《公共科学图书馆·病理学》。2009年10月；5（10）：e1000607。
通过不需要IRF-3和IRF-7的IPS-1依赖信号在髓样细胞中诱导IFN-β和天然抗病毒反应
，1 ，2 ，1 ，2和1，三，4，*
斯蒂芬·达菲斯
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系
Mehul S.Suthar公司
2美国华盛顿州西雅图华盛顿大学医学院免疫学系
克里斯蒂·J·斯兹雷特
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系
小迈克尔·盖尔。
2美国华盛顿州西雅图华盛顿大学医学院免疫学系
迈克尔·S·戴蒙德
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系
三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系
4美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系
甘内斯·森，编辑器
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系
2美国华盛顿州西雅图华盛顿大学医学院免疫学系
三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系
4美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系
美国克利夫兰诊所
构思并设计了实验：SD MSS MG MSD。执行实验：SD MSS KJS。分析数据：SD MSS KJS MG MSD。撰写论文：SD MSS MG MSD。
收到日期：2009年3月11日；2009年9月8日接受。
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摘要
干扰素调节因子（IRF）-3和IRF-7是调节病毒感染后Ⅰ型干扰素基因（IFN-α/β）诱导和先天免疫防御的主要转录因子。先前对IRF-3或IRF-7基因单一缺失小鼠的研究表明，其对西尼罗河病毒（WNV）感染的易感性增加。WNV感染后，缺乏IRF-7的小鼠和细胞表现出IFN-α水平降低，而缺乏IRF-3或IRF-7小鼠和细胞的IFN-b生成相对正常。这里，我们生成了IRF-3−/−×IRF-7−/−双基因敲除（DKO）小鼠，分析WNV的发病机制、IFN反应和先天防御信号。与野生型小鼠相比，DKO小鼠表现出了迟钝但未消除的系统IFN反应，并且持续不受控制的WNV复制导致快速死亡。体外分析显示，DKO成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞和皮层神经元的IFN-α反应完全消融，DKO纤维细胞和皮层神经细胞的IFN-β反应显著降低。相反，在DKO巨噬细胞和树突状细胞中，IFN-β反应最小。然而，NF-κB和ATF-2/c-Jun（IFN-β增强子体的另外两个已知成分）的药理抑制强烈降低了DKO树突状细胞中IFN-β基因的转录。最后，IPS-1（一种参与RIG-I和MDA5介导的抗病毒信号转导的适配器）的遗传缺陷完全消除了WNV感染后的IFN-β反应。总的来说，我们的实验表明，与成纤维细胞和皮层神经元不同，骨髓细胞中WNV感染后IFN-β基因的调节是IPS-1依赖性的，但不需要典型组分转录因子完全占据IFN-β增强子体。
作者摘要
西尼罗河病毒（WNV）是一种蚊子传播的病毒，感染鸟类、马和人类，已成为西半球新出现的传染病威胁。在人类中，西尼罗河病毒可以侵入大脑和脊髓并破坏神经元，导致严重的神经疾病，特别是在免疫缺陷患者和老年人中。更好地了解免疫系统如何控制WNV感染对于开发新的治疗方法和疫苗至关重要。在本研究中，我们使用WNV感染小鼠模型，评估了两种关键转录因子，即干扰素调节因子-3（IRF-3）和IRF-7的联合作用，这两种转录因子在感染后协调抗病毒和干扰素（IFN）反应。缺乏IRF-3和IRF-7的小鼠极易受到致命感染，缺乏IRF-3和IRF 7的细胞对IFN-α的反应显著减弱。令人惊讶的是，缺乏IRF-3和IRF-7的巨噬细胞和树突状细胞表现出相对正常的IFN-β反应。此外，IPS-1是RIG-I-和MDA5细胞质病毒RNA传感器下游的一种信号蛋白，其基因缺陷完全阻断了干扰素-β的产生。我们的实验表明，在感染WNV的特定细胞类型中，IFN-β可以通过IPS-1依赖的转录信号诱导，该转录信号不需要主转录调控因子IRF-3和IRF-7。
介绍
I型干扰素（IFN-α/β）的快速产生和IFN-诱导的抗病毒反应是宿主抵抗多种病毒感染的主要防御机制（综述于[1]–[3]). 在宿主模式识别受体（PRR）结合病原体相关分子模式（PAMP），如病毒核酸后，IFN-α/β基因转录被诱导[4]–[6]). RNA病毒感染后产生I型干扰素的当前范式描述了由主转录因子干扰素调节因子（IRF）-3和-7调节的两步或正反馈模型[7]–[9]在初始阶段，通过PRR进行病毒感应可诱导IRF-3的核定位，从而刺激基因转录和受感染细胞产生IFN-β和IFN-α4。在第二阶段，这些干扰素以旁分泌和自分泌的方式与一个共同的干扰素-α/β受体结合，并通过JAK-STAT途径发出信号，导致数百个干扰素刺激基因（ISG）的诱导表达（例如PKR、RNAse L、viperin、ISG15和ISG20），这些基因通过多种机制限制病毒复制[10]–[13]鉴于IRF-3在特定PRR（如TLR3、MDA5和RIG-I）下游的许多组织和功能中组成性表达，以抑制RNA病毒，IRF-7既是ISG，又是不同PRR（例如TLR7和TLR8）下游的转录激活物；IRF-7通过诱导IFN-β和许多IFN-α亚型参与IFN扩增环[14].
西尼罗河病毒（WNV）的识别黄蜂科RNA病毒家族，通过固有的细胞免疫反应被认为是通过几个PRR（TLR3、TLR7、TLR8、RIG-I和MDA5）的协同信号发生的，这些PRR识别单链或双链RNA，并通过其组成的适配器分子（TRIF、MyD88和IPS-1）发出信号。用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行的组织培养实验表明，RIG-I是WNV的初始和主要PRR，因为基因缺陷细胞在感染后的早期时间点具有消除ISG反应的作用[15]晚期ISG应答似乎更依赖MDA5，这表明RIG-I和MDA5对激活有效的细胞抗病毒应答具有双重要求，至少在MEF中是如此[16]相反，MEF、巨噬细胞和树突状细胞中TLR3的缺乏并没有改变IFN-α/β的产生或病毒负荷，表明该传感器在识别这些细胞类型中的WNV方面的作用更为有限[17]迄今为止，尚未发表TLR7和TLR8在WNV感染细胞后引发IFN应答中的直接作用的实验。最近的一项研究表明，TLR7中I型IFN的系统产生没有减少−/−感染WNV的小鼠[18]然而，对其他RNA病毒的研究表明，TLR7/MyD88/IRF-7轴调节树突状细胞特定亚群中的I型干扰素反应[19]，[20].
对基因缺陷小鼠的研究表明，IRF-3通过控制外周和中枢神经系统（CNS）组织中的病毒负荷而不影响系统性I型干扰素反应，在防止致命性西尼罗河病毒感染方面发挥了重要作用[21]对原代细胞进行的实验证实，IRF-3通过I型IFN依赖机制限制WNV在皮层神经元和MEF中的复制，而在髓系细胞中，IRF-3通过调节基础或WNV诱导的宿主防御分子的表达，独立于IFN限制WNV感染[21]最近的研究表明IRF-7在体内对控制西尼罗河病毒感染具有关键作用[22].IRF-7型−/−小鼠在多个组织中出现明显升高的WNV负荷，并有一个迟钝的系统性I型干扰素反应。对原代细胞的研究表明，IRF-7主要通过IFN-α依赖机制控制西尼罗河病毒感染。令人惊讶的是，IFN-β反应保持完整，表明IRF-3和IRF-7在调节IFN-β基因表达方面可能存在多余作用。这些结果与IRF-7的独立研究一致−/−MEF感染单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口炎病毒（VSV）或脑心肌炎病毒（EMCV）后，显示出残余的IFN-β反应，这些反应在IRF-3中被消除−/−×IRF-7−/−MEF公司[14].
