介绍
先天免疫是宿主抵抗微生物病原体的第一道防线。宿主细胞利用其模式识别受体（PRR）检测病原体相关分子模式（PAMP）。Toll样受体家族（TLR）是一类识别PAMP的PRR，包括脂蛋白、脂多糖（LPS）、双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）和非甲基化CpG DNA（由Akira等人，2006年). 配体增强型TLR招募衔接蛋白MyD88或TRIF来激活下游激酶，包括IκB激酶复合物（IKK）和IKK相关激酶（TBK1和IKK-ε），它们分别激活转录因子核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子（IRF）。NF-κB和IRFs在细胞核中共同发挥作用，诱导I型干扰素（IFN；例如IFN-α和IFN-β）和其他细胞因子。
在另一个PRR途径中，细胞溶质RNA被RIG-I样受体（RLR）识别，其中包括RIG-I、MDA5和LGP2(Yoneyama等人，2004年). RLR包含识别病毒双链RNA的RNA解旋酶结构域。此外，RIG-I和LGP2包含一个C末端调控域，该调控域识别含有5′-三磷酸的单链RNA，从而区分外来（如病毒）RNA和通常含有5′修饰的自身RNA（如capped mRNA）。RIG-I和MDA5还包含N末端串联半胱天冬酶激活和募集域（CARD），与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS，也称为IPS-1、VISA和CARDIF）的CARD域相互作用(Kawai等人，2005年;Meylan等人，2005年;Seth等人，2005年;Xu等人，2005年). MAVS通过其C末端跨膜结构域定位在线粒体外膜上，这种定位对于MAVS激活胞浆激酶IKK和TBK1以诱导IFN是重要的(Seth等人，2005年).
像RNA一样，胞浆中外来或自身DNA的积累也会触发强大的先天免疫反应。DNA可以在感染DNA病毒或细菌后被导入哺乳动物细胞的胞浆中，胞浆DNA的检测对于增强对这些病原体的免疫反应非常重要。在某些条件下，自身DNA被不适当地传递到胞浆，导致自身免疫反应。例如，DNase II缺陷的巨噬细胞缺乏从吞噬的凋亡细胞中消化自身DNA的能力，导致产生IFN-β(Okabe等人，2005年;Yoshida等人，2005年). 然而，细胞溶质DNA诱导干扰素的机制尚不清楚。特别是，检测细胞溶质DNA并触发干扰素产生的传感器在很大程度上仍然未知。虽然DNA-依赖性干扰素调节因子激活物（DAI）被认为是一种潜在的细胞溶质DNA传感器(Takaoka等人，2007年)，DAI缺陷小鼠仍能产生干扰素来响应B型DNA，并具有与野生型小鼠相似的先天性和适应性免疫反应(石井等人，2008). 最近的研究确定AIM2是一种细胞溶质DNA传感器，可激活炎症小体和caspase-1（由Schroder等人，2009年). 然而，AIM2不参与细胞溶质DNA诱导的I型干扰素。
遗传研究表明，细胞溶质DNA可以诱导缺乏RIG-I或MAVS的小鼠细胞产生干扰素，这表明DNA信号途径与RIG-I途径不同(石井等人，2006年;Sun等人，2006年). 然而，有证据表明，在某些人类细胞系中，通过转染双链DNA诱导IFN-β依赖于RIG-I和MAVS(Cheng等人，2007年;石井等人，2006年). 然而，RIG-I与RNA结合，但与DNA不结合，这引发了DNA如何激活RIG-I途径的问题。
在本报告中，我们显示双链DNA poly（dA-dT）·poly（dA-dT。这种RNA物种含有5′-三磷酸并形成双链RNA。DNA到RNA的转换可以在体外使用细胞溶质提取物进行重演。生化纯化导致鉴定依赖于DNA的RNA聚合酶III（Pol-III）是负责将DNA模板转录成激活RIG-I的RNA配体的酶。RNAi介导的Pol-III表达下调或其酶活性抑制通过转染DNA或感染几种DNA病毒（包括腺病毒、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和EBV）阻碍干扰素诱导。此外，Pol-III抑制剂阻止细胞内细菌诱导干扰素嗜肺军团菌这些结果有力地表明，Pol III是一种通过RIG-I途径触发I型干扰素产生的胞质DNA传感器。
结果
细胞质DNA通过中间RNA触发RIG-I通路
在试图鉴定参与干扰素-β产生的细胞溶质DNA传感器的过程中，将各种DNA与干扰素β启动子驱动的荧光素酶报告子一起转染HEK293细胞。细胞裂解物通过荧光素酶活性测定和天然凝胶电泳进行分析，以检测IRF3二聚体(). 作为对照，这些细胞还被转染合成RNA多聚体（I:C）或感染仙台病毒（SeV），仙台病毒是一种已知可诱导IFN-β的RNA病毒。在检测的DNA中，包括poly（dA-dT）、poly（d I-dC）、小牛胸腺DNA、不同长度的PCR片段和线性化质粒（pcDNA3。用两对不同的siRNA寡核苷酸沉默RIG-I或MAVS的表达强烈抑制了poly（dA-dT）诱导的IRF3和IFN-β(). 用DNase-I预处理poly（dA-dT）可完全消除其诱导IFN-β的能力，而RNase A处理对其无影响()，表明依赖RIG-I诱导干扰素-β不是由于poly（dA-dT）中的某些RNA污染所致。含有50或100个AT序列核苷酸的合成DNA寡核苷酸是IFN-β的有效诱导物，而长度相当的GCAT或GC序列几乎没有活性(补充图S1). 有趣的是，在AT50的中间插入10个GC核苷酸，可消除其IFN-β诱导活性。聚-T、聚-A或聚-T和聚-A之间形成的双链DNA没有诱导IFN-β。含有80%AT序列的双链DNA能够诱导IFN-β，而含有50%AT序列的DNA则不活跃(图S1). 综上所述，这些结果表明，DNA在HEK293细胞中诱导干扰素需要富含AT的序列和一定的长度（30-50个核苷酸，见下文）。Poly（dA-dT），但未检测其他DNA，也激活了HeLa细胞中的IRF3并诱导了IFN-β；RIG-I或MAVS的RNAi抑制了IRF3的激活(补充图S2)表明聚（dA-dT）对干扰素-β的RIG-I依赖性诱导并不局限于HEK293细胞。
