锌填充核酸酶作为基因治疗剂

摘要

锌填充核酸酶是强大的基因修饰工具

基因治疗的最终策略是在其自然染色体位置用正常等位基因替换有缺陷的基因。原则上，这比提供完整的治疗基因（例如病毒载体）有几个优点。因为通常情况下，只有一小部分基因必须改变，所以在正常位置更正基因就不需要在治疗DNA中包含完整的编码序列和所有必需的调控序列。校正基因的表达不太可能随着时间的推移而消失，正如有时在病毒传递基因中观察到的那样。正如病毒基因传递所经历的那样，纠正性基因片段不太可能通过插入基因组中的随机位点而导致突变，尽管可能会产生其他意想不到的不良后果（见下文）。

直到最近，由于所需同源重组事件的效率很低，在其自然位置编辑基因的前景似乎很遥远。锌填充核酸酶（ZFNs）通过在靶位上突破来提高效率(图1). 修饰ZFN的DNA结合特异性的能力使其基本上适用于靶向任何所需的基因。需要两个指向相邻序列的ZFN，这增强了它们的特异性，因为两者都必须识别其目标部分。

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图1

ZFN绑定和活动

ZFN相对于其目标DNA（浅蓝色条）的基本排列以彩色显示。每个ZFN（ZFNa，ZFNb）由一组4个锌指组成，以较小的椭圆形显示，每个锌指具有不同的颜色，表示每个锌指结合不同的DNA三联体。每个ZF组都与一个卵裂结构域（较大的卵圆形）相连，该结构域必须二聚体才能切割DNA。通过非同源末端连接（NHEJ）进行不准确的修复，目的基因的断裂可能导致其编码序列的中断。当同源供体DNA（深蓝色条）与ZFN一起引入时，它可以通过同源重组（HR）并入靶点。非预期的、非靶点的裂解可能对细胞有毒，并导致非靶点突变（紫色）。限制这种有害影响的一些方法在本文中进行了描述，包括修改裂解域二聚体界面和引入额外的指状物以增强特异性（绿色）。

ZFN诱导的突变可以在两种不同的模式下用于基因编辑(图1)¹：同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）。NHEJ通常是不准确的，会产生局部插入和缺失，这对于以灭活基因为目标的情况来说可能足够了。为了实现通常被视为基因靶向的序列替换类型，与ZFN一起提供与靶基因基本同源但携带特定期望序列变化的供体DNA。当HR使用此捐赠者作为模板时，更改将在目标中合并。

新的ZFN已衍生用于新的基因组靶点

尽管人们强调了ZFN靶向多种序列的潜力，但直到两年前，只有极少数真正的染色体位点被成功攻击，其中只有一个人类基因。现在名单更长了。波特斯²报道了人类基因四个新的9 bp序列的三指ZFN（每个β-珠蛋白和白细胞介素-2受体共同γ链[IL-2R中有一个位点γ、 在X连锁严重联合免疫缺陷中突变，X-SCID]和中的两个站点CD8A细胞表面抗原基因）。尽管这些都是用合成目标构建物进行测试的，而不是在内源性基因座本身进行测试，但结果增加了使用ZFN取得的成功。Sangamo Biosciences的研究小组此前曾报告过高频率的靶向IL-2Rγ基因座，为仓鼠二氢叶酸还原酶产生新的ZFN对(DHFR）基因^三和人类趋化因子受体CCR5号机组基因^4,5后者是HIV-1进入T细胞的共同受体；它已被证明对人类是可有可无的，因此是一个很有吸引力的基因破坏靶点。每个ZFN包含四个或五个锌指，与三指模块相比，锌指可能会增加目标的亲和力和特异性。锌指联盟实验室的大规模合作(网址：http://www.zincfingers.org)三个人类基因的衍生三指ZFN对(血管内皮生长因子-A,霍克斯B13和CFTR公司)和一个植物基因⁶。两篇论文报道了ZFN在斑马鱼基因断裂中的首次应用。其中一个使用了一对3指蛋白来靶向血管内皮生长因子受体(千卢比基因）⁷另一种是制造成对的4指蛋白质，成功地切割没有尾巴和金色的基因⁸.