为了了解IRF-3和IRF-7在体内WNV感染后先天免疫程序中的联合作用，我们生成了IRF-3−/−×IRF-7−/−双基因敲除（DKO）小鼠。IRF-3和IRF-7的缺失导致WNV在组织中不受控制的复制，并且比任何一个单基因缺失都更快地死亡。尽管病情严重，但DKO表型并没有与同类IFN-αβR中观察到的表型相同−/−老鼠。尽管完全不存在IRF-3和IRF-7，但IFN-β诱导在某些细胞类型中基本上保持完整。值得注意的是，在髓系树突状细胞（mDC）体外实验中，WNV感染后的IFN-β反应因缺乏IPS-1而被取消，但在很大程度上不受联合缺陷或转录因子IRF-3和IRF-7或IRF-1、IRF-5或IRF-8的个体缺陷的影响。然而，除了IRF-3和IRF-7外，NF-κB和ATF-2/c-Jun这两种其他因子对信号传导的药理抑制形成了IFN-β基因转录复合物增强子体[23]–[25]WNV感染后，显著降低了DKO中的IFN-β反应，但未降低野生型mDC。这些研究确定了细胞类型特异性分子机制和IRF在抗病毒防御中的作用，并揭示了增强体成分在诱导IFN-β基因对RNA病毒反应中的不同需求。
结果
WNV感染后DKO小鼠的死亡率增加
由于IRF-3和IRF-7可能存在功能冗余，为了充分评估它们对WNV感染后IFN-β转录反应调节的净贡献，我们生成了IRF-3−/−×IRF-7−/−（DKO）小鼠。这些动物皮下感染了10种2WNV高致病性纽约株的PFU。野生型C57BL/6小鼠的存活率为～60%，而同源型DKO小鼠表现出严重的表型，死亡率为100%，平均死亡时间为6.0天(). 相比之下，IRF-3−/−或IRF-7−/−感染相同剂量西尼罗河病毒的单基因敲除小鼠也有100%的死亡率，但平均死亡时间分别为9.3天和7.4天[21]，[22].
小鼠存活率和病毒负荷分析。A.8至12周龄C57BL/6小鼠接种10只2通过脚垫注射对WNV进行PFU，并随访21天的死亡率。免疫缺陷小鼠和野生型小鼠的存活率差异具有统计学意义（n=================================================================================================================11，干扰素-αβR−/−; n个 = 20、DKO；和n = 20只野生型小鼠，P<0.0001）。干扰素-αβR之间的平均生存时间−/−（3.5天）和DKO（6天）小鼠也有统计学差异（P<0.001）。B–G类。西尼罗河病毒感染后外周和中枢神经系统组织的病毒负荷。使用qRT-PCR（B和C）或病毒斑试验（D–G）测定指定日期采集的样本中（B）血清和（C）引流淋巴结中的WNV RNA，以及（D）脾脏、（E）肾脏、（F）大脑和（G）脊髓中的感染病毒。数据显示为每个时间点10至12只小鼠的病毒RNA当量或每克组织的PFU。对于所有病毒载量数据，实线表示指定时间点每克PFU的中位数，虚线表示检测的灵敏度极限。
由于IRF-3和IRF-7是I型干扰素对病毒感染反应的关键调节因子，我们还比较了DKO表型与同源干扰素-αβR−/−老鼠。与我们之前观察到的类似[13]，[26]，干扰素-αβR−/−小鼠易受西尼罗河病毒感染，4天后死亡率为100%，平均死亡时间为3.5天(与DKO小鼠相比，平均生存时间P<0.001）。因此，尽管在WNV感染后，IRF-3和IRF-7的联合缺陷比其各自的单一缺陷具有更严重的表型，但生存模式并没有完全重现在IFN-αβR中观察到的情况−/−提示WNV感染后I型干扰素的诱导和/或调节可能需要额外的转录调节剂。
DKO小鼠在组织中表现出WNV复制失控
为了更全面地评估IRF-3和IRF-7缺陷对WNV体内发病机制的影响，用102在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第8天，通过荧光定量RT-PCR或病毒斑试验测量血液、外周器官（引流淋巴结、脾脏和肾脏）和CNS组织（大脑和脊髓）中WNV的PFU和病毒负荷().
与野生型小鼠相比，DKO小鼠的病毒血症升高(). 感染后一天，～101.5-在DKO小鼠中检测到病毒RNA水平升高了一倍（P<0.0001）。显著增强（104.6到106.2-第2-5天，DKO小鼠血清中WNV RNA水平增加了倍，P<0.0001），之后大多数动物死于感染。
在引流淋巴结中，同样高水平（102.8到105-在DKO小鼠感染期间，WNV RNA增加了一倍，P<0.0001）(). 在脾脏中，野生型小鼠直到第3天才检测到感染性西尼罗河病毒。相反，到第2天，所有DKO小鼠（10只，共10只）的病毒滴度显著升高（平均滴度为107.7PFU/g）(). 尽管野生型小鼠脾脏中的WNV感染在第3天至第5天逐渐增加，但明显更高（104.5到104.9-在DKO小鼠中观察到病毒负荷。肾脏显著感染的DKO小鼠（例如105PFU/g，第2天和第10天7.5PFU/g，第5天，)而野生型小鼠没有表现出肾脏的生产性感染。因此，IRF-3和IRF-7的联合缺乏导致WNV在外周小室持续和升高感染，包括向正常非许可器官扩散和传播。
对大脑和脊髓中病毒负荷的分析表明，WNV快速进入DKO小鼠的中枢神经系统。与野生型小鼠相比，第2天在DKO小鼠的所有大脑中检测到WNV，野生型小鼠直到第5天才发现WNV(). 值得注意的是，在第5天，DKO小鼠有～10只5.2-大脑中病毒滴度是野生型小鼠的两倍。在DKO小鼠的脊髓中观察到类似的模式，所有动物在第2天后都显示出明显升高的病毒载量(). 相反，在野生型小鼠中，大多数动物直到感染后第8天才检测到感染性西尼罗河病毒。因此，IRF-3和IRF-7的联合缺失会导致早期神经侵袭和WNV复制失控。
DKO小鼠的全身I型IFN反应减弱，但尚未消除
以前的研究报告称，体内缺乏IRF-3并不能显著降低WNV感染后血清中I型干扰素的水平[21]，[27]或其他病毒感染[14]相反，IRF-7−/−WNV感染小鼠的全身IFN反应降低但未消除[22]因此，我们使用DKO小鼠来确定通过IRF-3的信号是否可以解释IRF-7中WNV感染后残留的系统性I型IFN反应−/−老鼠。采用高度敏感的L929细胞生物测定法，我们比较了WNV感染后DKO和野生型小鼠的血清IFN水平。如前所述[21]，[22]在野生型小鼠中，第一天在血清中检测到I型干扰素，感染后第3天和第4天检测到峰值水平(). 相反，在DKO小鼠中，第1天的血清IFN水平低于检测水平（0.01 IU/ml）。尽管病毒血症较高，但与野生型动物相比，DKO小鼠在第2天、第3天和第4天的血清IFN水平降低了（降低了约5至14倍，P<0.005），但并未消除。通过对干扰素-α/βR的中和单克隆抗体进行耗竭实验，确认感染DKO小鼠血清中的这种抗病毒活性为I型干扰素依赖性（数据未显示）。因此，体内IRF-3和IRF-7的联合缺乏会延迟和减少血清中I型干扰素的积累。然而，随着时间的推移，WNV感染后，I型干扰素在DKO小鼠的血清中积累。因此，其他调节因素必须有助于系统性干扰素反应。值得注意的是，这些结果与最近的一项研究一致，在该研究中，感染小鼠巨细胞病毒（MCMV）的独立生成的DKO小鼠表现出了对IFN-β完全特异的残留系统性IFN反应[28].