Poly（dA-dT）通过中间RNA激活依赖RIG-I的干扰素β的产生（A） 用报告质粒IFN-β-Luc（25 ng/ml）、pCMV-LacZ（50 ng/ml。转染16小时后对细胞进行裂解，然后进行荧光素酶报告分析（上面板）或IRF3二聚体分析（下面板）。PCR：所示大小的线性PCR片段；HindIII:pcDNA3的HindIII-线性片段；标记：DNA标记（0.1-10 kB；NEB）；SeV：仙台病毒感染。（B） 用对照siRNA寡核苷酸转染HEK293细胞以对抗GFP，两对不同的siRNA寡糖（a和B）以对抗RIG-I或MAVS。随后，用干扰素-β-Luc、pCMV-LacZ和pcDNA3共同转染细胞。24小时后，用poly（dA-dT）（1μg/ml）转染细胞或感染SeV。转染或感染后16小时进行荧光素酶报告试验（上面板）或IRF3二聚化试验（下面板）。（C） 用预先用DNase I（0.2 U/μl）或RNaseA（0.1 mg/ml）消化过的poly（dA-dT）转染HEK293细胞，然后按（A）所述进行IFN-β荧光素酶报告试验。（D） 将HEK293细胞转染或不转染poly（dA-dT）16小时，然后通过苯酚/氯仿萃取从细胞裂解液中制备核酸。用DNase I（0.2 U/μl）或RNase A（0.1 mg/ml）消化后，将核酸转染到HEK293-IFNβ-萤光素酶报告细胞中，以测量IFN-β诱导。（E） 将不同大小和组成的DNA转染HEK293细胞，如图所示（1μg/ml）。用TRIzol提取总RNA，然后转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。在平行实验中，DNA直接转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。（F） MAVS缺失的MEF细胞转染各种DNA或感染SeV。处理16小时后收集培养上清液，用ELISA法测定干扰素-β。（G） 如（F）所述处理MAVS缺陷的MEF细胞，然后用TRIzol提取总RNA并转染到HEK293-IFNβ-萤光素酶报告细胞中。（H） 在提取总RNA进行qPCR之前，用poly（dA-dT）或poly（dG-dC）转染小鼠BMDM 8小时。IFN-β基因的表达水平与β-肌动蛋白基因的表达标准化。（一） 如（H）所述转染BMDM细胞，然后用TRIzol提取总RNA并转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。
为了确定在转染poly（dA-dT）的细胞中负责RIG-I活化的配体，我们用苯酚和氯仿从细胞裂解液中提取核酸，并测试这些核酸诱导IFN-β的能力。从转染poly（dA-dT）的细胞中提取的核酸能有效诱导IFN-β。令人惊讶的是，从poly（dA-dT）转染细胞中提取的核酸活性对RNase A敏感，而对DNase I不敏感，这表明poly（d A-dT().
为了测试IFN-诱导RNA的产生是否取决于细胞溶质DNA的长度和/或组成，我们将合成的DNA寡核苷酸以及较长的poly（dA-dT）和poly（d G-dC）（购自GE Healthcare）转染到HEK293-IFNβ-Luc报告细胞中，以测量DNA对IFN-β的诱导作用。提取转染细胞的RNA，然后将其转染到相同的IFN-β报告细胞中，以测量RNA对IFN-β的诱导作用(). 有趣的是，含有少至30个碱基对的poly（dA-dT）能够在转染的细胞中引导IFN诱导RNA的产生。相比之下，即使是长的poly（dG-dC）和GCAT DNA序列也无法产生任何IFN诱导RNA。
先前的研究表明，缺乏RIG-I或MAVS的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在DNA转染后仍能产生IFN-β，包括poly（dA-dT）(石井等人，2006年;Sun等人，2006年). 为了确定MEF细胞中DNA的转染是否也导致产生IFN-诱导RNA，我们用各种DNA转染MAVS缺陷的原代MEF细胞，然后用ELISA测定IFN-β的产生。事实上，poly（dA-dT）、poly（d I-dC）·poly（d-I-dC）[poly（d I-d C）]和小牛胸腺DNA（但不是仙台病毒感染）诱导MAVS缺陷MEF细胞产生IFN-β(). 当从这些细胞中提取的RNA转染到HEK293-IFNβ-Luc报告细胞中时，只有从poly（dA-dT）转染和仙台病毒感染细胞中提取出来的RNA能够诱导IFN-β(). 这些结果表明，MEF细胞具有两条细胞溶质DNA感应通路，一条检测DNA而不考虑序列组成，通过MAVS诱导的依赖机制诱导IFN-β，另一条识别多聚（dA-dT）序列并产生触发RIG-I-MAVS通路的RNA配体。聚（dA-dT）和聚（dG-dC）DNA都能在骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中诱导IFN-β，但只有从转染聚（dA-dT）的BMDM中提取的RNA能够在转染HEK293-IFNβ-Luc报告细胞时诱导IFN-(). 因此，poly（dA-dT）不仅在转化细胞（HEK293和HeLa）中，而且在原代成纤维细胞（MEF）和巨噬细胞（BMDM）中产生IFN-诱导RNA。
鉴定中间RNA为含有5′-三磷酸的双链RNA
RIG-I识别含有5′-三磷酸的双链RNA（dsRNA）和单链RNA（ssRNA）(Hornung等人，2006年;Pichlmair等人，2006年). 为了确定用poly（dA-dT）转染细胞产生的IFN-诱导RNA的特征，我们用虾碱性磷酸酶（SAP）或多核苷酸激酶（PNK）处理从HEK293细胞中分离的RNA，然后测试其诱导IFN-β的能力(). SAP破坏了RNA的活性，但PNK处理没有破坏RNA的活性。使用PNK向SAP处理的RNA中添加一个磷酸盐并没有恢复活性，这表明含有5′-单磷酸盐的RNA不能诱导IFN-β。用终止子核酸外切酶（Ter-Ex）处理从多（dA-dT）转染细胞中提取的RNA，该酶专门消化含有5′-单磷酸的RNA，不会损害RNA的IFN诱导活性(; 下面板），而RNase-If（一种对热失活敏感的RNase）处理破坏了IFN-β诱导。对照实验表明，Ter-Ex能有效降解SAP和PNK处理RNA后产生的5′-p RNA(; 上部面板）。这些结果表明，干扰素诱导RNA在5′端含有一个以上的磷酸，很可能是5′-三磷酸（5′-ppp；见讨论）。