已发表的报告描述了ZFN在不同生物体内的内源性染色体位置成功诱导14个基因靶向：哺乳动物细胞中6个，斑马鱼中3个，果蝇中3个、线虫和植物细胞中各一个(表1). 哺乳动物和植物细胞实验是用培养细胞进行的，斑马鱼实验是通过注射早期胚胎进行的，而果蝇和线虫实验是在整个生物体内进行的。毫无疑问，更多的人正在走向出版之路。这证明了ZFN方法的通用性，并鼓励未来应用于新基因和生物。

在标准ZFN结构的变体中，Minczuk等。⁹用一个单一的ZFN靶向人类线粒体DNA中的一个特定突变序列，该ZFN携带链接在同一蛋白质中的两个裂解域。将ZFN传递到该细胞器以及降低突变型与野生型基因组比率的成功为线粒体操纵的未来应用指明了方向。然而，连接两个切割结构域的策略不太可能被广泛采用，因为该蛋白质可能作为核酸酶具有组成活性。常见的双蛋白ZFN方案的一个优点(图1)裂解试剂在靶点组装，否则不起作用。

已经探索了向人类细胞输送ZFN的其他方法

在上述和其他研究中，使用了许多不同类型的细胞，基因靶向的效率差异很大。其中一些变异可能是由于固有的靶点可及性，但毫无疑问，很大程度上取决于ZFN和供体DNA如何输送到细胞。一些培养细胞相当有效地吸收外源DNA，据报道，ZFN诱导的事件的频率从所有靶点的十分之一到20%不等。病毒载体可能对其他类型的细胞更有效，它们可能被设计成有利于特定人群。伦巴多等。⁴使用整合缺陷型慢病毒载体，将ZFN直接传递给人类IL-2Rγ基因。他们还生产了一种携带一个ZFN和一个供体DNA拷贝的组合载体，从而减少了必须感染同一细胞的单独病毒的数量。他们在K562细胞中实现了高达39%的靶向频率，但在其他类型的细胞中效率较低。令人鼓舞的是，他们在原始人类干细胞（0.1%）和两个人类胚胎干细胞系（13%）中看到了CCR5位点的一些靶向性。

佩雷斯等.⁵使用腺病毒载体递送用于CCR5号机组基因和实现了显著的高频率基因破坏：在具有多个靶点的细胞系中，高达80%的靶点CCR5号机组表达盒和约50%的原代CD4+T细胞。在这种情况下，两个ZFN均以单个双顺反子载体传递，其表达由CMV启动子驱动。在许多情况下，目标基因的两个等位基因在单个细胞中同时被修饰^三,5,10虽然这在校正失活基因的情况下是不必要的，但当目标是基因失活时，这是非常重要的，例如在CCR5号机组当然可以使用其他病毒载体，也可以根据所处理的细胞或组织来选择。

已经实现了几种类型的编辑，包括大型插入

如前所述，NHEJ或HR可以通过设计的供体DNA引入ZFN靶向修饰。停用DHFR公司^三和CCR5号机组⁵ZFN切割后的基因仅依赖于NHEJ。梅德靶向的基因也是如此等.⁶新的突变主要是小的插入和缺失，还有一些较大的缺失。这两种情况都是通过使用CelI核酸酶检测到的，该酶只有在野生型和突变PCR产物之间形成的异源双链存在不匹配时才会裂解。

为了纠正突变疾病基因，需要有效使用供体DNA作为修复模板。Sangamo小组解决了在不牺牲效率的情况下，捐赠者的插入量可以有多大的问题¹⁰。他们发现大约1kb的适度插入被复制到IL-2Rγ当两侧各有750 bp的同源性时，目标效率约为5%。重要的是，一个7.8 kb的插入物以相同的速度被纳入，并且它携带的三个基因都得到了表达。未来研究的一个问题是，这些频率可能会受到较长和较短的侧翼同源性的影响。

伦巴多等.⁴证明了这种插入物在实际基因治疗中的有用应用。一个值得关注的问题是ZFN解理位点与需要修饰的序列之间的距离有多近。在哺乳动物细胞的双链断裂修复过程中，供体序列仅在断裂两侧合并约100 bp。这意味着必须针对特定基因中的每个不同突变推导出新的ZFN对。伦巴多等.放置在IL-2Rγ750-bp同源臂之间的cDNA显示，它与其他插入物的频率相同（约5%）。这意味着可以用这种方式“纠正”ZFN位点下游的任何突变(图2). 虽然由此产生的基因结构不正常，但在正常位点发生了校正，调控特征应该是完整的。

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图2

校正ZFN裂解位点下游基因序列的方案

一个假设的靶基因用6个外显子进行了说明（方框1-6）。第六外显子有一个polyA加法序列，定义了该基因mRNA的末端。ZFN裂解的特异靶点在外显子3中。供体DNA携带外显子3和所有下游外显子的序列，但没有下游内含子。供体的末端与ZFN靶的左侧和右侧具有同源性，如虚线所示。在使用这些同源性被ZFN和HR切割后，靶标的结构如下图所示。只要供体中的序列都正常，外显子3–6的任何突变都会在最终的mRNA中得到纠正。例如，如图所示，靶基因外显子4（显示为x）的突变在供体加入后不会出现在mRNA中。根据Lombardo等人。⁴.