WNV感染野生型和DKO小鼠血清中I型干扰素水平。小鼠接种102脚垫注射WNV的PFU，并在指定时间处死。通过在L929细胞中进行EMCV生物测定，从WNV感染后第1-4天收集的血清中测定I型IFN水平。数据反映了每个时间点5-10只小鼠的血清样本的平均值，数据以IFN-α/ml的国际单位（IU）表示。用抗IFN-αβR中和抗体证实了该测定的特异性（数据未显示）。星号表示具有统计意义的数值（**，P<0.005，*，P<0.05）。
西尼罗河病毒感染后MEF的I型干扰素和ISG应答需要IRF-3和IRF-7
为了更好地了解IRF-3和IRF-7对西尼罗河病毒感染的净作用以及诱导保护性IFN反应，我们感染了DKO和野生型小鼠的原代细胞。因为MEF在病毒感染宿主免疫反应检测中得到了广泛研究[16]，[29]，[30]，我们最初评估了IRF-3×IRF-7缺陷对这些细胞的影响。以前的实验显示IRF-7中IFN-α反应迟钝，IFN-β反应正常−/−MEF感染WNV[22]相反，IRF-3−/−MEF在感染后早期IFN-α和-β反应减弱，但在以后的时间点发展为正常水平（S.Daffis和M.Diamond，未发表的数据）。在DKO MEF中，WNV感染后IFN-αmRNA和蛋白分泌完全消失(). 同样，IFN-βmRNA水平在感染后24 h和48 h显著降低（降低了约70倍，P<0.0001），但未完全消除(). 细胞上清液中分泌的干扰素-β的测量证实了这些发现，DKO MEF在24小时和48小时时分别减少了约4倍和20倍（P<0.0001）(). 因此，WNV感染后MEF中IFN-α和IFN-β的正常诱导主要需要IRF-3和IRF-7的转录激活。
IRF-3和IRF-7控制MEF中IFN-α/β基因的诱导和ISG的表达。A–D。以0.1的MOI感染野生型或DKO小鼠产生的MEF，并分析IFN-α/β基因诱导。在感染后的指定时间采集未感染和WNV-感染MEF的总RNA，并用qRT-PCR测定（A）IFN-α和（C）IFN-βmRNA的水平。数据归一化为18S rRNA，并表示为未感染对照组归一化RNA的相对倍数增加。ELISA法评估上清液中（B）IFN-α和（D）IFN-β蛋白的积累。E.在指定时间从未感染（Un）或感染WNV（W）的野生型或DKO MEF中产生全细胞裂解物。免疫印迹分析检测ISG49、ISG54、RIG-I、WNV和微管蛋白的蛋白水平。F.由野生型产生的MEF，IFN-αβR−/−以0.001的MOI感染DKO小鼠，并通过斑块试验评估病毒生成。数据是至少三个独立实验的平均值，一式四份，（***，P<0.0001）。
接下来，我们通过Western blot分析评估了包括ISG49、ISG54和RIG-I在内的选定ISG的表达模式。在野生型MEF中，这些蛋白在感染后24小时迅速被诱导，并在48小时持续存在。相比之下，感染后24 h DKO MEF中没有诱导，48小时水平相对降低(). 为了评估这种表型如何影响西尼罗河病毒复制，进行了多步骤病毒生长分析(). 虽然在24小时时未观察到病毒滴度的差异，但在48小时时WNV复制增强（13倍，P = 0.004）和72小时（58倍，P<0.0001）。此外，DKO MEF中48和72小时的WNV水平高于之前使用单一IRF-3观察到的水平−/−或IRF-7−/−MEF（S.Daffis和M.Diamond，未发表的结果和[22]). 由于IRF-3和IRF-7似乎主要调节MEF中的IFN和ISG应答，我们预测DKO MEF中WNV复制表型不应与同类IFN-αβR有显著差异−/−MEF公司。事实上，当直接比较时，在DKO和IFN-αβR之间只观察到病毒生长的微小差异−/−MEF（2.7倍，48小时时P<0.03，72小时时2.3倍，P<0.002）().
IRF-3和IRF-7调节WNV感染后皮层神经元的I型IFN和ISG反应
为了评估IRF-3和IRF-7在控制病毒复制和神经元细胞IFN反应中的联合作用，我们评估了从DKO小鼠分离的初级皮层神经元的WNV感染。病毒生长动力学分析证实，IRF-3和IRF-7限制了WNV的复制，与野生型细胞相比，在24小时和48小时时，病毒滴度增加了约5至6倍（P<0.0001）(). 令人惊讶的是，相对于缺乏IRF-3或IRF-7的细胞，DKO神经元没有表现出复制增加（数据未显示和[21]，[22]). 在没有IRF-3和IRF-7的情况下，相对温和的复制表型与这些细胞中仅有一个小的IFN-依赖性抗病毒作用相一致：IFN-α或-β预处理可抑制皮层神经元中WNV感染，最大为5到8倍[13]对WNV感染的DKO神经元的IFN反应的分析表明，IFN-α基因诱导完全消融，证实了IRF-7的结果−/−皮层神经元[22](). 相反，与MEF或其他原代髓细胞（见下文）观察到的结果不同，DKO皮层神经元中IFN-βmRNA的诱导也被完全消除(). 与此一致的是，对DKO神经元中ISG的分析显示，WNV感染后ISG54、RIG-I和MDA5的诱导完全丧失(). 因此，在WNV感染后，皮层神经元通过转录调节因子IRF-3和IRF-7协调信号，以诱导IFN-α和IFN-β基因。
IRF-3和IRF-7通过调节初级皮层神经元的IFN-α/β反应和ISG表达来限制WNV感染。A.以0.001的MOI感染野生型或DKO小鼠产生的初级皮层神经元，并在指定时间通过斑块分析评估病毒生成。数值是三个独立实验产生的三份样品的平均值。星号表示具有统计意义的数值（***，P<0.0001）。B和C。用qRT-PCR测定WNV感染的皮层神经元中（B）IFN-α和（C）IFN-βmRNA的水平，如传说中所述D.在指定时间从未感染（Un）或感染WNV（W）的野生型或DKO MEF中产生全细胞裂解物。通过免疫印迹分析检测ISG54、RIG-I和MDA5的蛋白水平。数据是至少三个独立实验的平均值，一式四份（***，P<0.0001）。
WNV感染后Mφ的IFN-β反应部分依赖于IRF-3和IRF-7
正如先前的研究表明，I型干扰素诱导中存在细胞类型特异性差异[21]，我们评估了巨噬细胞（Mφ）中IRF-3和IRF-7联合缺乏的影响，巨噬细胞是体内允许WNV感染的细胞类型[26]先前的实验证明，缺乏IRF-3或IRF-7的Mφ更容易感染西尼罗河病毒[21]，[22]类似地，与野生型甚至IRF-3相比，DKO Mφ支持WNV复制增加（感染后24、48和72小时分别为-35、250和310倍，P<0.0001）−/−或IRF-7−/−单一缺陷细胞(和[21]，[22]). 与MEF观察到的情况相反（参见)，与IFN-αβR相比，DKO Mφ在72小时产生的WNV减少了约14倍（P<0.05）−/−Mφ同时感染。因此，Mφ中IRF-3和IRF-7的缺失并不能概括IFN-αβR的复制表型−/−细胞。由于这种差异可能与I型干扰素和/或ISG反应的差异有关，我们分析了WNV感染后DKO Mφ中的这些差异。正如预期的那样，干扰素-αmRNA水平被完全消除()，与IRF-7的结果一致−/−Mφ[22]而在感染DKO Mφ后24小时，IFN-βmRNA水平降低，48小时后累积到正常水平(). 对ISG表达的Western blot分析证实了这种模式，因为一些ISG的早期诱导在WNV感染后24小时发生改变，而不是48小时(). 因此，WNV感染Mφ后，IRF-3和IRF-7协同调节早期，但对后期的IFN-β和ISG应答是不必要的。
IRF-3和IRF-7部分调节原发性Mφ中的IFN-β反应和ISG表达。A.Mφ由野生型产生，IFN-αβR−/−以0.01的MOI感染DKO小鼠，并在感染后的指定时间通过斑块试验评估病毒生成。数值是至少三个独立实验产生的四份样本的平均值。B.在指定时间从未感染（Un）或感染WNV（W）的野生型和DKO Mφ产生全细胞裂解物。免疫印迹分析检测ISG49、ISG54、PKR、STAT1、RIG-I、MDA5和微管蛋白的蛋白水平。C和D。用qRT-PCR分析WNV-感染Mφ中（C）IFN-α和（D）IFN-βmRNA的诱导，如星号表示具有统计学意义的数值（***，P<0.0001，**，P<0.005，*）。
IRF-3和IRF-7对于WNV感染后mDC的IFN-β反应也是不可或缺的
