实验性中风结果在整个寿命中的变化

摘要

引言

急性缺血性中风（AIS）是一种主要影响老年人的疾病，中风的最强独立风险因素是年龄(Rojas等人，2007年). 随着预期寿命的增加，世界老年人口正面临快速增长，老年人将很快成为中风患者的大多数(Rojas等人，2007年). 随着患者年龄从55岁增加到85岁，缺血性中风的患病率从11%增加到43%(Howard等人，1998年). 由于中风在老年患者中的高死亡率和发病率，它是世界范围内的一个主要卫生保健问题，造成了巨大的经济损失，并利用了巨大的医疗资源。尽管有明确证据表明中风是老年人的一种疾病，但绝大多数临床前研究仍在利用年轻雄性动物。由于最有希望的神经保护剂在临床试验中失败了，如果我们希望开发有效的治疗方法，中风研究人员需要解决我们的实验模型中可能存在的缺陷。显然，年龄是大脑对中风反应的一个重要因素。尽管老年人的死亡率很高，但死亡往往是由并存疾病引起的，而不是中风本身。年轻人脑中的水肿更为严重，这表明细胞对缺血的反应可能在整个生命周期中有所不同(Desbordes and Cohadon 1987年;瓦格纳和卢塞普2005).

之前的几项研究表明，尽管与年轻雄性相比，老年雄性啮齿动物的死亡率更高，功能结果更差，但其组织学中风损伤可能低得惊人(Shapira等人，2002年;Wang等人，2003年). 虽然现在大多数中风发生在老年女性身上(Rosamond等人，2008年)目前，关于老龄雌性啮齿动物对中风的反应的信息很少，并且之前没有研究对老龄雌性小鼠的中风结果进行过检测。越来越多的人认识到，中风是一种在实验和临床上都存在性别差异的疾病，尽管人们对这些性别差异仍知之甚少。大多数国际数据库一致表明，女性在高龄之前中风的发病率低于男性(Broderick等人，1998年)然而，女性中风后的功能结果比男性差(Glader等人，2003年)与之相关的残疾和死亡率较高，部分原因可能是女性中风的高龄。中风流行病学的性别差异归因于绝经前雌激素（17β-雌二醇或E₂)暴露。然而，最近检查激素替代效果的临床试验表明，激素治疗女性的血管风险惊人增加(Prentice等人，2006年). 对这些试验的主要批评是E₂绝经后数年开始治疗。为了对这些发现进行建模和解释，研究人员回到了试验台上。最近的动物研究表明，在开始激素替代之前持续的低雌激素状态可以改善E的保护作用₂然而，在雌性小鼠中，只对经过手术绝经（通过卵巢切除术）的幼鼠进行了检查（5-6个月）(铃木等人，2007年). 是否E₂补充剂可以减少衰老雌性小鼠的梗死尚不清楚。

本研究的总体目标是研究年龄和性别如何影响雄性和雌性小鼠的缺血性卒中结局。临床数据表明，老年女性中风后的预后更差，E₂我们假设，衰老雌性小鼠比年轻雌性小鼠发生更大的中风，并且这种损伤的增加仍然可以通过围产期E改善₂更换。对两性小鼠的组织学和功能结果、血脑屏障通透性和水肿形成的影响进行了评估。