聚（dA-dT）干扰素诱导RNA的性质（A） 从多聚（dA-dT）或模拟转染细胞中提取的RNA在37°C下用虾碱性磷酸酶（SAP）或多核苷酸激酶（PNK）处理1小时。将SAP处理的RNA的等分试样在37°C下用PNK进一步处理1小时，以磷酸化DNA。通过乙醇沉淀沉淀RNA，然后将其转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞中。（B） 上图：用T7聚合酶转录的多聚（A-U）RNA在37°C下用终止子核酸外切酶（Ter-Ex）、PNK、SAP处理1小时。两份SAP处理的RNA用PNK磷酸化，然后用Ter-Ex进一步处理其中一份。下面板：从poly（dA-dT）或模拟转染细胞中提取的RNA用RNAse-If或Ter-Ex处理，然后转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。（C） 上面板：T7聚合酶产生的单链RNA（ssRNA）或双链RNA（dsRNA）用所示的不同数量的RNase A、RNase III或RNase T1消化，在1%琼脂糖凝胶上分离，然后通过溴化乙锭染色观察。下面板：从poly（dA-dT）转染细胞中提取的RNA用RNAse A、RNAse III或RNAse T1消化，然后转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。（D） 将Poly（dA-dT）转染到稳定表达FLAG标记RIG-I的HEK293细胞中，随后用抗FLAG抗体（M2）或对照IgG免疫沉淀RIG-I。提取细胞提取物（S100）、未结合上清液（sup）和免疫沉淀物（beads）中的核酸，然后将其转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞（上图）。用SDS-PAGE分离等分S100、sup和珠，并用FLAG抗体进行免疫印迹（下面板）。
接下来，为了确定中间RNA的结构，我们用已知对ssRNA或dsRNA具有特异性的RNA酶处理RNA。用体外合成的ssRNA或dsRNA测试RNA酶的特异性(，上部面板）。RNase III特异性地消化dsRNA，但不消化ssRNA，而RNase T1具有相反的特异性。与dsRNA相比，ssRNA对低浓度RNase A的消化更敏感。当来自poly（dA-dT）转染细胞的RNA被RNase III和高浓度RNaseA降解dsRNA时，它失去了诱导IFN-β的能力。相反，RNase T1或低浓度RNase a降解ssRNA，对RNA诱导IFN-β的能力没有影响(，下面板）。这些结果表明，来自多聚（dA-dT）转染细胞的IFN-诱导RNA是含有5′-三磷酸的双链RNA。为了确定RNA是否为RIG-I配体，我们使用FLAG特异性抗体（M2）从稳定表达FLAG标记RIG-I的HEK293细胞中免疫沉淀RIG-I。提取免疫沉淀物中的RNA并测试其诱导干扰素-β(). 从poly（dA-dT）转染细胞免疫沉淀的RIG-I复合物中提取的RNA诱导IFN-β，而模拟转染细胞的RIG-1复合物不包含IFN-诱导RNA。总之，这些结果表明poly（d A-dT，绑定并激活RIG-I。
poly（dA-dT）至少有两种可能的机制导致产生IFN-诱导RNA。poly（d A-dT。或者，poly（dA-dT）可以作为模板，指导某些酶（如依赖于DNA的RNA聚合酶）从头合成RNA。为了确定RNA聚合酶II（RNA Pol-II）是否参与IFN-诱导RNA的合成，将poly（dA-dT）转染到HEK293-IFNβ-Luc报告细胞系中，该报告细胞系经RNA Pol-III抑制剂α-amanitin预处理，然后从细胞中提取总RNA并再次转染到IFN-β报告细胞系。α-amanitin阻断poly（dA-dT）诱导的IFN-β转录(补充图S3A)，但不抑制RNA的生成，当从药物处理细胞中提取RNA并重新转染到HEK293-IFN-β报告细胞中时，RNA仍然能够诱导IFN-β(图S3B). 这些结果表明，RNA聚合酶II不参与从poly（dA-dT）转录中间RNA。放线菌素D嵌入富含GC的双链DNA并阻止转录延伸，也不能阻止多聚（dA-dT）转染细胞中IFN-诱导RNA的生成(图S3B)这表明放线菌素D没有抑制poly（dA-dT）的转录，或者RNA不是通过从头合成生成的。
产生干扰素诱导RNA的无细胞系统
为了剖析poly（dA-dT）导致产生IFN诱导RNA的机制，我们测试了DNA是否可以在无细胞系统中触发RNA生成。HeLa细胞溶质提取物（S100）与聚（dA-dT）、ATP、MgCl孵育2和RNase抑制剂在30°C下作用1小时，然后进行苯酚/氯仿萃取和DNase I处理。然后对RNA进行IFN-β诱导试验。值得注意的是，在这个无细胞系统中生成的RNA有效地激活了IFN-β启动子(). 这种活性被核糖核酸酶（RNase）而非脱氧核糖核酸酶（DNase）处理所消除，表明IFN诱导活性不是由于污染了poly（dA-dT）。(). 与基于细胞的分析类似，在体外系统中，poly（dG-dC）、poly（dI-dC）或小牛胸腺DNA不能触发IFN-诱导RNA的产生(补充图S4A). 来自人（HEK293和THP1）和小鼠（MEF和Raw264.7）细胞系的细胞裂解物也能够在聚（dA-dT）存在下产生IFN诱导RNA(图S4B). 此外，经SAP或消化dsRNA的酶（RNase III和高浓度RNase A）处理后，体外生成的RNA失去了诱导IFN-β的能力，但消化ssRNA的酶没有诱导IFN-(图S4C和S4D). 体外生成的IFN诱导RNA也对终止子核酸外切酶具有耐药性，表明它不含5′-单磷酸(图S4E). 这些结果表明，我们建立的无细胞系统忠实地再现了多聚（dA-dT）转染细胞中IFN-诱导RNA的生成。