因为mDC可能是动物WNV感染的早期目标[31]–[33]帮助协调先天性和适应性抗病毒免疫反应[34]，我们评估了骨髓源性mDC中的IFN和ISG反应。先前的研究表明，缺乏IRF-3或IRF-7的mDC支持增强WNV复制，即IRF-3−/−mDC在WNV感染后产生正常的IFN-α/β反应，IRF-7−/−mDC降低了WNV感染后的IFN-α反应，但相对完整的IFN-β反应（S.Daffis和M.Diamond，未发表的结果和[22]). WNV感染的DKO mDC的多步生长曲线分析显示，与野生型细胞（16-95倍，P<0.0001）和IRF-3相比，病毒负荷更高−/−或IRF-7−/−毫伏直流电(、S.Daffis和M.Diamond，未发表的结果，以及[22]). DKO mDC中的病毒滴度与IFN-αβR中的相似−/−mDC，提示DKO细胞中的I型IFN信号缺陷。令人惊讶的是，尽管IFN-αmRNA和蛋白水平被消除()，DKO-mDC感染WNV后，IFN-β基因的诱导和蛋白质的产生没有显著影响（P>0.05）(). 因此，在mDC中，IRF-3和IRF-7调节IFN-α反应，但在WNV感染后诱导IFN-β在很大程度上是不必要的。ISG的Western blot分析证实了这些发现，因为在WNV感染后24和48小时，野生型和DKO mDC中观察到类似水平的ISG(). 这些数据表明，ISG的表达主要依赖于IFN-β，或者IFN-α和-β在这些细胞中具有冗余效应。尽管如此，尽管干扰素-β反应和ISG表达谱相对正常，但DKO mDC中仍维持较高的病毒复制，因此IRF-3仍有可能直接调节ISG的一个关键亚群的表达，该亚群在该细胞类型中具有抗WNV活性。
WNV-诱导的IFN-β应答和ISG表达在mDC中主要独立于IRF-3和IRF-7。A.mDC由野生型IFN-αβR生成−/−以0.001的MOI感染DKO小鼠，并在感染后的指定时间通过菌斑试验评估病毒生成。数值是至少三个独立实验产生的四份样本的平均值（***，P<0.0001）。B–E类。用qRT-PCR或ELISA法测定WNV感染mDC中（B）IFN-α和（D）IFN-βmRNA以及（C）IFN-F.在指定时间从未感染（Un）或感染WNV（W）的野生型和DKO mDC中产生全细胞裂解物。免疫印迹分析检测ISG49、ISG54、PKR、STAT1、RIG-I、MDA5和微管蛋白的蛋白水平。
为了确定DKO mDC中的IFN-β诱导反应是否对WNV具有特异性，我们对TLR3和TLR4通路的激动剂以及无关病毒（新出现的人类α病毒基孔肯亚病毒（CHIK）和啮齿动物模型小核糖核酸病毒EMCV）进行了实验。正如预期的那样，用TLR3（poly I∶C）或TLR4（LPS）激动剂体外处理的野生型mDC快速诱导IFN-βmRNA(). 在DKO细胞中，与WNV相比，TLR治疗下游的IFN-β反应被有效地消除。因此，TLR3和TLR4刺激后mDC中IFN-β反应的激活需要IRF-3和IRF-7。为了确定IRF-3/IRF-7非依赖性IFN-β应答是否对WNV特异，我们用额外的RNA病毒感染mDC(). 在野生型mDC中，EMCV感染诱导了与WNV相似的强大IFN-β反应，并且在感染后24小时检测到高水平的IFN-βmRNA（增加约100倍）。在较高MOI条件下感染CHIK也会在感染后24小时产生类似的IFN-β基因诱导。在DKO细胞中，WNV、EMCV和CHIK感染后的IFN-β反应与野生型细胞中观察到的反应相同。因此，在mDC中，IRF-3和IRF-7对于激活IFN-β基因转录是不可或缺的，这不仅是对WNV的反应，也是对其他与基因无关的正链RNA病毒的反应。
TLR刺激和病毒感染后mDC的IFN-β反应。用50µg/ml的poly（I∶C）或2µg/ml的LPS刺激野生型和DKO小鼠产生的mDC 24小时，或用EMCV（MOI 0.1）、WNV（MOI.1）和CHIK（MOI 1）感染mDC 24 h，用ELISA或qRT-PCR测定IFN-β水平。数值是三个独立实验产生的三份样品的平均值。星号表示野生型细胞的统计显著值（***，P<0.0001，**P<0.0005）；n.s.表示差异在统计上不显著。
WNV感染后mDC的IFN-β反应并不依赖于I型IFN信号和IRF-1或IRF-8
为了研究mDC中调节IFN-β基因诱导的机制，我们感染了IRF-1−/−和IRF-8−/−mDC带WNV。这些转录因子与TLR刺激或病毒感染后DC中I型IFN基因的转录有关[35]，[36]值得注意的是，在IRF-1中未观察到IFN-α和IFN-βmRNA水平的差异−/−百万直流电(). 随后，我们评估了IFN-β转录调控因子是否是IFN-诱导的，正如在MCMV感染的情况下对IRF-8所建议的那样[36]或副粘病毒[37].干扰素-αβR−/−用WNV感染mDC，检测IFN-α和IFN-βmRNA水平。然而，这些细胞中的IFN-α反应减弱，可能是因为I型IFN正反馈回路的消失()，IFN-αβR中的IFN-β基因反应−/−mDC比野生型细胞大（5到10倍，P<0.05）(). 这些结果表明，与IFN-α反应的调节不同，mDC中WNV感染后IFN-β基因的激活与I型IFN正反馈回路无关。与此一致，WNV感染IRF-8后，IFN-α和IFN-β的诱导没有差异−/−毫伏直流电().
mDC中的IFN-β反应是IRF-1、IRF-8、IFN-α/β独立的，但部分依赖于IRF-5。野生型（A和B）IRF-1产生的mDC−/−，IRF-8−/−，（C和D）干扰素-α/βR−/−，或（E和F）IRF-5−/−以0.1的MOI感染小鼠，用qRT-PCR测定IFN-α（A、C和E）和IFN-β（B、D和F）mRNA的水平。数值是三个独立实验产生的三份样品的平均值。星号表示与野生型相比具有统计学意义的值（***，P<0.0001，**，P<0.005，*，P<0.05）。
最近的研究表明，IRF-5可以在病毒感染或TLR刺激后激活IFN和其他炎症细胞因子基因的转录[38]–[41]由于IRF-5也参与了体内干扰素的产生和保护，在被负链RNA病毒（新城疫病毒（NDV）和VSV）和DNA病毒（HSV）感染后[38]，[42]，我们评估了mDC细胞WNV感染后的转录信号是否依赖于IRF-5。IRF-5型−/−mDC在WNV感染24小时内仅表现出IFN-β基因转录的适度但可重复的降低（2.5倍，P<0.05）(). 然而，到48小时时，这些缺陷不再明显，因为在IRF-5中检测到同等甚至更高水平的IFN-βmRNA−/−细胞。总之，我们的实验表明，IRF-1和IRF-8对于诱导mDC中的IFN-β基因转录是不必要的，而IRF-5在WNV感染后对这些细胞具有短暂的小调节作用。
在DKO mDC中联合抑制NF-κB和ATF-2/c-Jun可降低WNV感染后的IFN-β反应
干扰素-β基因的转录激活需要一个被称为“增强子体”的增强子复合物的完全占据[23]–[25]在体外，活性干扰素β增强子体是在转录因子IRF-3、IRF-7、ATF-2/c-Jun和NF-κB结合后形成的。尽管IFN-β基因转录中的协同作用发生在几种细胞类型中这些调节因子的协同结合之后[25]，增强子完全占据的机制基础尚不完全清楚。由于IRF-3和IRF-7的联合缺乏仅适度降低了WNV感染后mDC中IFN-β基因的诱导，我们假设残余的IFN-β活性可能通过直接通过PRR信号介导的NF-κB依赖性和/或ATF-2/c-Jun依赖性信号发生。为了测试这种可能性，我们使用了高度特异性和经验证的NF-κB药理学抑制剂（BAY 11-7082）[43]，[44]p38 MAP激酶（SB 202190），对ATF-2/c-Jun复合物的磷酸化和激活至关重要[45]增加浓度的BAY 11-7082（NF-κB抑制剂）治疗DKO mDC，仅使WNV-诱导的IFN-β反应略有减少（最多减少3.9倍，P = 0.006) (). 相反，LPS诱导的TNF-α反应主要由NF-κB调节[46]，[47]，在野生型和经BAY 11-7082处理的DKO mDC中受到剂量依赖性抑制(). 类似地，用SB 202190治疗DKO mDC对WNV-诱导的IFN-β反应的影响有限（减少3.5倍，P = 0.02) (). 因此，在缺乏IRF-3和IRF-7的mDC中，单独抑制NF-κB或ATF-2/c-Jun只能适度降低WNV感染后IFN-β基因的转录。然而，联合抑制DKO mDC中的NF-κB和ATF-2/c-Jun可显著降低IFN-β反应（减少29倍，P<0.0001）。相比之下，下降更为轻微（下降2.5倍，P = 在保留IRF-3和IRF-7表达的野生型mDC中观察到WNV感染后IFN-β转录的0.006）。使用ATP代谢分析的平行实验证实，抑制剂的作用差异并不是由于野生型细胞和DKO细胞之间的细胞毒性差异所致(). 这些实验表明，在mDC中，干扰素-β基因的有效激活不需要完全的增强子小体占据，因为IRF-3、IRF-7、NF-κB和ATF-2/c-Jun的联合功能缺失对于WNV感染后IFN-β基因的激活具有强抑制作用。
野生型和DKO mDC和MEF中NF-κB和p38的药理抑制。A–B类。野生型和DKO小鼠产生的mDC（A）和MEF（B）在含有1%二甲基亚砜或增加BAY 11-7082浓度（在1%二甲基亚砜中）和/或增加SB 202190浓度（在1%DMSO中）的情况下以0.1的MOI感染。在感染后的指定时间通过qRT-PCR评估IFN-βmRNA的水平。使用细胞毒性试验分析细胞活性，如材料和方法C.BAY 11-7082抑制NF-κB转录活性的效率。用1%二甲基亚砜或5µM和10µM BAY 11-7082处理野生型和DKO mDC，并用LPS（2µg/ml）刺激24小时。用ELISA法测定分泌的TNF-α水平。值是三个独立实验产生的重复样本的平均值。星号表示具有统计学意义的数值（***，P<0.0001，**，P<0.005，*）；n.s.表示差异在统计上不显著。