材料和方法

西方印迹法

中风24小时后，通过快速从颅骨中取出大脑，切除小脑，然后立即解剖右侧（R；缺血性）和左侧（L；非缺血性）半球，获得小鼠脑样本。大脑样本进一步解剖为核心和半影区，如下：大脑半球从中线切下1mm，从嗅觉/额叶或小脑/枕极切下2mm；然后从冠状切面上取下一块楔形组织作为梗死核心，沿着梗死组织和非梗死组织的边界，剩下的切面被评估为半影(图4A). 样品被闪冻并在-80°C下储存，直至使用。样品在750μl含蛋白酶抑制剂片（Roche Diagnostics）的冰镇RIPA缓冲液和1mM PMSF中用冰块均质器均质，并在冰上短暂超声。提取物在14K下立即离心，在4°C下离心20分钟。去除产生的上清液，并使用BCA试剂盒（BioRad）测定蛋白质浓度。将匀浆与等体积的2×样品缓冲液混合并煮沸5 min，然后加载到4-15%梯度SDS-PAGE凝胶上。将等量的蛋白质（40μg）加载到每条通道上，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（BioRad）上。细胞膜被封闭，然后与水通道蛋白（AQP1&4）（1:1000，Chemicon）、Claudin-5（1:1000）、连接蛋白43（Cx43）（1:100，Cell Signaling）或β-肌动蛋白（1:5000，Sigma）孵育。肌动蛋白被用作加载控制。将所有印迹在4°C的一级抗体中在含有5%牛血清白蛋白和0.1%吐温20的TBS缓冲液中培养过夜。二级抗体（1:2000）是山羊抗兔或山羊抗鼠，取决于一级抗体（圣克鲁斯生物技术公司）。使用SuperSignalWest Pico化学发光基板（ThermoScific）对信号进行可视化。用计算机软件（Scion Image）对Western Blotting图像进行密度测定。

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图4

Cx43在梗死核心（C）、半影（P）和假阳性（S）中的表达。(A类)如图所示，确定梗死核心和半影的面积；(B类)对来自同侧半球和假大脑梗死核心和半影的裂解物进行Western Blot分析。Cx43蛋白被印迹为双链（41和39 kDa）；β-actin作为负荷控制。(C类)样品的光密度表示为Cx43带与控制带的比值。n=6，P（P）*与假手术相比<0.05。

结果

所有研究组的生理参数均正常且相当

评估年轻和衰老小鼠的平均动脉压（MAP）、pH、pO等生理参数是否相等₂，pCO₂，并测量血糖。年轻和衰老小鼠的缺血前或缺血内动脉血压或血气测量值没有差异(表1). 缺血区激光LDF信号显示，所有组MCA供血区的CBF均显著降低(图1A). 三只老龄小鼠和两只年轻小鼠被排除在实验之外，因为它们的CBF在MCAO后没有下降到基线的15%以下。

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图1

CBF、E₂浓度和子宫重量测量。(A类)LDF麻醉小鼠后连续测定CBF；(B类)使用心脏棒，从右心室抽血；E类₂检测血清浓度；(C类)取下大脑后，由同一操作员处理幼年和老龄雌性小鼠的子宫，并对其进行分离、切割和称重。n=6/gp，P（P）*与任何其他组相比，<0.05。Y、 年轻；A、 老化；F、 女性；M、 男性。

表1

年轻和衰老小鼠的生理测量

组		酸碱度	氧化铅2	pCO公司2	葡萄糖	地图
年轻女性	缺血前	7.39 ± 0.042	136 ± 12.4	39.6 ± 8.7	140 ± 11.1	76 ± 6
	缺血	7.30 ± 0.085	128±11.6	40.0 ± 3.6	146 ± 22.6	72 ± 4
老年女性	缺血前	7.36 ± 0.082	136 ± 17.1	35.8 ± 6.3	133±16.6	76 ± 5
	缺血	7.25 ± 0.102	121±18.9	43.8 ± 6.7	148 ± 19.5	71 ± 5
奥夫克斯	缺血前	7.36 ± 0.074	132 ± 15.0	37.8 ± 7.6	160 ± 3.9	80 ± 6
	缺血	7.31 ± 0.060	121 ± 13.2	40.0 ± 5.9	161 ± 10.4	75 ± 4
年轻男性	缺血前	7.35 ± 0.095	137 ± 16.1	38.0 ± 7.8	144 ± 19.1	75 ± 5
	缺血	7.29±0.079	131 ± 11.4	39.1 ± 7.4	144 ± 22.2	73 ± 5
老年男性	缺血前	7.40 ± 0.052	140 ± 15.0	41.1±7.2	151 ± 8.4	80 ± 6
	缺血	7.25±0.047	116 ± 16.0	39.8 ± 7.7	168 ± 4.2	74 ± 5