体外生成IFN诱导RNA需要ATP和UTP（A） HeLa S100与聚（dA-dT）或聚（dG-dC）（20μg/ml）和ATP（2mM）在30°C下孵育1小时。DNase I（0.2U/μl）和/或RNase A（0.1mg/ml）处理后，用苯酚/氯仿提取RNA，然后转染HEK293-IFNβ-萤光素酶报告细胞。（B） 用40%硫酸铵沉淀HeLa S100，然后用80%硫酸铵进一步沉淀上清液。在存在或不存在热处理HeLa S100上清液的情况下，透析沉淀物并与聚（dA-dT）和ATP孵育（“热处理”）。从体外反应中提取RNA并转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞。（C） 生成干扰素诱导RNA所需耐热因子的纯化方案。（D）Superdex肽柱上小分子的色谱图（A260）（最后一步；下面板）。将Superdex肽柱中的成分与40%硫酸铵沉淀的蛋白质组分、poly（dA-dT）和ATP孵育，然后提取RNA用于IFN-β报告分析（上面板）。（E） 馏分18（F18；顶部光谱）和21（F21；底部）的核磁共振波谱。中间频谱是真实UDP和UTP标准的混合（1:2.5）。（F） 用UTP、CTP、GTP或UTP/CTP/GTP（1.5 mM）替代体外反应中的“热休克”，然后提取RNA用于IFN-β报告检测。（G） 在体外进行含有粗蛋白部分（40%硫酸铵沉淀）、聚（dA-dT）、ATP和UTP（完全反应）或缺少所示成分之一的反应，然后提取RNA用于IFN-β报告分析。
体外生成IFN诱导RNA需要ATP和UTP
为了确定产生干扰素诱导RNA所需的因素，我们首先通过40%和40-80%硫酸铵沉淀将HeLa细胞溶质提取物（S100）分为两部分。对沉淀进行透析（5kDa截止），然后分析其在聚（dA-dT）和ATP存在下生成IFN-诱导RNA的能力。令人惊讶的是，40%和40-80%的组分既没有单独的活性，也没有组合的活性()表明一些因素在透析过程中丢失或未被80%硫酸铵沉淀。为了测试HeLa S100是否包含产生IFN诱导RNA所需的一些小分子或其他耐热因子，我们在75°C下处理HeLa S100 15分钟，以沉淀大多数蛋白质和上清液（“加热”）在硫酸铵沉淀的透析部分存在的情况下，对其支持生成IFN-诱导RNA的能力进行了测试。在含有40%硫酸铵沉淀蛋白的反应中加入“热稳定剂”，可以产生干扰素诱导RNA(). “热敷”中的活性对蛋白酶K、DNase I和RNase If具有抗性(图S5A)，并且可以穿透具有5kDa分子量截止值的过滤器（数据未显示），这表明生成IFN诱导RNA需要一些小分子。我们通过使用凝胶过滤柱（Superdex肽；). 两个峰的部分在254纳米处具有最大吸收（数据未显示），这表明它们可能是核苷酸或核苷酸衍生物。
使用LC-MS进一步分析Superdex肽柱中的两个活性组分（18和21）(补充图S6)和核磁共振(). LC-MS分析（参见补充信息分数21（F21）表示存在UDP米/z第403.0页[M–H]+尽管HEPES缓冲液的存在部分掩盖了信号(图S6). 这个1F21的H核磁共振波谱（D）2在600 MHz下的O显示尿苷核苷酸的特征信号：δ7.89和5.91 ppm处的两个芳香双联体，5.87 ppm处的一个异头双联体和核糖的重叠多联体(). 与D中UDP的真实标准的比较2O与10μM HEPES和40μM KCl在1核磁共振波谱，明确确定F21的活性成分为UDP。
第二个活性组分F18被确定为UTP与UDP的比例为2:1。LC-MS清楚地显示出UDP的存在，但在初始条件下，我们无法检测到UTP。1H NMR分析显示，δ7.85和7.89 ppm的两个双谱线以2:1的比率出现，信号的复杂混合物为δ5.85到5.90 ppm(). F18和F21之间两组信号的相似性表明存在与UDP相关的代谢物，很可能是UTP。1具有10μM HEPES和40μM KCl的真实标准1:2.5 UDP:UTP的H NMR与F18几乎相同。化学位移的微小差异可归因于F21和真实标准之间的pH和离子强度的差异。我们最初使用我们最初的液相色谱条件（实验程序中的条件1），通过液相色谱-质谱联用（LC-MS），错过了F18中UTP的存在，但将缓冲液改为0.1 M NH4OAc作为缓冲区（条件2）允许我们使用米/z第483.0页[M–H]+(图S6).
为了验证UTP和UDP在产生IFN诱导RNA中的需求，我们在含有透析蛋白（40%硫酸铵沉淀）、聚（dA-dT）和ATP的体外分析中，用UTP、CTP、GTP或这三种核苷酸的混合物替换了“热抑制”。只有UTP才能支持IFN诱导RNA的生成(). UDP、UMP和尿苷（而非dNTP）也支持体外试验中的IFN诱导(图S5B&C)表明该蛋白质组分可能具有核苷酸激酶活性，可将UDP、UMP或尿苷转化为UTP。由于反应混合物中始终含有ATP，我们从反应中去除了ATP，发现这种去除消除了IFN-诱导RNA的产生(). 因此，在体外系统中生成IFN诱导RNA需要ATP和UTP。
依赖DNA的RNA聚合酶III催化IFN诱导RNA的生成
用蛋白酶K处理HeLa S100完全破坏了体外系统中IFN诱导RNA的生成，表明S100中的一个或多个蛋白质是RNA生成所必需的(). 我们通过八步常规色谱法从HeLa S100中纯化活性蛋白(，左）。对Superdex-200最后一步的组分进行分析，以确定其在poly（dA-dT）、ATP和UTP存在下刺激IFN-诱导RNA生成的能力(，右上角）。各组分的等分样品也通过银染色进行分析(，右下方）。至少有8条可见带与活性共同纯化。其中三个谱带，p45、p40和p23，通过纳米电喷雾串联质谱鉴定。p45条带包含DNA导向RNA聚合酶III（POLR3D）的D亚单位，p40包含POLR3F、POLR3C、POLR3D和POLR3H，p23包含POLR3G和POLR3D。免疫印迹显示，POLR3F和POLR3G与产生IFN诱导RNA的活性共同纯化(补充图S7). 由于这些蛋白质是RNA聚合酶III（Pol-III）的亚单位，我们试图鉴定Pol-III复合物的所有亚单位。我们建立了稳定表达FLAG-POLR3F的HEK293细胞系，并用FLAG抗体免疫沉淀Pol III复合物。用FLAG肽洗脱Pol-III复合物，然后用抗POLR3G或对照IgG抗体再次免疫沉淀(). 免疫沉淀蛋白的银染显示POLR3G复合物中存在至少12条不同的带，但对照IgG样品中没有。这些独特谱带的纳米电喷雾质谱鉴定出11个已知的Pol-III亚基（POLR3A、POLR3B、POLR3C、PORR3D、POLR3G、POLL3F、POLRAG、PORL3GL、POLRAH、PONR1C和CGRP-RCP）(胡等，2002)以及其他两种蛋白（类TRM1和RPS4），它们在Pol-III介导的转录中的作用尚未见报道(补充表1). 重要的是，用抗POLR3G免疫沉淀的纯化的Pol III复合物，而不是对照IgG免疫沉淀，足以在poly（dA-dT）、ATP和UTP存在下催化IFN诱导RNA的合成().