由于在缺乏IRF-3和IRF-7的情况下，MEF中IFN-β反应的激活显著降低，因此我们假设，与在DC中观察到的情况相比，MEF的IFN-β基因的调节将更加依赖于增强子体与典型成分的完全占据。为了评估这一点，用感染WNV的BAY 11-7082和/或SB 202190治疗野生型MEF，并测量IFN-βmRNA的水平。与野生型mDC相比，野生型MEF中NF-κB的抑制轻微降低了IFN-β反应（减少了约2倍，P = 0.01）(). 同样，在野生型MEF中抑制ATF-2/c-Jun也会降低IFN-β反应（减少约5倍，P = 0.007). 更引人注目的是，野生型MEF中NF-κB和ATF-2/c-Jun的抑制强烈减弱了IFN-β基因的转录（减少了约20倍，P<0.0001）。因此，增强子单组分功能的破坏足以降低MEF中的IFN-β转录反应。与此一致，在DKO MEF中抑制NF-κB和/或ATF-2/c-Jun基本上消除了剩余的IFN-β反应(). 综上所述，这些数据表明，与MEF相比，mDC中IFN-β基因转录的最佳调节不需要增强子的四个典型组分完全占据。
IPS-1缺乏可消除MEF和mDC中的IFN-β反应
mDC对WNV的免疫检测可能通过细胞溶质PRR、RIG-I和MDA5进行，并通过IPS-1衔接蛋白进行必要的信号传导；这导致下游IRF家族蛋白和IFN基因转录的激活[16]为了更好地了解WNV暴露后PRR和IFN基因诱导之间的信号通路，我们感染了IPS-1−/−MEF和mDC。尽管在野生型mDC和MEF中IFN-α和-βmRNA水平随时间增加，但在IPS-1中两者的诱导作用几乎被取消−/−单元格(). 与此一致，我们没有从IPS-1中检测到任何分泌的IFN-α和β−/−DC或MEF上清液（数据未显示）。因此，WNV感染后mDC或MEF中I型IFN基因的诱导完全依赖于IPS-1信号传导。由于IRF-5可能在mDC的IFN-β基因调节中发挥部分作用()自从MyD88被建议在NDV感染后介导TLR和IRF-5依赖性细胞类型特异性诱导I型IFN以来[38]，我们还评估了MyD88在mDC中触发IFN-β反应的作用。如图所示()mDC中WNV感染诱导的IFN-α和β转录与MyD88基本无关。因此，WNV感染后mDC中的最佳IFN-β转录信号是通过一条需要IPS-1的途径产生的，IPS-1是典型增强子体四个成分（IRF-3、IRF-7、NF-κB和ATF-2/c-Jun）的子集，可能是在MyD88诱导的激活信号后IRF-5。
mDC和MEF中的IFN-β反应依赖于IPS-1，但依赖于MyD88。野生型IPS-1产生的mDC和MEF−/−和MyD88−/−小鼠以0.1的MOI感染，并通过qRT-PCR定量（A、C和E）IFN-α和（B、D和F）IFN-βmRNA的水平。值是三个独立实验产生的重复样本的平均值。星号表示具有统计意义的数值（***，P<0.0001）。
TRAF3和TBK1调节早期IPS-1依赖型I干扰素反应，而TRAF6调节晚期
尽管我们的实验表明，WNV感染后IFN-β的诱导需要IPS-1，但IPS-1是由转录调节因子的细胞类型特异性复合体介导的，连接这些途径的信号适配器仍不确定。由于针对VSV和仙台病毒对I型IFN基因的IPS-1依赖性调节需要激活TRAF3[48]，我们感染了TRAF3−/−并测定IFN-βmRNA和分泌细胞因子的水平。TRAF3型−/−MEF在感染后24小时和48小时显示IFN-βmRNA水平显著降低（分别为7.8倍，P<0.0001和2.4倍，P<0.05），通过测量细胞上清液中的IFN-β证实了这一点（分别为3.7倍和1.4倍，P<0.001）(). 这些数据表明，WNV感染后IFN-β反应的初始IPS-1依赖性触发至少部分由TRAF3介导。与此一致，反映I型IFN正反馈的IFN-αmRNA和蛋白水平在TRAF3中也降低−/−MEF（mRNA减少32倍和36倍，P<0.0001；蛋白质减少1.3倍，P<0.001）(). 据报道，TBK1是一种激酶，可介导诱导IPS-1/TRAF3轴下游产生IFN的信号[49]，我们在TBK1中检测了WNV感染后IFN-α/β的诱导−/−MEF公司。与TRAF3中观察到的类似−/−TBK1中MEF、mRNA水平以及更重要的是分泌的IFN-β水平降低−/−MEF（分别下降3.7倍和1.5倍，P<0.0001）(). 然而，TBK1中IFN-αmRNA和分泌细胞因子的水平−/−MEF与野生型MEF相比无差异（P≥0.2）(). 因此，在WNV感染后，TBK1似乎介导TRAF3下游的早期IFN-β反应，但对于IFN扩增环的后期激活似乎是可有可无的。总之，这些数据表明，在MEF中，早期IFN-β应答依赖于涉及IPS-1、TRAF3和TBK1的信号通路，而晚期IFN-β反应也可能部分涉及TRAF3。不幸的是，因为TRAF3−/−和TBK1−/−老鼠出生后不久就会死亡[50]，[51]，我们无法确认mDC中的这种信号通路。
MEF中I型干扰素调节的早期阶段部分涉及TRAF3和TBK1，而晚期需要TRAF6。TRAF3号机组−/−，TBK1−/−和TRAF6−/−MEF感染的MOI为0.1，用qRT-PCR和ELISA检测（A和C）IFN-α和（B和D）IFN-βmRNA和分泌蛋白的水平。未感染TBK1的IFN-β基因的基础mRNA表达−/−和TRAF6−/−MEF低于同类野生型细胞中观察到的MEF，仅对这些细胞，我们将IFN-βmRNA水平与野生型MEF进行了比较。值是三个独立实验产生的重复样本的平均值。星号表示具有统计学意义的数值（***，P<0.0001，**，P<0.005，*）；n.s.表示差异在统计上不显著。
最近对VSV感染细胞的研究表明，TRAF6调节IPS-1依赖信号以诱导I型IFN[52]为了评估TRAF6在WNV感染后诱导IFN应答中的作用，测定了TRAF6中mRNA和IFN-β分泌蛋白的水平−/−MEF。与TRAF3中观察到的相反−/−MEF、TRAF6 mRNA水平和分泌的IFN-β−/−细胞上清液在感染后24小时相当于野生型细胞（P>0.2），但在48小时时略有减少（约减少2倍，P<0.0001）(). 变压器6−/−然而，MEF表现出IFN-αmRNA水平和蛋白分泌减少（减少240倍和4倍，P<0.0001），尽管早期IFN-β反应相对正常(). 因此，TRAF6对于早期干扰素-β基因应答似乎是不必要的，但对于扩增MEF中晚期干扰素α和β应答是必需的。我们的实验表明，TRAF3和TRAF6在激活WNV感染后MEF的I型干扰素反应方面具有独特的互补作用。
讨论
宿主对病毒感染的早期保护依赖于病原体的快速检测和I型干扰素反应的最佳激活。在这里，我们使用缺乏IRF-3和IRF-7表达的小鼠和原代细胞，证明这些转录激活物具有基本的非冗余功能：与缺乏IRF-2或IRF-7的小鼠相比，DKO小鼠表现出更快速的致死性，组织病毒负荷增加。与这种深刻的病毒学表型相关，DKO小鼠体内I型干扰素水平降低。然而，IRF-3和IRF-7的联合缺乏显示出异质性细胞IFN-β而非-α反应。虽然在所有测试的DKO细胞中IFN-α几乎被消除，但在DKO Mφ和mDC中IFN-β反应持续。病毒诱导干扰素β与干扰素α在DKO Mφ和mDC中的解偶联建立了该途径的细胞型特异性和IRF-3/IRF-7独立性。
IRF-3和IRF-7的联合缺失在很大程度上消除了原代成纤维细胞和皮层神经元中的IFN-α和β反应。该数据与之前的实验一致，该实验表明感染HSV-1、VSV或EMCV的DKO MEF中IFN-α和-β基因诱导缺失[14]相反，IRF-3和IRF-7的缺乏对Mφ和mDC的IFN-β反应的影响相对较小。因此，骨髓细胞中WNV感染后IFN-β的诱导依赖于IRF-3和IRF-7非依赖性转录信号。这一结果与数据一致，数据显示WNV感染后DKO小鼠血清中的I型干扰素水平显著降低，但未消除。类似地，最近的一项研究显示，在独立生成的DKO小鼠中，MCMV感染后血清中残留IFN-β活性[28]在血液中，浆细胞样DC（pDC）被认为是RNA病毒感染期间I型干扰素的主要产生者[53]，[54]; 在pDC中，干扰素是在TLR7识别核酸并通过MyD88向IRF-7发送信号后诱导的[14]，[55]由于pDC需要IRF-7来产生IFN，然而在WNV感染后，DKO小鼠仍会产生系统水平的IFN，因此非DC细胞群体必须参与这一反应。该结果与最近的数据一致，表明TLR7中系统性I型干扰素的产生没有改变−/−WNV感染小鼠[18].