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在MCAO前和再灌注后60分钟，年轻和衰老小鼠的生理变量没有差异。汞、血红蛋白；MAP，平均动脉压。n=4/gp。

MCAO诱发的梗死体积存在年龄和性别差异

为了检查中风后的组织学结果，我们使用1.5%TTC的标准染色(图2A). 定量分析(图2B)结果表明，老龄雌性小鼠的梗死体积明显大于年轻雌性小鼠（总梗死面积：老龄组vs.年轻组：36.86±5.49 vs.20.49±2.20%；P（P）<0.05，n=8），而老年男性的梗死体积明显小于年轻男性（总梗死面积：老年vs.年轻：31.23±3.26 vs.49.11±5.99%；P（P）<0.05，n=7）。有趣的是，老龄化对老龄雌性小鼠的影响最为显著，因为老龄雌性小鼠比年龄匹配的雄性大得多(P（P）<0.05），这与年轻动物中的模式完全相反，与年龄匹配的雄性相比，雌性受到保护。

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图2

MCAO 24小时后年轻和衰老小鼠的卒中结果。(A类)TTC染色的大脑冠状切片。白色表示梗死；红色表示正常组织。(B类)基于TTC染色的梗死体积定量分析显示为%对侧半球结构。(C类)在MCAO发病后3h和24h对神经功能缺损进行评估和评分。P（P）*<0.05（B:*与老年女性或年轻+Ovx或年轻男性组相比；C:*与3h得分相比）。Y、 年轻；A、 衰老；F、 女性；M、 雄性；卵巢切除术。

EB外渗和Cx43水平的表达反映梗死程度

正如已经证明的那样，生殖激素调节BBB的通透性(Wilson等人，2008年)，我们假设随着年龄增长雌激素的丢失会导致脑卒中后血脑屏障的通透性增加，并对血脑屏障中的EB外渗进行评估。在MCAO后测量小鼠同侧和对侧半球的EB浓度，以确定EB指数（EBI：同侧/对侧半球EB浓度）。正如预期的那样，EBI反映了缺血损伤的程度，大的梗死导致更大量的染料外渗。衰老和Ovx雌性小鼠的EBI均显著高于年轻完整雌性小鼠(P（P）<0.05，n=6），而与年轻男性和老龄女性相比，老龄男性的EBI降低（P<0.05，n=6）(图3 A和B).

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图3

中风24小时后，埃文斯·布鲁脑内渗出。(A类)蓝色表示EB渗出。(B类)伊文思蓝指数（EBI）是通过将同侧的EB浓度置于对侧半球的EB浓度来计算的。n=6/gp，P（P）*与老龄女性或Ovx或年轻男性组相比，<0.05。

为了进一步评估中风后血脑屏障的完整性，我们还检测了Cx43的表达，Cx43是一种受激素调节的主要缝隙连接蛋白(Wilson等人，2008年)，参与中风反应。所有组小鼠梗死核心的Cx43表达都很低，表明BBB完整性完全丧失。然而，对半影组织的分析显示，各组之间存在显著差异。与假手术组相比，衰老雌性小鼠半影区Cx43的表达显著降低，年轻雄性小鼠也是如此，而年轻雌性和衰老雄性小鼠的Cx43水平相对保持不变。这与梗死体积和EB渗漏一致(图4 B&C). 由于紧密连接蛋白也可能在中风反应中发挥作用，我们还检测了Claudin-5的水平，发现与衰老没有差异（数据未显示）