切割结构域的修饰降低了毒性

ZFN中使用的锌指套很少具有完全的特异性，有些会产生显著的毒性。至少在两个案例中，毒性被证明是由于过度切割造成的，可能是在非预期的位置^11,12也有可能，单个ZFN与基因组位点的简单结合而不进行切割，会破坏正常的基因表达或其他细胞过程。非靶点切割并不奇怪，因为ZFN被要求在潜在位点的整个基因组中区分单个靶点。几个小组根据ZFN修饰细胞的存活率使用细胞毒性试验^2,4,13,14。可以通过使用针对聚集到这些病灶中的蛋白质的抗体（如γH2AX和53BP1）对DNA损伤诱导的修复病灶的细胞进行染色来评估非靶点切割的程度^5,12–15在某些情况下，可以看到数十个病灶，如果只有设计的靶点在两个等位基因上都被切断，则最多可以看到两个病灶。

虽然通过重新设计ZF来提高特异性通常是可能的，但三组改性了裂解结构域^12,14,15毒性通常是单个ZFN的一种特性，在非靶点形成同二聚体。因此，这些基团在二聚体界面上进行互补取代，阻止同型二聚体的形成，同时仍允许异二聚体裂解所需的靶点。每一组引入的修饰都有所不同，但都成功地消除了可检测到的离靶断裂后果。在某些情况下，这会降低靶细胞分裂的效率，但通常不会严重降低。在最近的几个ZFN靶向例子中，修饰的裂解结构域被非常有效地使用^三–5,8减少非靶向效应对于人类基因治疗的应用尤其重要，因为在人类基因治疗中，无法容忍意外后果。

新方法允许在人类细胞中使用前筛选新的ZFN

当选择新的靶基因时，必须为该位点的序列设计新的ZF集。每个手指主要与3个碱基对的DNA结合，有64个可能的3 bp序列。可以使用已选择用来识别其中许多三元组的ZF库，并且可以将它们方便地组装成新的ZFN，前提是每个手指都充当独立的模块^16–18采用这种方法忽略了蛋白质和DNA背景对识别的可能影响，而识别对成功可能很重要。梅德等.⁶通过从部分随机ZF编码序列库中为特定的9 bp DNA序列选择3指ZF集合来解决上下文问题。细菌双杂交（B2H）分析基于细菌中转录的激活，取决于ZF与报告基因上游的靶寡核苷酸的结合。一种基于单一杂交蛋白的类似细菌报告系统被用于生产针对斑马鱼的ZF集合千卢比基因⁷.

细菌分析选择细胞环境中的高亲和力ZF集。然而，识别的背景与真核细胞染色质中发现的背景大不相同，这肯定会影响ZF结合。也有可能，一对ZFN的最佳解理要求不仅反映了每个ZF集的结合能力，还取决于这对特定的细微特征。多扬等.⁸通过对（真核生物）酵母细胞的分析，解决了这些问题，该分析依赖于ZFN本身的裂解和产生易得分表型的基因的重建。报告基因中的合成靶点可以被安排携带单个ZFN或异源对的位点。仍有人担心，酵母染色质与高等真核生物的染色质有些不同，内源性基因的天然染色质结构不会准确反映在合成底物中。在细菌和酵母分析中表现良好的ZFs和ZFN在几种情况下已经在其基因组底物上取得了成功，因此这些方法为进一步使用提供了强有力的候选者。

前景

ZFN介导的基因靶向最有可能的最初应用是干细胞的修饰体外.佩雷斯等.⁵当他们改变CCR5号机组CD4+T细胞中的基因和产生的HIV耐药人群。这对ZFN可用于治疗HIV阳性患者的骨髓细胞。即使是这种细胞的一个子集发生突变，免疫系统的T细胞臂也可以在再次移植时与耐药细胞重建。目前正在审查这种类型的第一阶段试验。为了有效CCR5号机组在同一细胞中，等位基因必须被灭活。如前所述，这已在模型实验中实现，并且频率似乎可以提高，也许可以通过重复使用ZFN。通过以下方式，可以设想一种类似的情况来治疗X-SCID体外用ZFN和携带正常基因的供体DNA进行基因校正IL-2Rγ基因序列⁴.