Pol-III的纯化和鉴定（A） HeLa S100在37°C下与蛋白酶K（2 mg/ml）一起或不与蛋白酶K一起培养1小时，然后与poly（dA-dT）和ATP一起培养，然后提取RNA用于IFN-β报告分析。（B） 按照左图所示的方案进行蛋白质纯化，并分析最后一个Superdex 200柱的分支，以确定其产生IFN诱导RNA的活性（上面板）和银染色（12%SDS-PAGE；下面板）。箭头表示蛋白质与活性共存，并通过质谱分析。星号表示纯化时作为载体蛋白添加的鸡白蛋白。（C） 使用稳定表达FLAG-POLR3F的HEK293细胞的细胞溶胶提取物，使用抗FLAG琼脂糖（M2）免疫纯化Pol-III复合物。用FLAG肽洗脱后，用针对POLR3G或对照IgG的抗体对FLAG-Pol III复合物的等分试样进行免疫沉淀，并通过银染色分析沉淀的蛋白质。通过质谱法鉴定了抗POLR3G的独特条带。（D） 在提取RNA用于IFN-β报告检测之前，将来自（C）的免疫纯化Pol-III复合物与poly（dA-dT）、ATP和UTP孵育。（E） 将HeLa细胞裂解物（S100）与TBP、POLR3F、POLR3G或对照IgG特异性抗体免疫沉淀两次（IP1和IP2）。对沉淀的内源性蛋白质进行活性测试，以产生IFN诱导RNA（上面板）。沉淀蛋白和上清液（“Sup”）的等分样品用所示抗体进行免疫印迹分析。
为了确定内源性Pol-III能否催化poly（dA-dT）合成IFN-诱导RNA，我们通过免疫沉淀法从HeLa S100中纯化了Pol-III复合物。用抗POLR3F或POLR3G抗体免疫沉淀但不控制IgG的蛋白质能够产生IFN诱导RNA(). 我们还测试了TATA-结合蛋白（TBP）的参与，该蛋白已知能够识别大多数Pol-II和一些Pol-III启动子中存在的dT-dA序列。用TBP抗体沉淀的蛋白质不含POLR3F或POLR3G，也不催化IFN诱导RNA的合成。总之，这些结果表明，核心RNA Pol-III复合物在体外催化poly（dA-dT）产生IFN诱导的RNA。
Pol-III以poly（dA-dT）为模板催化合成poly（A-U）RNA
Poly（dA-dT）而非Poly（dG-dC）导致转染细胞中产生IFN-诱导RNA()和粗细胞裂解物(图S4A). 类似地，从表达FLAG-tagged POLR3D或POLR3F的HEK293稳定细胞纯化的Pol-III复合物催化从poly（dA-dT）而不是poly（dG-dC）合成IFN-诱导RNA(). 溴化乙锭染色显示，poly（dA-dT），而不是poly（d G-dC）作为体外RNA合成的模板(). 体外转录实验表明，Pol-III催化α-32当使用poly（dA-dT）而不是小牛胸腺DNA作为模板时，P-UTP转化为RNA(). 使用放射性标记的poly（a-U）RNA探针进行的Northern blot分析证实，Pol-III在poly（dA-dT）存在下合成的RNA确实是poly（a-U）(，车道2）。
Pol-III催化以poly（dA-dT）为模板合成poly（A-U）RNA（A） 从稳定表达FLAG-tagged POLR3D或POLR3F的HEK293细胞中免疫纯化Pol-III复合物，然后在NTP存在下与poly（dA-dT）或poly（dG-dC）孵育。从反应中提取RNA用于IFN-β报告基因测定。（B） 通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析由poly（dA-dT）或poly（dG-dC）体外转录合成的RNA。（C） 在α存在下，通过聚（dA-dT）或小牛胸腺DNA的体外转录合成RNA-32通过琼脂糖凝胶电泳和放射自显影术分析P-UTP和NTP。（D） 稳定表达FLAG-tagged RIG-I的HEK293细胞被poly（dA-dT）（6和7道）转染，感染仙台病毒（8和9道）或模拟治疗（4和5道）。随后用FLAG抗体（M2）或对照IgG免疫沉淀RIG-I，提取沉淀中的RNA并用Northern blotting分析32P标记的聚（A-U）RNA作为探针。在通道1-3中，通过poly（dA-dT）或poly（dG-dC）的体外转录或在没有DNA的情况下合成的RNA通过Northern印迹分析。底部面板：通过FLAG抗体免疫印迹分析免疫沉淀蛋白。SM：起始材料（细胞裂解物）；s： 上清液；b： 在珠子上结合蛋白质。
为了测试poly（dA-dT）是否指导细胞内poly（A-U）RNA的合成，我们将poly(; 车道4-9）。Poly（A-U）RNA存在于从Poly（dA-dT）转染细胞分离的RIG-I复合物中，但不是模拟转染细胞或仙台病毒感染细胞。这些结果有力地表明，poly（dA-dT）作为模板，指导Pol-III合成poly（a-U）RNA。由于其序列互补性，poly（a-U）可能形成双链RNA，并且它显然保留了5′-三磷酸，使其成为强的RIG-I配体。
Pol-III是产生干扰素诱导RNA所必需的
为了确定Pol-III是否是负责HeLa S100中poly（dA-dT）依赖RNA合成的主要酶，我们使用抗POLR3F抗体通过重复免疫沉淀法从提取物中去除Pol-III。Pol-III缺失的S100在很大程度上缺乏合成干扰素诱导RNA的活性，而用对照IgG进行模拟缺失并不能消除这种活性(). 与细胞质Pol-III在细胞液中生成IFN-诱导RNA的概念一致，从多聚（dA-dT）转染细胞的细胞液中分离的RNA强烈诱导IFN-β，而从相同细胞中分离的核RNA没有().