衰老小鼠比年轻小鼠水肿形成更少

老年患者脑损伤周围的水肿反应范围较小(Desbordes and Cohadon 1987年). 与老年患者相比，患有广泛大脑中动脉卒中的年轻患者更容易发生致命的脑水肿(Wagner和Lutsep 2005年). 水肿与中风相互作用，被认为是导致梗死扩散的因素。为了确定MCAO诱导的水肿形成是否存在差异，我们测量了中风后另一组动物的含水量。与性别匹配的衰老小鼠相比，即使对大脑进行肉眼检查，幼年动物的水肿程度也显著增加。测量同侧和对侧半球的含水量，并计算水肿指数（EI）（EI=对侧半球同侧的含水量）。与衰老小鼠相比，雄性和雌性幼鼠的EIs显著升高(P（P）<0.05，n=6/gp），表明水肿形成增加(图5A). 我们检测了大脑中两个重要的水通道AQP1和4的水平，以确定衰老小鼠的水平是否存在差异。我们发现随着年龄增长，大脑AQP1和4水平没有差异，性别之间也没有差异，这与其他人最近的研究一致(Liu等人2008) (图4B，AQP1的数据未显示）。

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图5

中风后年轻和衰老小鼠的脑水肿和血清IL-6水平。(A类)水肿指数（EI）的计算方法是将同侧大脑半球的含水量置于对侧大脑半球。(B类)处死时用心脏棒采血，ELISA法检测血清IL-6水平；对照组小鼠为非手术小鼠。n=6，P（P）*<0.05（A:*与年轻小鼠相比；B:*与衰老雌性中风相比）。

讨论

本研究代表了研究小鼠对局灶性中风反应的性别和年龄差异的初步步骤，并证明了几个重要的发现。首先，小鼠MCAO后的行为和组织学结果存在年龄相关的差异。与年轻雌性小鼠相比，老龄雌性小鼠的缺血性损伤明显加重。这似乎与雌激素丢失而非衰老本身更相关，因为手术绝经后年轻女性的梗死体积与衰老女性的梗死面积相等，而E₂在老年女性中进行替代治疗可使梗死面积降至年轻性腺接触女性的水平。其次，与年轻男性相比，老年男性的梗死体积有所减少。虽然这最初令人惊讶，因为老年男性的功能缺陷和死亡率显著增加，但这与其他实验室的研究结果一致(Shapira等人，2002年). 与年轻小鼠相比，雌性和雄性衰老小鼠在中风24小时时的死亡率更高，功能受损更严重。这反映了年龄而非梗死面积的影响，因为补充外源性雌激素的老龄女性的死亡率（25%）仍然很高，其梗死体积降低到年轻完整女性的水平。此外，尽管缺血性损伤显著增加，但Ovx女性的死亡率仍然很低（5%）。第三，半影区EB外渗和紧密连接蛋白Cx43的表达表明，老龄雌性小鼠的BBB通透性高于年轻雌性小鼠。相反，老年男性在中风后EB外渗和CX43丢失少于年轻男性，这与缺血性损伤的程度一致，也可能反映了缺血性损伤的严重程度。最后，中风后水肿的形成显示出与年龄相关的显著差异。与年轻动物相比，衰老小鼠的中风诱导水肿明显减少。有趣的是，水肿的形成与EB外渗量、Cx43表达和梗死面积无关，这表明与幼年小鼠相比，衰老动物的固有水肿形成较少。