后一种方案在概念上与早期基因治疗试验中使用的方案相似IL-2Rγ将该基因导入逆转录病毒载体。这些试验对大多数患者产生了临床益处，但由于病毒基因组的插入突变，一些患者诱发了白血病。如上所述，ZFN产生的离靶效应属于不同类型，但仍可能在关键位点发生突变。与病毒传递一样，很难准确预测可能出现的问题，因为基于增长优势的选择会将极低频事件放大到有害水平。

因此，一个备受关注的领域将包括通过学习检测和预防非目标事件来提高ZFN的特异性和安全性。修复病灶染色显示了过度卵裂的程度，但极少数事件仍可能导致问题。一些研究小组检测了通过序列搜索或在体外结合并发现极低水平的ZFN诱导突变^5,7,8然而，由于染色质结构或核环境的其他特征，这些可能不是活细胞中风险最大的基因组位点。鉴定次级靶标的一种更通用的方法是从表达ZFN的细胞中捕获断裂末端，并对侧翼DNA进行测序。这可能通过使用连接介导的PCR和高通量测序实现，例如使用454或Solexa测序平台。

如上所述，切割结构域的工程以防止同聚体化，在减少靶外切割方面非常有效。此外，应该可以限制ZFN表达的时间和持续时间，以减少产生不良影响的机会。由于ZF不能完全区分，与针对18-bp序列的三指蛋白质相比，识别24-bp靶点的四指ZFN对可以实现更大的特异性。

然而，有一些危险是，额外的手指将导致在更多的非目标序列中分裂，因为一个子集可能足以直接结合。一项研究¹⁴对特定的一对4指ZFN显示出更大的细胞毒性；然而，3指和4指蛋白并没有指向同一个基因组靶点，并且这两种蛋白都没有携带修饰的切割结构域。显然，在这方面还需要做更多的工作。

一个相关的问题是，NHEJ的诱变和HR的基因替换都是由相同的靶点突变刺激的。在某些需要HR的情况下，新突变的背景是可以接受的。例如，在纠正突变时IL-2Rγ只要有足够数量的人得到纠正，在这个靶点诱导新突变的基因就无关紧要。在其他情况下，靶向诱变可能更成问题。通过暂时禁用NHEJ途径的成分或通过人工刺激HR，可以将这一点降至最低。

在更遥远的将来，基于ZFN的修饰可以与其他干细胞疗法相结合，特别是当在体外文化和扩张是可能的。在不同的情况下，必须实现的目标性修改的频率会有所不同，但最近关于NHEJ和HR事件的报道在处理细胞的10%（或更大）范围内，当再次移植后发生扩大和选择时，或者在这种程度的纠正是足够的情况下应该是足够的，就像某些分泌蛋白一样。向特定组织输送ZFN和矫正供体DNA体内这是一个更大的挑战，尤其是当多个器官可能受到疾病影响时。与其他类型的基因治疗一样，对传递的考虑也同样适用，病毒载体的开发进展也可以用于ZFN。ZFN对对偶表达载体的构建⁵腺病毒和整合缺陷型慢病毒载体⁴已经证明是有效的在体外.

ZFN方法的一个可能局限性是依赖于DNA修复的特定细胞路径。如果HR通路在特定的靶组织中相对不活跃，那么相应地，基因校正将更加困难。由于ZFN通常只是短暂表达，在体外治疗后不会出现，因此它们不太可能引起免疫反应。然而，正如在基因添加策略中一样，非功能性疾病基因的纠正将导致合成正常蛋白质，但这种蛋白质在患者之前的生活中并不存在，因此可能会诱导免疫反应。

想要寻找新基因的基因治疗师将在新ZFN对的设计、生产和测试中获得持续的帮助。锌指联盟最近的努力是事情可能如何发展的一个例子⁶此外，Sangamo已与Sigma-Aldrich就生产和销售ZF蛋白（包括ZFN）达成协议。这将使该技术更广泛地应用。虽然无法保证新ZF设计的成功，但文献中很少有失败的报道¹⁹模块化组装和选择都产生了功能性的ZFN。与其他增强基因靶向性的方法相比，ZFN在设计新靶点方面比归巢核酸内切酶更容易和更灵活²⁰不同于ΦC31整合酶介导的位点特异性插入²¹，ZFN介导的事件修改了目标基因的自然位置。

ZFN领域仍处于早期阶段。随着更多实验室获得更多经验，我们将更好地了解最关键的参数和最有效的程序。幸运的是，许多对这项技术感兴趣的研究人员都专注于人类疾病的应用，因为这无疑将加速有用疗法的发展。此外，从模式生物中吸取的教训将有助于我们理解ZFN的能力和局限性。这对该领域来说是一个激动人心的时刻，因为我们发现在改善人类遗传病方面可以取得什么样的成就，以及付出什么样的代价。

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