Pol-III是生产干扰素诱导RNA所必需的（A） 使用POLR3F特异性抗体或对照IgG对HeLa细胞裂解物（S100）进行五次免疫去除。S100和免疫缺失上清液与poly（dA-dT）、UTP和ATP孵育，然后提取RNA以进行IFN-β报告分析（上图）。用POLR3F抗体免疫印迹法分析免疫耗竭效率（下表）。（B） 将HEK293细胞转染有或无poly（dA-dT）4小时。制备细胞核和细胞溶质裂解物以提取RNA。将0.5μg或15%的核或细胞溶质RNA转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞中，以测量IFN-β诱导。（C） 将两种不同的抗POLR3F的siRNA寡核苷酸（a和b）或抗GFP的对照siRNA转染到HEK293细胞中。转染48小时后，用poly（dA-dT）转染细胞或仙台病毒感染细胞2小时，然后提取RNA进行IFN-β报告检测（上图）。用抗POLR3F（低）抗体的免疫印迹法分析RNAi的效率。（D） 如（C）所述，用siRNA转染HEK293/RIG-I-FLAG稳定细胞，然后用poly（dA-dT）转染3小时。使用FLAG抗体免疫沉淀RIG-I复合物，然后提取与RIG-I相关的RNA，并使用Northern blotting分析32P标记的聚（A-U）RNA作为探针。免疫印迹法分析免疫沉淀物中的RIG-I和细胞裂解物中的POLR3F。（E） 在用poly（dA-dT）转染HEK293细胞或感染仙台病毒2小时之前，用指定浓度的Pol-III抑制剂ML-60218处理HEK292细胞10小时。提取RNA用于IFN-β报告基因测定。（F） 用ML-60218处理HEK293/RIG-I-FLAG稳定细胞，然后用poly（dA-dT）转染。如（D）所述，通过Northern印迹分析与RIG-I复合物相关的RNA。
为了测试Pol-III是否是在poly（dA-dT）转染细胞中产生IFN诱导RNA所必需的，我们采用了两种独立的方法。在第一种方法中，我们使用两对不同的抗POLR3F的siRNA寡核苷酸沉默HEK293细胞中这种重要的Pol-III亚单位的表达，然后用poly（dA-dT）转染细胞或用仙台病毒感染细胞。提取这些细胞的RNA，然后将其转染到HEK293-IFNβ荧光素酶报告细胞系。在poly（dA-dT）转染的细胞中，两种siRNA寡聚物，而不是对照GFP siRNA，都强烈抑制IFN诱导RNA的产生(). 相反，仙台病毒RNA的产生主要由病毒RNA依赖的RNA聚合酶进行，不受POLR3F基因敲除的影响。Northern blot分析表明，POLR3F的RNAi阻断了RIG-I相关的poly（A-U）RNA的产生，表明Pol-III是细胞内poly（dA-dT）转录所必需的(). 在第二种方法中，我们用RNA Pol-III的特异性化学抑制剂ML-60218处理HEK293细胞(Wu等人，2003年)在用poly（dA-dT）转染或感染仙台病毒之前。该抑制剂选择性地抑制了转染poly（dA-dT）的细胞中IFN-诱导RNA的产生，但在感染仙台病毒的细胞中没有(). 部分阻断IFN-β诱导可能是由于Pol-III在细胞中的不完全敲除和部分化学抑制。然而，从这些结果中可以清楚地看出，Pol III是将poly（dA-dT）转录为poly（A-U）RNA所必需的，从而诱导IFN-β。
通过以下方法诱导干扰素-β需要Pol-III嗜肺军团菌
先前的研究表明，MAVS的RNAi通过以下途径抑制人肺上皮细胞系中IFN-β的诱导嗜肺军团菌(Opitz等人，2006年)一种革兰氏阴性细胞内细菌，感染巨噬细胞并导致军团病。然而，MAVS在免疫防御中的作用军团菌其潜在机制基本上尚不清楚。我们感染了从野生型和小牛分离的BMDM-/-带有嗜肺军团菌然后用定量PCR（qPCR）检测IFN-β的表达；). 小牛体内细菌对干扰素-β的诱导作用显著降低-/-巨噬细胞。引人注目的是，Pol-III抑制剂ML-60218通过嗜肺军团菌以剂量依赖的方式(). 当从药物治疗和细菌感染的细胞中提取RNA，然后再次转染到Raw264.7巨噬细胞中时，从Pol-III抑制细胞中提取的RNA诱导IFN-β的水平降低到与模拟感染细胞中的RNA相似的水平()，表明Pol-III是通过军团菌.从细胞浆中分离出的RNA军团菌-受感染的细胞具有IFN诱导活性，而来自同一细胞的核RNA没有诱导IFN(). 重要的是，ML-60218治疗显著增加了巨噬细胞中的细菌负荷()表明抑制宿主Pol-III促进而不是阻碍细菌生长。干扰素-β治疗恢复了对军团菌Pol-III抑制剂处理的细胞复制()，表明Pol III诱导的IFN-β的产生对于抑制细菌复制是重要的。综上所述，这些结果强烈表明Pol-III和MAVS介导干扰素诱导和免疫防御军团菌.
细胞内细菌和DNA病毒诱导干扰素β需要Pol-III（A） 野生型或MAVS缺失的BMDM细胞被感染嗜肺军团菌持续8小时。提取总RNA进行qPCR。IFN-β基因的表达水平与β-肌动蛋白基因的表达标准化。（B） 用指示浓度的ML-60218处理Raw264.7细胞10小时，然后感染嗜肺军团菌感染8小时后提取总RNA，进行干扰素-β和β-肌动蛋白的qPCR。（C） 从处理过的ML-60218中提取的RNA嗜肺军团菌-如（B）所述，将感染的Raw264.7细胞转染到Raw2647细胞中8小时。用qPCR检测IFN-β和β-actin的表达。（D） Raw264.7细胞被感染嗜肺军团菌持续8小时。制备细胞核和细胞溶质裂解物以提取RNA，将其转染到Raw264.7细胞中8小时。用qPCR检测IFN-β的表达，并将其归一化为β-肌动蛋白水平。（E） 用ML-60218处理Raw264.7细胞10小时，并感染嗜肺军团菌24小时。用0.1%皂苷溶解细胞，并将裂解产物涂布在BCYE琼脂平板上。培养2天后对菌落进行计数，显示为每1000个细胞的CFU。（F） 在小鼠IFN-β（1000 U/ML）存在或不存在的情况下，用ML-60218处理Raw264.7细胞10小时，然后感染嗜肺军团菌24小时。细菌菌落的测定如（E）所述。（G-I）Raw264.7细胞用ML-60218处理10小时，然后感染腺病毒（AdV；G）、单纯疱疹病毒-1（HSV-1；H）或仙台病毒（SeV；I）。提取总RNA用于干扰素-β和β-肌动蛋白的qPCR。（J） 用ML-60218处理产生EB病毒（EBV）的B95-8细胞24小时，然后制备总RNA用于qPCR。的表达式级别EBER1、EBER2、干扰素-β和α-肌动蛋白基因与β-肌动蛋白RNA。α-和β-肌动蛋白都是Pol-II转录基因。
Pol-III介导DNA病毒诱导IFN-β
一些DNA病毒，包括腺病毒、单纯疱疹病毒1（HSV-1）和EB病毒（EBV），在RIG-I依赖性物质中诱导IFN-β的产生(Cheng等人，2007年;Rasmussen等人，2007年;Samanta等人，2006年). 为了确定Pol-III是否在DNA病毒诱导干扰素中发挥作用，我们用ML-60218处理Raw264.7细胞，然后用腺病毒、HSV-1或仙台病毒（RNA病毒作为对照）感染细胞。腺病毒诱导干扰素-β()和HSV-1()经ML-60218治疗后显著降低。相比之下，ML-60218治疗对仙台病毒诱导的IFN-β无影响()提示ML-60218的作用不是由于对IFN-β合成的普遍抑制。ML-60218还抑制感染HSV-1的巨噬细胞产生IFN诱导RNA，但不抑制仙台病毒(补充图S8A&B).