雌激素对神经元、星形胶质细胞、内皮细胞和小胶质细胞有多种作用，并在受伤的大脑中具有强大的抗炎和抗凋亡作用(Brann等人，2007年). 在我们的研究中，雌性小鼠的卒中结果显示出明显的雌激素依赖性反应，即与正常雌性小鼠相比，衰老和Ovx雌性小鼠的梗死体积都增加了。衰老或排卵期女性的血浆雌激素水平均显著低于健康女性，子宫也较轻。我们的结果与之前的工作一致，证明E₂在卵巢切除或衰老的生殖衰老雌性动物和雄性动物中，即使在中风后给予生理相关浓度的治疗，也能减少中风后的梗死（见综述(阿隆索·德莱西纳纳和埃吉多2006)). 尽管有强有力的临床前证据证明E₂最近的临床试验质疑了将这种影响转化为人类的能力。妇女健康倡议（WHI），E的最大临床试验₂替代卒中预防，显示E组卒中发病率意外增加₂-接受治疗的女性(Wassertheil Smoller等人，2003年). 文献中对这些发现的解释进行了广泛的讨论，但更换的时机可能是一个主要因素。例如，在随机分组和开始治疗之前，参与WHI试验的女性年龄较大（平均63岁），且已经过了更年期（平均51岁）。

最近的一项动物研究(Suzuki等人，2007年)在试图解释这些结果时，发现E₂在卵巢切除后立即服用，但在低雌激素10周后服用，可产生深刻的神经保护作用。只有在雌二醇缺乏之前长期处于低雌激素状态的动物才会出现强烈的中风诱导的炎症变化₂更换。最近的第二项研究发现，发情周期正常但延长的“成熟”（7-8个月）雌性保留了对E的神经保护反应₂卵巢切除和E₂替代，而年龄稍大的无周期和“生殖衰老”大鼠（9-11个月）在卵巢切除和E₂更换(Selvamani和Sohrabji，2008年). 这些研究支持了以下假设：₂这取决于开始治疗的时间，雌激素替代对衰老的大脑有害。

然而，我们的研究表明E₂在衰老小鼠中起着重要的保护作用，并复制了早期的工作，证明E₂即使在衰老的动物中也能保持其神经保护功效(Toung等人，2004年). 对这些发现有几种解释。在上面讨论的阴性研究中，使用了更年轻的动物（即5-11个月），所有动物在受伤前都进行了卵巢切除手术。我们检查了年龄较大的小鼠（15个月），这些小鼠已经经历了“自然更年期”，低血清E证实了这一点₂水平和子宫萎缩。值得注意的是，这些动物在繁殖过程中会衰老和衰老，但不会“衰老”。啮齿类动物在中年（12-14个月龄）经历一个过渡期，称为“动情期”，其特征是动情周期不规则，通常延长，最终无周期(查克拉博蒂和戈尔2004). 因此，我们的研究反映了相对早期的E₂更替始于中年之后。该设计更准确地反映了正在进行的临床试验，即Kronos早期雌激素预防研究（KEPS；可在以下网址获取：http://www.keepsstudy.org/)其中，年轻女性在无周期后数月内接受雌激素替代治疗，结果将于2012年公布。晚E的影响₂在经历了长时间自然低雌激素状态的老龄（20个月）小鼠中进行替代尚不清楚。在这里使用的年龄组中，很明显雌激素在衰老的大脑中保持其神经保护作用，这种作用不仅限于女性，如E₂还能保护老年男性。这是否与临床有关尚不清楚，因为临床研究的重点是利用慢性替代疗法来一级或二级预防缺血性事件（即降低中风发病率），而不是广泛进行实验研究的急性保护。我们的数据表明，在这种情况下，雌激素是一种有效的神经保护剂，即使在衰老的大脑中也是如此。

衰老和年轻雄性动物之间梗死体积的差异与其他人先前的研究一致，这些研究表明，与老年（24-26个月）雄性大鼠相比，年轻（3个月）雄性大鼠的组织学损伤增加(Shapira等人，2002年). 尽管梗死面积较小，但我们的老龄小鼠的死亡率（29%）明显高于年轻小鼠，行为缺陷也更严重，这与其他几项研究一致(Badan等人，2003年;Popa-Wagner等人，2007年)这表明衰老与脑梗死的快速发展和卒中后延迟的、次优的功能恢复有关。老年大鼠的大脑对损伤的星形胶质细胞和小胶质细胞反应增强，胶质细胞瘢痕形成加速，导致老年动物随后可能出现恢复停滞(Badan等人，2003年). 虚弱和弱抗感染性也可能是衰老小鼠死亡率较高和功能恢复较差的部分原因。