目前最佳IFN-β基因转录的模型依赖于转录因子IRF-3、IRF-7、NF-κB和ATF-2/c-Jun对IFN-β启动子增强子的完全占据。协同转录因子结合可招募染色质重塑蛋白，如共激活剂GCN5和CBP/p300[23]，[24]我们的MEF缺乏IRF-3和IRF-7的数据表明，在有效调节干扰素-β反应中，需要所有单个增强子成分。与此一致，在表达IRF-3和IRF-7的MEF中，对其他增强体成分NF-κB和ATF-2/c-Jun的药物抑制也强烈降低了IFN-β基因转录的功效。令人惊讶的是，该模型并不适用于mDC，在mDC中，只有所有四种增强体成分的功能丧失才能显著降低IFN-β基因的激活。因此，在mDC中，病毒感染后IFN-β的表达可以在不被典型转录调控因子完全占据增强子体的情况下被强烈诱导。虽然我们还不完全了解增强子占据的细胞类型限制和IFN-β基因诱导的分子基础，但在髓系细胞中，其他转录调控因子可能可以替代典型复合物成员来激活IFN-β的基因转录。然而，已知的其他单个IRF家族成员（如IRF-1或IRF-8）在病毒感染或PRR参与某些系统后会诱导IFN-β反应[36]，[56]–[58]，在西尼罗河病毒感染的情况下没有主导调节作用。IRF-2和IRF-4的作用没有经过专门测试，因为这些因素被报告为I型干扰素应答的负调节因子[59]，[60]尽管如此，我们确实观察到在IRF-5中WNV感染后IFN-β反应出现了微小但短暂的减少−/−mDC，之前在单缺陷IRF-7中检测到IFN-β转录的类似小（约2倍）减少−/−毫伏直流电[22]相反，DKO-mDC没有显示出IFN-β反应的改变，这可能是因为这些细胞中的WNV感染水平较高。
IRF-5最初被表征为TLR-MyD88信号通路下游的转录因子，介导不包括I型IFN的促炎细胞因子（如IL-6和TNF-α）的诱导[41]最近的研究表明，用TLR4、TLR7或TLR9激动剂治疗后mDC中的I型IFN诱导部分依赖于IRF-5[61]，[62]IRF-5对某些病毒的免疫至关重要，如IRF-5−/−感染VSV、HSV和NDV后，小鼠的死亡率增加和/或减少了系统IFN的生成[38]，[42]一组最近发现了一种新的信号通路，涉及NOD2、RIP2和IRF-5调节IFN-α/β基因诱导，以响应结核分枝杆菌
[63]尽管IRF-5是如何调节IFN-β基因反应或与增强子组分相互作用的尚不清楚，但其表达可以解释为什么诱导IFN-β反应并不需要完全占据髓系细胞中的典型复合物成分。产生三重IRF-3、IRF-7和IRF-5敲除小鼠和细胞可能有助于解决这个问题。或者，在MEF和mDC中可能存在IFN-β基因组蛋白乙酰化的差异水平。mDC中IFN-β基因的染色质结构更“放松”，可能不需要所有染色质重塑蛋白的协同募集；因此，转录因子对增强子的充分占据可能不是该细胞型中IFN-β基因转录最佳激活的先决条件。
我们的结果还证实，几种细胞类型中的干扰素-β基因激活在很大程度上依赖于IPS-1，可能发生在RIG-I和MDA5识别WNV RNA的下游。该数据与MEF、腹膜渗出细胞和mDC中NDV、VSV、EMCV、流感和仙台病毒的研究一致[1]，[16]，[64]–[66]类似地，先前对两种相关黄病毒、日本脑炎和登革热病毒的研究表明，A549肺癌细胞中IFN-β基因的诱导是通过NF-κB和RIG-I/IRF-3依赖性途径实现的[67]我们的数据也与之前的研究一致，该研究观察到TLR3在WNV感染后mDC中调节IFN-α/β反应中没有作用[17]IPS-1相关性验证了RIG-I和/或MDA5在感知WNV中的主要作用。尽管RIG-I和MDA5共同促进了WNV感染后MEF中IFN和ISG的诱导[16]在mDC中，RIG-I识别途径似乎占主导地位([68]以及M.Suthar、S.Daffis、M.Diamond和M.Gale，未发表的结果）。
进一步分析MEF中IPS-1依赖的信号通路显示TRAF3和TRAF6在调节IFN-β反应中的不同作用。根据MEF缺乏的研究，TRAF3主要参与早期干扰素-β的生成，可能通过招募TBK1。与此相一致，其他人已经表明TBK1−/−感染仙台病毒的MEF IFN-β反应降低[69]这些结果也与我们在IRF-3中未发布的数据一致−/−MEF；IRF-3缺乏，主要由TRAF3激活[49]，导致干扰素-α/β反应减弱。与TRAF3相比，TRAF6在维持I型干扰素正反馈方面发挥着更大的作用。因此，在WNV感染后，I型IFN扩增环似乎由IFN-αβR受体下游的信号介导，这可能包括IRF-7和TRAF6的诱导和/或激活。因为TRAF3和TRAF6激活MEF中的IRF-3、NF-κB和p38[49]，[52]诱导I型干扰素晚期可能需要这些信号衔接分子激活增强子体的四个成分（IRF-3、IRF-7、NF-κB和ATF-2/c-Jun）。根据此处和其他地方提供的数据[16]我们提出了一个模型，用于WNV的宿主检测，通过IPS-1和关键适配器分子发出信号，以及在MEF感染后的早期和晚期IFN-α和β基因的转录激活().
