6-7个拷贝来自Repeat A(). 分化后，Xist水平增加了约100倍()而重复A水平增加了1.8倍(). 因此，重复序列A产生一个小的内部转录物，在XCI之前存在于雄性和雌性细胞中，但在XCI之后仅限于雌性细胞。我们将抄本指定为“RepA”代表吃A类.
为了测试PRC2是否真的被RepA招募，我们生成了多西环素诱导的回购协议转基因雌性ES细胞()并询问RepA是否可以独立于西斯特。事实上，对于两个低转基因拷贝数的克隆（B5，C5），强力霉素诱导导致RepA增加3倍以上，PRC2结合相应增加（图21）。因此，RepA足以招募PRC2体内没有Xist，招募依赖于RepA转录/RNA。
RepA RNA是否直接与PRC2结合？为了进行研究，我们测试了RepA RNA寡核苷酸是否能改变PRC2在体外电泳迁移率变化分析（EMSA）。RepA由一个28-nt序列的7.5个串联重复组成，可折叠成两个保守的干环结构(13) (). 当ES核提取物与野生型有义探针孵育时，观察到特定的RNA-蛋白质复合物(). 有趣的是，反义RNA中还发现了一种特殊的复合物，它具有互补的干环结构。在这两种情况下，RNA-蛋白的相互作用都被过多的冷野生型破坏，但没有突变或随机竞争对手。对于缺乏保守干环结构或随机RNA寡核苷酸（DsI，DsII）的突变探针，未观察到任何位移。因此，ES细胞核中的特定因子结合RepA和Tsix。
RepA RNA直接结合PRC2体外试验。A.一次重复一个单位。WT，野性感。Mut，突变。AS，反义。DsI和DsII，随机Xist序列。
B.EMSA使用雌性ES核提取物（NE）。竞争对手的摩尔过量为500倍。箭头，感测位移。箭头，AS shift。
C.反义结合由感觉而非非特异性RNA竞争。
D.EMSA超位移（*）与α-Ezh2。
E.EMSA使用重组hPRC2（sub）复合物。fEzh2，果蝇Ezh2。
hPRC2受反义而非随机探针结合。
为了确定该因素，我们询问α-Ezh2是否能超移复合物，并发现核提取物（d4雌性ES或MEF）中的预培养产生超移，而正常IgG没有(). 因此，PRC2直接结合RepA和Tsix，与RIP结果一致(). 为了证实这一点，我们生成了含有EED、EZH2、SUZ12和RBAP48的重组人PRC2（hPRC2）(15)观察到hPRC2转移了正、反义RNA，但没有突变或随机RNA(; 附加频带可指示为子复合体）。hEED-hEZH2亚复合物和完整的hPRC2复合物同样能很好地结合野生型RNA。Ezh2单独也能结合RNA，但hEED单独不能。因此，Ezh2必须是PRC2的RNA结合亚单位(图S1). 鉴于Tsix也与PRC2结合西斯特拮抗剂Tsix可以通过滴定PRC2来阻断XCI。事实上，RepA和Tsix寡头相互竞争PRC2在体外()在没有Tsix的情况下体内(尖沙咀δCpG/+)，H3-K27me3在d0上过早发生(). 我们建议RepA直接与Ezh2相互作用，Tsix竞争性地抑制这种相互作用。
此前，PRC2似乎不太可能成为西斯特，一份报告显示，招募PRC2时没有重复A(7). 然而，另一份报告显示，重复序列A突变体中PRC2的招募下降了80-90%(9). 为了测试RepA在XCI中是否起作用，我们创建了携带shRNA转基因的雌性ES克隆回购协议（RA；). 由于RepA和Xist重叠，针对RepA的shRNA可能会影响Xist。为了区分RepA和Xist，我们针对Xist外显子1（X1）的末端创建了shRNA，该外显子不与RepA重叠。qRT-PCR证实了敲除的有效性和特异性(：Xist包含R7序列，因此可能会受到X1击倒的影响；剩余R7水平可能代表RepA）。
RepA/PRC2击倒危及XCI启动A.敲除克隆中的Xist RNA-H3K27me3免疫FISH。shRNA:RA、RepA。X1，Xist外显子1。Scr，加扰控制。
B.击倒克隆中指定位置的Xist和Tsix水平。
C.ImmunoFISH:Xist上调的频率（Xist+)和H3-K27me3病灶。P（P），与Xist的Scr-12控件进行成对比较+频率。
D.shRNA克隆中的EB生长。
Eed、Ezh2或对照敲除后的E.Xist-H3K27me3免疫FISH。
F.Eed和Ezh2 mRNA在敲除后的水平Tsix公司Δ/+ES细胞。P（P），学生t吨-测试。
指示敲除后的Xist RNA的G.qRT-PCR。P（P），学生t吨-测试。