衰老雄性小鼠组织损伤减少的机制尚不清楚。以前的一项研究表明，与年轻雄性大鼠相比，老年大鼠NMDA受体结合普遍下降(Wenk等人，1991年). NMDA受体介导的反应也有显著的年龄依赖性降低，而GABA能和胆碱能活性没有变化，表明雄性衰老大鼠的兴奋毒性潜能降低(Gonzales等人，1991年). 衰老女性大脑中的兴奋毒性潜能是否也发生了类似的降低尚不清楚，这种影响可能与绝经期发生的显著促炎性变化相形见绌。

目前普遍认为炎症在中风中起着关键作用，而缺血后炎症反应对缺血性脑损伤的程度有很大影响(Huang等人，2006年). 在老年人中，由于检测到的T细胞数量较少，而T细胞通过产生IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子，在缺血性损伤的发展中发挥关键作用，因此提示免疫缺陷(Cakman等人，1996年). 然而，关于衰老过程中的炎症反应，文献中存在相当大的争议，可能是因为许多研究仅针对雄性动物或性别混合的受试者进行(Cakman等人，1996年;Gabriel等人，2002年)或者没有强调所用动物的性别。与雄性动物相比，幼年雌性动物对损伤的炎症反应降低，大量证据强烈暗示E₂作为炎症途径的主要调节器(Maggi等人，2004年). 与老年女性相比，老年男性的血清和大脑促炎标志物IL-6水平显著降低。显然，许多细胞粘附分子、细胞因子和趋化因子都有助于中风的炎症反应，而IL-6只是一个标记物。目前正在研究衰老对两性中风炎症反应的影响。

缺血性卒中导致血脑屏障受损，血脑屏障通透性增加在缺血再灌注损伤的病理生理学中起重要作用(Belayev等人，1996年). 缺血导致微血管完整性丧失和血管渗漏加剧。我们从EB外渗得出的结果表明，BBB中断可能更能反映损伤或激素损失的程度，而不是随着年龄增长而增强的内在BBB功能障碍。其他几项研究表明，E₂缺血性损伤后脑损伤和血脑屏障通透性的丢失增强(DiNapoli等人，2008年;Wilson等人，2008年). 令人惊讶的是，在研究局灶性中风后老龄动物血脑屏障破坏的文献中，数据很少。重要的是，最近完成的最新研究表明，MCAO仅使用老龄雌性大鼠后，BBB分解、中风损伤和行为缺陷增加(DiNapoli等人2008). 没有提到荷尔蒙状况，这种增强的损害可能反映了雌激素的丧失，这与我们的发现一致。

BBB的完整性由紧密连接蛋白如闭塞带1（ZO-1）和ZO-2、闭塞素和克劳丁-5以及内皮细胞之间的缝隙连接蛋白如Cx43、Cx45、Cx32和Cx26维持(长泽等人，2006年). 我们检测了Cx43，因为它是一种主要的星形细胞间隙连接蛋白，在损伤后上调(Daleau等人，2001年)，具有荷尔蒙反应(Wilson等人，2008年). 其他人先前的研究表明，缺血后大脑皮层中的Cx43蛋白减少，表明缝隙连接细胞间通讯受损(Haupt等人，2007年). 在本研究中，半影区Cx43蛋白的表达与我们的EB和梗死数据一致。衰老雌性小鼠的半影Cx43表达最低，表明MCAO后BBB的破坏最大。有趣的是，我们在年轻和衰老小鼠的两性之间没有发现Claudin-5表达的差异，这可能表明BBB中的所有连接蛋白并非都受性别和年龄的影响。在本研究中，我们仅评估了Western公司脑匀浆中的一些连接蛋白水平，因此在未来的研究中需要进行免疫组化研究，以检查BBB蛋白的定位。