MEF中WNV和IFN-α/β基因激活检测模型。(1). 宿主通过识别细胞质中尚未定义的病毒RNA PAMP来检测WNV。RIG-I在感染早期充当西尼罗河病毒的主要PRR传感器。RIG-I激活促进与IPS-1的结合，从而导致TRAF3和TBK1的募集以及IRF-3的磷酸化。NF-κB和ATF-2/c-Jun以及少量组成型表达的IRF-7也可能通过这种IPS-1依赖性途径被激活。IRF-3、IRF-7 NF-κB、ATF-2/c-Jun转位到细胞核，结合IFN-β基因启动子并促进转录。在早期阶段，感染细胞分泌IFN-β，通过结合IFN-αβR，导致自分泌和旁分泌I型IFN信号。IFN-αβR的激活导致JAK1和Tyk2的磷酸化，后者激活STAT1和STAT2，从而形成异三聚体ISGF3（STAT1、STAT2和IRF-9）。ISGF3的核转位和启动子结合上调数百种不同的ISG，包括IRF-7。(3). 在感染的后期，MEF中WNV的检测也依赖于MDA5和PKR。TRAF3和TRAF6的招募激活IRF-3和IRF-7。NF-κB和ATF-2/c-Jun也通过一种尚未明确的机制被激活。随后，IRF-3、IRF-7、NF-κB和ATF-2/c-Jun转位到细胞核，结合IFN-β基因启动子并诱导最佳转录。IFN-α基因的诱导通过TRAF6和IRF-7的转录激活发生。
总之，我们的研究表明，IRF-3和IRF-7在体内主要通过细胞类型依赖机制调节IPS-1依赖的I型干扰素反应，在保护WNV发病机制方面发挥着重要但不同的作用。这些研究阐明了干扰素诱导的细胞特异性复杂性，并增强了我们对病毒感染后快速激活有效先天反应的理解。深入了解最早针对西尼罗河病毒的保护性抗病毒免疫反应的分子机制，可能为针对许多相关和无关病毒病原体的治疗干预提供新的策略。
材料和方法
病毒
WNV株（3000.0259）于2000年在纽约分离[70]并在C6/36中通过一次白纹伊蚊生成股票的单元格（5×107PFU/ml），在所有实验中使用。基孔肯亚病毒（142株，希格斯链球菌礼物株，UTMB）和EMCV（K株）分别在C6/36和L929中繁殖。
小鼠实验和病毒负荷的定量
商用C57BL/6野生型小鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）。干扰素-αβ受体（IFN-αβR）−/−同类C57BL/6小鼠是J.Sprent（加利福尼亚州拉荷亚）的恩赐。同源回交IRF-3−/−
[37]，IRF-5−/−
[41]和IRF-7−/−
[14]老鼠是谷口氏T.Taniguchi（日本东京）的亲善礼物，由美国同事慷慨提供（马萨诸塞州波士顿I.Rifkin和马萨诸塞州立伍斯特K.Fitzgerald）。IRF-1−/−小鼠是商业化获得的（Jackson Laboratories）。IRF-8−/−mDC来自IRF-8的骨髓−/−老鼠[36]是P.Tailor和K.Ozato（医学博士Bethesda）的慷慨礼物。TRAF3−/−和TRAF6−/−MEF分别由G.Cheng（加州大学洛杉矶分校，加利福尼亚州洛杉矶）和T.Mak（加拿大多伦多大学）提供。TBK1 MEF来自B.TenOever（纽约西奈山医院）。IRF-3型−/−×IRF-7型−/−由于两个基因座的1cM连锁，DKO小鼠是在F1代中大规模杂交和重组后产生的。DKO小鼠在华盛顿大学医学院的动物设施中进行基因分型和繁殖，实验得到华盛顿大学动物研究委员会的批准。所有体内研究均使用8至12周龄年龄匹配的小鼠。102将WNV的PFU在补充有1%热灭活胎牛血清（FBS）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中稀释，并用50µl体积的脚垫注射接种。
组织病毒负荷和病毒血症
为了监测病毒在体内的传播，用10只小鼠感染2WNV的PFU通过脚垫接种并在接种后的特定时间点处死。在用PBS进行广泛的心脏灌注后，采集器官，称重，均质，并按照所述通过标准斑块分析滴定病毒[71]如前所述，通过使用荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析WNV RNA水平来测量病毒负荷[13].
干扰素活性的测量
（a） L929生物测定
使用EMCV L929细胞病变效应生物测定法测定血清中生物活性干扰素的水平[13].结果使用重组小鼠干扰素-α（PBL实验室）与标准曲线进行比较，并使用针对干扰素αβR的中和单克隆抗体（MAR-1）确认为干扰素特异性[72].
（b） 通过qRT-PCR检测IFN-α和βmRNA
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）在特定时间点从未感染或WNV感染的细胞中分离出总RNA。使用先前建立的引物集，通过qRT-PCR测定IFN-α和-βmRNA水平[21]为了分析干扰素-α和βmRNA的相对折叠诱导，使用Ct法平行测定18S rRNA的表达水平以进行归一化[73].
（c） IFN-α和βELISA
使用商业捕获ELISA试剂盒（PBL Laboratories）测量上清液、未感染或WNV感染细胞中分泌的IFN-α和β蛋白水平。
原代细胞培养与病毒感染
（a） 巨噬细胞和树突状细胞
骨髓源性Mφ和常规mDC如前所述生成[22]简而言之，从小鼠中分离骨髓细胞，并在存在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（PeproTech，Inc.）的情况下培养7天，以生成Mφ或白细胞介素-4（IL-4）和粒细胞巨噬细胞集落激励因子（GM-CSF）（PeproTech，Inc），以生成mDC。感染后，在感染多重性（MOI）为0.01（Mφ）或0.001（mDC）的情况下，进行多步病毒生长曲线。上清液通过BHK21-15细胞的菌斑试验进行滴定。在感染MOI为0.1时评估Mφ和mDC中IFN-α和-βmRNA水平的定量。
（b） 成纤维细胞
MEF由野生型和14天龄缺陷胚胎产生，并保存在补充10%FBS的DMEM中。所有实验在第2代和第4代之间使用细胞。在感染后分别以0.001和0.1的MOI进行多步病毒生长曲线和IFN-α和βELISA。
（c） 皮层神经元
如前所述，初级皮层神经元是从野生型和缺乏15天龄小鼠胚胎中制备的[13]然后用含有B27和L-谷氨酰胺（Invitrogen）的神经基底培养基培养皮层神经元四天。在感染后，分别以0.001和0.1的MOI进行多步病毒生长曲线和IFN-α和β蛋白定量。
Toll样受体刺激试验
用TLR3配体（50μg/ml poly（I∶C））或TLR4配体（2μg/ml LPS）刺激如上所述生成的mDC 24小时。如上所述，通过qRT-PCR测定IFN-αmRNA和IFN-β蛋白的水平。
蛋白质斑点
原代细胞（106)在RIPA缓冲液（10mM Tris，150mM NaCl，0.02%叠氮化钠，1%脱氧胆酸钠，1%Triton X-100，0.1%SDS，pH 7.4）中用蛋白酶抑制剂（Sigma）和1mM冈田酸（Sigma）裂解。样品（30µg）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解。转移后，用5%的无脂奶粉在4°C下隔夜封闭膜。用以下单克隆或多克隆抗体检测膜：抗WNV（疾病控制中心）、抗管蛋白、抗STAT1、抗PKR（圣克鲁斯生物技术）和抗鼠ISG54（俄亥俄州克利夫兰G.Sen赠送）。已描述了RIG-I、MDA5、IRF-3和IRF-7的特异性抗体[65]印迹用过氧化物酶结合二级抗体培养（Jackson Immunoresearch），并使用ECL-Plus免疫印迹试剂（Amersham Biosciences）进行可视化。
NF-κB和p38/ATF-2的药理抑制
为了评估NF-κB和/或p38/ATF-2在调节mDC中IFN-β基因表达中的作用5用WNV感染细胞，并用1%二甲基亚砜（稀释剂对照）、5µM或10µM的BAY 11-7082（钙生物化学）（NF-κB的特异性抑制剂）和/或5µM或15µM SB 202190（钙生物化）（p38/ATF-2的特异性抑制剂）处理24小时。如上所述，通过qRT-PCR测量IFN-βmRNA的水平。作为阳性对照，2×105mDC在没有或存在BAY 11-7082的情况下用2µg/ml LPS（List Biological Laboratories）处理24小时，并通过ELISA（R&D Systems）监测TNF-α的生成。根据制造商的说明（Promega），使用Celltiter-96®水溶液细胞增殖试验评估BAY 11-7082和SB 202190的细胞毒性。
统计分析
对于体外实验，使用非配对双尾T检验来确定具有统计意义的差异。对于病毒负荷分析，使用Mann-Whitney试验分析对数滴度的差异。采用对数秩检验分析Kaplan-Meier生存曲线。使用Prism软件（GraphPad软件）分析所有数据。
致谢
我们感谢M.Noll和K.O'Brien在生成DKO小鼠方面的技术帮助，以及M.Colonna对手稿的批判性审查。我们还感谢同事们的慷慨，为这些研究获得了缺陷小鼠（T.Taniguchi）和原代细胞（T.Mak、B.TenOever、G.Cheng和K.Ozato）。
脚注
提交人声明，不存在相互竞争的利益。
这项研究得到了NIH拨款AI057568、U54 AI081680、U19 AI083019和AI074973的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
工具书类