H.ImmunoFISH：在指示敲除后，Xist上调和H3-K27三甲基化的频率。P（P）比较了对照组（“预期”）和Eed/Ezh2击倒组中的Xist焦点数。
当RepA在克隆RA-3和RA-4中耗尽时，Xist诱导受到严重损害，因为与X1和扰乱（Scr）对照相比，在d8上几乎没有看到Xist病灶(). 因此，Xist上调需要RepA RNA。在100%缺乏Xist病灶的RA-3和RA-4细胞中，X上没有H3-K27me3(). 在极少数上调Xist的RA-3和RA-4细胞中，H3-K27me3也受到损害，表明PRC2募集缺陷——尽管Xist水平很高。与XCI的失败一致，与对照组相比，RepA-shRNA克隆表现出极低的EB分化(). X1克隆表现为中间表型，与Xist的中间表达一致。虽然X1区域对于沉默和定位来说是不必要的(13)，其敲除可能影响Xist的整体稳定性并解释中间表型。我们得出结论，RepA RNA不仅在Xist反式激活中起作用，而且在H3-K27甲基化和XCI中也起作用。
接下来我们研究了敲除PRC2亚单位是否会产生类似的效果。事实上，d6雌性EB中Eed和Ezh2的敲除导致Xist和H3-K27me3病灶的显著减少(). 因此，PRC2也在Xist上调和XCI中发挥作用。与以往研究一致(16,17)，在西斯特+PRC2缺乏不能消除基因沉默(图S2)，可能是由于PRC2和PRC1的功能冗余(17). 根据我们的数据(,)，RepA/PRC2击倒的主要影响可能是在西斯特，一个被假设为西斯特诱导所必需的事件(11). 因此，RepA/PRC2复合物可能在XCI期间首先通过在Xist诱导H3-K27me3进行反式激活，然后通过使H3-K29me3沿着Xi扩散而起作用。
鉴于PRC2的重要性，奇怪的是，Xi仅在XCI启动时由PRC2装饰，尽管此后它稳定地保留了H3-K27me3(7,8). 假设Xi的表观遗传状态是通过在s期访问核周隔室来维持的(6)我们想知道，在主租户阶段，PRC2关联是否也可能被划分为多个部分，并且是暂时的。事实上，我们在这一晚复制的核周隔室中观察到高水平的Ezh2、Suz12和H3-K27me3()其中约80%的Xi与MEF相关(). 当Xi被删除时西斯特XCI发生后（Xa重量Xi（希）Δ西斯特)，染色体无法重新定位到该隔室(6). 在这些细胞中，我们观察到PRC2定位和H3-K27me3被取消()(6)支持XCI后细胞中的Xi与PRC2相关，并通过在DNA复制期间访问核周隔室来维持H3-K27me3的观点。
XCI后PRC2和Xi在核周区室结合A.免疫染色：Ezh2和Suz12集中在核仁周围（B23+）。
B.Ezh2和Suz12表现出核周富集，但H3K9me3没有。
C.Xist RNA-Ezh2免疫鱼类。
D.Xist DNA-Ezh2在Xa中的免疫FISH重量Xi（希）Δ西斯特中小企业基金(6).
E.总结和模型。
总之，我们发现了一种小的ncRNA，它需要将PRC2靶向特定位点。长期怀疑(18)，一种RNA辅因子可能解释了为什么迄今为止没有出现哺乳动物多梳DNA结合亚单位。Ezh2显然是RNA-binding PRC2亚单位。对于XCI，数据提供了对Xi如何启动沉默的新见解(). 鉴于Tsix作为Xist拮抗剂的既定角色(三)，结合PRC2并与RepA竞争的能力()和Xist的摩尔过量，我们建议Tsix通过滴定RepA远离PRC2、阻止RepA-PRC2转移到染色质或阻止PRC2催化来阻止RepA-PRC2在前XCI细胞中的作用。后两种可能解释了为什么雄性中RepA-PRC2相互作用不会诱导H3-K27me3(). 在我们的模型中，当Tsix对未来Xi下调时，RepA有效地参与PRC2，甲基化西斯特发起人顺式，并启用西斯特交易激励。为了支持这一点，废除Tsix(Tsix公司ΔCpG/+)导致过早的H3-K27三甲基化()和升高的Xist水平(11). 全长Xist也结合PRC2()因此，Xist RNA沿Xi的传播可以在整个染色体上分布PRC2和H3-K27me3。异位西斯特已知转基因会传播常染色体沉默(13)，我们的数据表明西斯特-可能回购协议自身()-充当成核中心。XCI后，Xi通过核周隔室以RepA/Xist依赖性方式与PRC2保持联系。有证据表明需要RNAi定位Xist并靶向H3-K27me3(19)，小RNA和RNAi蛋白的参与也是可能的。因为最近在人类HOX基因座上发现了另一个与PRC2相关的ncRNA（“HOTAIR”）(20)RNA辅因子可能成为多梳靶向的普遍要求。