埃文斯蓝外渗与内皮细胞急性破坏后的蛋白质泄漏有关。相反，水肿的形成更为复杂，很难区分细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿(肖2002). 令我们惊讶的是，在我们的研究中，水肿形成没有性别差异，尽管通过EB和Cx43测量，梗死和血脑屏障破坏存在显著的性别差异。我们检测了大脑中最丰富的水通道AQP4的表达。然而，尽管雄性和雌性小鼠的水肿明显减轻，但我们发现老化大脑中的AQP4（或AQP1，数据未显示）表达没有减少(图5A). 这与其他几项研究一致，这些研究表明脑损伤后脑水肿形成和AQP 4表达缺乏性别差异(Carswell等人，2000年;Liu等人，2008). 其他研究表明雌激素对脑水肿形成有影响(O'Donnell等人，2006年). 对这些差异的一种解释是，我们专门研究了衰老大脑的影响。卵巢切除后的急性激素丢失可能与随着年龄增长而逐渐降低的激素有很大不同的影响，正如我们年轻女性卵巢切除后出现的高EI所表明的那样。这一点，以及衰老男性中水肿的类似缺乏，表明这是随着年龄增长而发生的内在变化。有趣的是，我们的数据显示，EI与损伤程度无关，因为衰老的雌性大鼠中风次数远大于年轻雌性大鼠，而年轻的小鼠脑水肿次数仍显著增加。这表明血脑屏障破坏和梗死与导致脑水肿的机制无关，水肿发展的最重要因素是年龄。这表明，针对年轻患者进行水肿缓解治疗可能比针对老年患者更有益处。临床医生经常注意到，与年轻患者相比，老年患者与临床相关的脑水肿量较低，这一发现通常归因于脑容量随着年龄增长而减少。最近的一项研究发现，在大面积脑梗死患者中，年龄较大（>70岁）的患者住院死亡率低得惊人(Chen等人，2007年)后来死于全身性疾病。相比之下，70岁以下的患者往往在头2周内死亡，与脑水肿的高峰期一致。尸检研究证实了幼年大脑中形成更强水肿的概念(Jaramillo等人，2006年)并且是提出60岁年龄上限进行半颅骨切除术的部分理由。

本研究存在局限性。通过以往的研究，我们仅选择中风后24小时的终点来评估结果(Dereski等人，1993年;Lu和Sun 2003)提示幼年动物在短暂MCAO 24小时后梗死完全，E₂或衰老对梗死演变的影响有待进一步研究。值得注意的是，我们以前的研究(Liu等人，2009年)研究表明，中风48小时后，雄性和雌性衰老小鼠的大脑组织学变化与本研究中的相似。我们只测量了脑中的绝对含水量，以此作为水肿形成的指标，无法区分细胞毒性水肿和血管源性水肿，后者可能在缺血损伤后的不同时间段占主导地位。最后，我们加入E阵营₂用完整的老龄小鼠而非载药植入小鼠来评估E₂由于衰老动物来源有限。然而，没有任何研究报告表明，这种载体（芝麻油）对中风有任何影响。

总之，实验性卒中后出现了显著的性别和年龄差异，反映在损伤、血脑屏障破坏和水肿形成的结果中。雌性小鼠在其一生中都会经历一种易受中风影响的MCAO反应模式所允许的抗中风药物，这种模式似乎是雌激素依赖性的。令人惊讶的是，男性有相反的模式，这可能与随着年龄增长中风的炎症反应减少有关。E类₂保持其对衰老动物的神经保护作用。EB外渗和半影区Cx43的表达与两性缺血损伤的程度一致，而水肿的形成显示出年龄相关的差异。这些结果强烈表明，中风的治疗干预需要根据患者的性别和年龄进行调整。

致谢

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