EBV诱导的干扰素与人类自身免疫性疾病有关，包括系统性红斑狼疮（SLE）(Ronnblom和Pascual，2008年). 有趣的是，EBV编码的小RNA 1和2（EBER1和EBER2）是非编码、非多腺苷酸化的RNA，形成dsRNA-like干环结构(Lerner等人，1981年). 这些丰富的小RNA含有5′-三磷酸，存在于可与SLE患者的抗La抗体沉淀的RNP颗粒中。我们测试了Pol-III抑制剂对产生EBV的人类B细胞系B95-8产生IFN-β的影响。在提取总RNA进行qPCR之前，用不同量的ML-60218处理这些细胞。ML-60218治疗降低了EBER1、EBER2和IFN-βRNA的水平(). 相反，Pol-II依赖基因α-actin的表达不受Pol-III抑制剂的影响。ML-60218还抑制EBV感染细胞中IFN诱导RNA的产生(补充图S8C). 总之，这些结果表明Pol-III可能通过EBV编码的小RNA的转录，在EBV感染的B细胞中介导IFN-β诱导。
讨论
在本报告中，我们描述了富含AT-的细胞溶质DNA诱导人和小鼠细胞株产生IFN-β的机制。我们发现，poly（dA-dT）可作为DNA依赖性RNA聚合酶III从头合成poly（a-U）RNA的模板。RNA的IFN诱导活性对末端核酸外切酶和RNase T1具有抗性，但对碱性磷酸酶和RN酶III敏感，表明这是一种双链RNA，在5′端含有一个以上的磷酸盐。虽然目前我们无法确定RNA是否含有5′-三磷酸或5′-二磷酸，但已知Pol-III可以合成含有5′–三磷酸的RNA。我们的结果是Pol-III负责从poly（dA-dT）合成RNA(&)直接与RIG-I绑定(&)，强烈提示RNA含有5′-三磷酸。
RNA Pol-III复合物对于体外催化poly（dA-dT）合成poly（A-U）既必要又充分。通过使用RNAi和Pol-III的特异性抑制剂，我们证明Pol-III是细胞内poly（dA-dT）产生IFN诱导RNA所必需的。此外，Pol-III抑制显著降低了细胞内细菌对干扰素-β的诱导(嗜肺军团菌)和DNA病毒（腺病毒、HSV-1和EBV），但不是RNA病毒（仙台病毒）。Pol-III抑制也导致细菌复制显著增加(嗜肺军团菌). 这些结果强烈表明，Pol-III在检测和限制细胞内细菌和DNA病毒感染方面起着关键作用。
细胞质RNA Pol-III是一种触发先天免疫反应的DNA传感器
Pol-III从细胞溶质提取物中纯化()与其作为细胞溶质DNA传感器的作用一致。从用poly（dA-dT）转染或用军团菌感染的细胞中分离的胞浆RNA强烈诱导IFN-β，而从相同细胞的细胞核中分离的RNA没有(&)进一步支持了我们的模型，即细胞溶质Pol-III负责产生IFN-诱导RNA，然后在细胞溶质中被RIG-I识别。以前利用体外转录检测的研究表明，三分之二的Pol-III活性位于细胞质中，而Pol-I和-II活性分别只有16%和11%位于细胞质(Jaehning和Roeder，1977年). 这些开创性研究将Pol-III分为两种色谱形式（IIIA类和IIIB类). 仅Pol-IIIA类存在于细胞核中，而Pol-III的含量大致相等A类和IIIB类发现于细胞质中。为什么Pol-III的大部分活性存在于应该避免使用DNA的胞浆中，这一直是一个长期的谜团。我们的发现是，细胞溶质Pol-III是一种调节先天免疫反应的DNA传感器，这为这个难题提供了一个潜在的答案。细胞溶质是Pol-III在免疫防御中发挥作用的战略位置，因为细胞溶质中合成的RNA含有RIG-I可以检测到的5′-三磷酸，而细胞核中合成的RNA可能会被酶（如封盖酶（如mRNA））修饰或加工成5′-单磷酸（如tRNA），因此，我们认为核和细胞质RNA聚合酶具有相反的功能：而核聚合酶产生宿主RNA，应对其进行修饰，以避免通过RIG-I途径触发自身免疫反应，胞质Pol III专门用于检测外来和异常DNA，以产生免疫反应来保护宿主细胞质的完整性。
用RNA Pol-III识别富含AT-的DNA序列
至少有三种不同的复合物被鉴定为聚合酶III的转录因子（TFIIIA、TFIIIB和TFIIIC）(Schramm和Hernandez，2002年). TBP是TFIIIB的亚单位之一，与TATA盒结合。poly（dA-dT）序列的性质可能为TBP结合提供TATA基序。然而，TBP不存在于催化poly（dA-dT）体外转录的高纯度Pol-III复合物中，并且从细胞溶质提取物中免疫沉淀的TBP不具有转录活性(). 因此，尽管我们的结果不能排除TBP在体内细胞溶质Pol-III对DNA序列识别中发挥作用的可能性，但TBP可能并不负责Pol-III优先识别富含dA-dT的序列。我们纯化的Pol-III复合物包含至少13个亚基；其中一些亚基可能决定允许Pol-III转录的最佳序列。
最近的一项研究表明，RNA结合和激活RIG-I需要同聚核糖核苷酸组成，如富含A-U的序列(Saito等人，2008年). 因此，富含GC的DNA可能仍然可以转录成RNA，但RNA缺乏激活RIG-I的能力。然而，我们发现Pol-III不能转录poly（dG-dC）或poly（dG-dC-dA-dT）DNA(). 此外，如果我们使用T7 RNA聚合酶转录含有GCAU序列的RNA或含有50%GC组成的随机序列，该RNA可以有效地诱导IFN-β(补充图S9)表明GC-rich DNA诱导IFN-β的失败是由于缺乏RNA的生成，而不是GC-rich RNA无法诱导IFN-α。
细胞溶质RNA Pol-III检测病毒和细菌DNA
尽管许多DNA病毒编码依赖于DNA的RNA聚合酶，有些病毒使用细胞RNA聚合酶类进行病毒基因转录，但大多数病毒RNA都被细胞和病毒编码的修饰酶（如封盖酶）修饰。然而，一些病毒RNA，如腺病毒的VA-I和VA-II RNA以及EB病毒的EBER1和EBER2 RNA，是含有5′-三磷酸的非编码小RNA(Lerner等人，1981年;Rosa等人，1981年). 我们的结果和以前的研究表明，这些病毒RNA是由细胞Pol-III转录的。EBER基因包含由TFIIIB和TFIIIC识别的内部控制序列基序（方框A和B），这些基序指导Pol-III的转录(Schramm和Hernandez，2002年). 此外，EBER基因的上游启动子包含一个TATA-like序列，该序列指定Pol-III而非Pol-II的转录(豪和舒，1993年). 因此，细胞溶质DNA（其中一些来自细菌和病毒）的转录不仅受Pol-III对富含dA-dT序列的识别控制，还受与Pol-III相关的其他转录因子（如TFIIIA、B和C）控制。
虽然VA和EBER小RNA是含有5′-三磷酸的丰富Pol-III转录物，但它们通常与细胞蛋白复合形成RNP颗粒，主要位于细胞核中(Lerner等人，1981年). 因此，这些病毒RNA在胞质溶胶中与RIG-I分离，从而解释了为什么含有这些丰富的病毒RNA的细胞不会产生大量的IFN。这可能是病毒逃避宿主免疫系统的机制，也可能是宿主避免过度自身免疫反应的机制。然而，VA和EBER RNP颗粒与SLE患者的抗体反应(Lerner等人，1981年;Rosa等人，1981年). SLE患者的血清和慢性感染EBV的细胞的I型干扰素水平均升高，流行病学研究表明EBV感染与SLE之间存在联系(Ronnblom和Pascual，2008年). 在某些病理条件下，一些病毒RNA可能获得RIG-I，从而触发IFN的产生，从而导致自身免疫性疾病。
与病毒一样，细胞内细菌是I型干扰素的有效诱导剂。然而，细菌诱导干扰素的机制在很大程度上是未知的。有趣的是，Mavs缺乏的巨噬细胞在产生干扰素β方面严重缺陷，以应对感染嗜肺军团菌我们的发现是，通过以下途径诱导干扰素β需要Pol-III嗜肺军团菌为Mavs依赖的先天免疫反应提供了一种机制。我们的结果表明，Pol-III检测到细菌DNA的某些片段，并将其转录成RNA配体，通过RIG-I-MAVS途径诱导IFN-β。利用Pol-III作为细菌和DNA病毒的DNA传感器，可使宿主利用RIG-I-MAVS途径防御更大范围的微生物病原体。
细胞溶质DNA触发的MAVS依赖性和独立性通路
我们的结果是，MAVS的缺失或Pol-III的抑制阻断了IFN-β的产生，以应对军团菌感染表明Pol-III–MAVS途径是该细菌诱导干扰素的主要途径(). 未来的研究应揭示MAVS依赖的DNA传感途径是否是免疫防御其他病原体的主要途径，包括细菌、DNA病毒，甚至疟疾等寄生虫。然而，Pol-III–MAVS途径不太可能是诱导I型干扰素的唯一胞质DNA传感途径。虽然人类细胞系HEK293和HeLa仅依赖Pol-III–MAVS途径来诱导IFN对poly（dA-dT）的反应，但原代MEF细胞同时具有MAVS依赖和独立的途径来检测细胞溶质DNA。有趣的是，我们注意到MEF细胞通过反复传代而自发永生，导致MAVS依赖性通路的丢失（Chiu，Y和Chen，Z.J.，未发表）。目前尚不清楚为什么永生化或转化细胞会失去MAVS依赖途径，但有趣的是，DNA转染在一些转化细胞（如HEK293和HeLa）中导致IFN诱导的丧失可能会使这些细胞在分子细胞生物学中得到广泛应用。MAVS依赖性途径似乎识别DNA结构而不是序列。虽然DNA-结合蛋白DAI（ZBP1）被认为是诱导1型干扰素的DNA传感器，但DAI缺陷小鼠和这些小鼠的细胞在产生I型干扰物以响应DNA刺激方面没有明显缺陷(石井等人，2008;Takaoka等人，2007年). 最近发现的DNA-结合蛋白AIM2显然是一种细胞溶质DNA传感器，可以激活炎症小体和caspase-1，但它不会诱导I型干扰素(Schroder等人，2009年). 可能存在多个传感器来检测外源或异常自身DNA对胞浆的入侵。对这些DNA传感器（包括Pol-III）的鉴定，应能提供对包括细菌和病毒在内的多种微生物病原体的先天免疫反应机制的关键见解。此外，这一系列研究将使人们对狼疮等使人衰弱的自身免疫性疾病的机制有更深入的了解。
实验程序
核酸提取
根据制造商的说明，用TRIzol（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。为了制备核质和细胞质RNA，细胞在缓冲液A（10 mM Hepes[pH7.5]、10 mM KCl和1.5 mM MgCl）中进行裂解2)将上清液以500×g离心5分钟，收集核颗粒。将上清液在20000×g下进一步离心10分钟，以收集细胞溶质上清液。用苯酚和氯仿从细胞核和细胞溶质裂解物中提取核酸，然后进行异丙醇沉淀。
体外重组测定
如前所述制备细胞提取物（S100）(邓等人，2000). S100（2 mg/ml）与聚（dA-dT）或聚（dG-dC）（20μg/ml）以及ATP（2 mM）、MgCl共同孵育2（5 mM）和核糖核酸酶抑制剂（0.4U/μl，Invitrogen）在30°C的50μl反应混合物中放置1小时。培养后，添加50μl缓冲液A，然后用苯酚/氯仿萃取核酸，然后用异丙醇沉淀和DNase I消化。对提取的RNA进行干扰素β诱导试验。对于重组实验，反应中使用硫酸铵沉淀或柱馏分的透析蛋白和热上清液（heat-sup）代替S100。通过在75°C下培养HeLa S100 15分钟，然后在20000×g下离心以收集上清液，获得保温。为了从热量供应中纯化小分子，反应混合物含有40%来自S100的透析硫酸铵沉淀物、来自热量供应的柱级分、聚（dA-dT）、ATP、MgCl2和核糖核酸酶抑制剂。对于Pol-III的纯化，反应混合物包含S100、UTP（0.2mM）、poly（dA-dT）、ATP、MgCl的柱馏分2和核糖核酸酶抑制剂。
病毒和细菌感染
用Pol III抑制剂ML-60218（Calbiochem）预处理Raw264.7细胞10小时，然后在100 MOI下感染工程腺病毒5型（来自Vector Biolabs的Ad-CMV-GFP；该病毒缺乏E1和E3基因），在100 MOL下感染HSV-1，或嗜肺军团菌（血清组1菌株AA100，来自ATCC）在50 MOI下放置8小时。用PBS冲洗细胞并在Trizol中溶解以提取总RNA。
细菌复制试验
将Raw264.7细胞在存在或不存在小鼠IFN-β（Sigma）的情况下用ML-60218预处理10小时，然后用嗜肺军团菌MOI=50，持续24小时。用PBS清洗细胞，然后在0.1%皂苷中溶解5分钟。用PBS将细胞裂解液稀释40000倍，然后将其涂在缓冲木炭酵母提取物（BCYE）琼脂平板上(Opitz等人，2006年). 在37°C下培养2天后，对菌落进行计数以确定菌落形成单位（CFU）。