1Koyama S、Ishii KJ、Coban C、Akira S.对病毒感染的先天免疫反应。细胞因子。2008;43:336–341.[公共医学][谷歌学者] 2Stetson DB，Medzhitov R.抗病毒防御：干扰素及其他。《实验医学杂志》。2006;203:1837–1841. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Stetson DB，Medzhitov R.宿主防御中的I型干扰素。免疫。2006;25:373–381.[公共医学][谷歌学者] 4Kumagai Y、Takeuchi O、Akira S.先天受体对病原体的识别。感染化学家杂志。2008;14:86–92.[公共医学][谷歌学者] 5Takeuchi O，Akira S.通过先天免疫识别病毒。免疫学评论。2007;220:214–224.[公共医学][谷歌学者] 6Takeuchi O、Akira S.MDA5/RIG-I和病毒识别。Curr Opin免疫学。2008;20:17–22.[公共医学][谷歌学者] 7本田K、高冈A、谷口T。转录因子的干扰素调节因子家族对I型干扰素【校正】基因的诱导。免疫。2006;25:349–360.[公共医学][谷歌学者] 8Honda K、Yanai H、Takaoka A、Taniguchi T。I型干扰素诱导的调节：当前观点。国际免疫学。2005;17:1367–1378.[公共医学][谷歌学者] 9本田·K、谷口·T·IRFs：Toll样受体和细胞溶质模式再认知受体信号传递的主要调节器。国家免疫学评论。2006;6:644–658.[公共医学][谷歌学者] 10Lenschow DJ、Lai C、Frias-Staheli N、Giannakopoulos NV、Lutz A等。IFN刺激的基因15是对抗流感、疱疹和Sindbis病毒的关键抗病毒分子。美国国家科学院院刊。2007;104：1371–1376。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Degols G，Eldin P，Mechti N.ISG20，先天免疫反应的参与者。生物化学。2007;89：831–835。[公共医学][谷歌学者] 12Zhang Y、Burke CW、Ryman KD、Klimstra WB。抑制α病毒复制的干扰素诱导蛋白的鉴定和表征。《维罗尔杂志》。2007;81:11246–11255. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Samuel MA、Whitby K、Keller BC、Marri A、Barchet W等。PKR和RNase L通过控制病毒在外围的早期传播和神经元的复制，有助于防止致命的西尼罗河病毒感染。《维罗尔杂志》。2006;80:7009–7019. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Honda K、Yanai H、Negishi H、Asagiri M、Sato M等。IRF-7是I型干扰素依赖性免疫反应的主要调节器。自然。2005;434:772–777.[公共医学][谷歌学者] 15Fredericksen BL，Gale M.，Jr西尼罗河病毒通过RIG-I依赖和独立的途径逃避干扰素调节因子3的激活，而不会对抗宿主防御信号。《维罗尔杂志》。2006;80:2913–2923. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Fredericksen BL、Keller BC、Fornek J、Katze MG、Gale M.、Jr对西尼罗河病毒天然抗病毒反应的建立和维持涉及通过IPS-1的RIG-I和MDA5信号。《维罗尔杂志》。2008;82:609–616. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Daffis S、Samuel MA、Suthar MS、Gale M，Jr、Diamond MS。Toll样受体3对西尼罗河病毒感染具有保护作用。《维罗尔杂志》。2008;82:10349–10358. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Town T，Bai F，Wang T，Kaplan AT，Qian F，等。Toll样受体7通过白细胞介素23依赖性免疫细胞浸润和归巢缓解致命的西尼罗河脑炎。免疫。2009;30:242–253. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Wang JP，Liu P，Latz E，Golenbock DT，Finberg RW等。黄病毒对浆细胞样树突状细胞的激活描绘了TLR7信号传导的关键元件，超越了内体识别。免疫学杂志。2006;177:7114–7121.[公共医学][谷歌学者] 20Querec T、Bennouna S、Alkan S、Laouar Y、Gorden K等。黄热病疫苗YF-17D通过TLR2、7、8和9激活多个树突状细胞亚群以刺激多价免疫。《实验医学杂志》。2006;203:413–424. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Daffis S、Samuel MA、Suthar MS、Keller BC、Gale M，Jr等。干扰素调节因子IRF-7诱导抗病毒α-干扰素反应，并防止致命的西尼罗河病毒感染。《维罗尔杂志》。2008;82:8465–8475. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Panne D.增强子。当前操作结构生物。2008;18:236–242.[公共医学][谷歌学者] 24Panne D，Maniatis T，Harrison SC。干扰素-β增强子的原子模型。单元格。2007;129:1111–1123. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Thanos D，Maniatis T.病毒诱导人干扰素β基因表达需要组装增强子。单元格。1995;83:1091–1100.[公共医学][谷歌学者] 26Samuel MA，Diamond MS。α/β干扰素通过限制细胞向性和提高神经元存活率来防止致命的西尼罗河病毒感染。《维罗尔杂志》。2005;79:13350–13361. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Bourne N、Scholle F、Silva MC、Rossi SL、Dewsbury N等。西尼罗河病毒感染期间I型干扰素的早期产生：淋巴组织在IRF3非依赖性干扰素产生中的作用。《维罗尔杂志》。2007;81:9100–9108. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Steinberg C、Eisenacher K、Gross O、Reindl W、Schmitz F等。IFN调节因子7依赖性I型IFN反应对于小鼠巨细胞病毒感染的早期抵抗不是必需的。欧洲免疫学杂志。2009;39：1007–1018。[公共医学][谷歌学者] 29Marie I，Durbin JE，Levy DE。通过干扰素调节因子-7的正反馈对不同干扰素-α基因的差异性病毒诱导。Embo J。1998;17:6660–6669. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Sato M、Hata N、Asagari M、Nakaya T、Taniguchi T等。干扰素诱导转录因子IRF-7对I型干扰素基因的正反馈调节。FEBS信函。1998;441:106–110.[公共医学][谷歌学者] 31Samuel MA，Diamond MS。西尼罗河病毒感染的发病机制：毒力、先天免疫和适应性免疫以及病毒逃避之间的平衡。《维罗尔杂志》。2006;80:9349–9360. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Davis LE、DeBiasi R、Goade DE、Haaland KY、Harrington JA等。西尼罗河病毒神经侵袭性疾病。Ann Neurol公司。2006;60:286–300.[公共医学][谷歌学者] 33Martina BE、Koraka P、van den Doel P、Rimmelzwaan GF、Haagmans BL等。DC-SIGN在体外增强糖基化西尼罗河病毒对细胞的感染，并且病毒在人类树突状细胞中的复制诱导产生IFN-α和TNF-α。病毒研究。2008;135:64–71.[公共医学][谷歌学者] 34Hildner K、Edelson BT、Purtha WE、Diamond M、Matsushita H等。Batf3缺乏揭示了CD8alpha+树突状细胞在细胞毒性T细胞免疫中的关键作用。科学。2008;322:1097–1100. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Schmitz F、Heit A、Guggemoos S、Krug A、Mages J等。干扰素调节因子1控制髓样树突状细胞中Toll样受体9介导的干扰素β的产生。欧洲免疫学杂志。2007;37:315–327.[公共医学][谷歌学者] 36Tailor P、Tamura T、Kong HJ、Kubota T、Kuboto M等。树突状细胞中I型干扰素诱导的反馈期需要干扰素调节因子8。免疫。2007;27:228–239. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Sato M、Suemori H、Hata N、Asagiri M、Ogasawara K等。转录因子IRF-3和IRF-7在IFN-α/β基因诱导病毒反应中的独特和重要作用。免疫。2000;13:539–548.[公共医学][谷歌学者] 38Paun A、Reinert JT、Jiang Z、Medin C、Balkhi MY等。小鼠干扰素调节因子5（IRF-5）的功能特征及其在先天性抗病毒反应中的作用。生物化学杂志。2008;283:14295–14308. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Schoenemeyer A、Barnes BJ、Mancl ME、Latz E、Goutagny N等。干扰素调节因子IRF5是toll-like receptor 7信号传导的中心调节剂。生物化学杂志。2005;280:17005–17012.[公共医学][谷歌学者] 40Barnes BJ、Moore PA、Pitha PM。新型干扰素调节因子IRF-5的病毒特异性激活导致不同干扰素α基因的诱导。生物化学杂志。2001;276:23382–23390.[公共医学][谷歌学者] 41Takaoka A、Yanai H、Kondo S、Duncan G、Negishi H等。IRF-5在Toll样受体激活的基因诱导程序中的整体作用。自然。2005;434:243–249.[公共医学][谷歌学者] 42Yanai H，Chen HM，Inuzuka T，Kondo S，Mak TW，等。干扰素调节因子5转录因子在抗病毒免疫和肿瘤抑制中的作用。美国国家科学院院刊。2007;104:3402–3407. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Kamthong PJ，Wu M.cAMP诱导的核因子-kappaB抑制剂拮抗白细胞介素-1诱导的人类巨噬细胞集落刺激因子表达。生物化学杂志。2001;356:525–530. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Lappas M、Yee K、Permezel M、Rice GE。柳氮磺胺吡啶和BAY 11-7082干扰核因子-κB和IκB激酶途径，以调节体外人体脂肪组织和骨骼肌中促炎细胞因子的释放。内分泌学。2005;146:1491–1497.[公共医学][谷歌学者] 45阿什维尔JD。免疫系统中p38丝裂原活化蛋白激酶激活的多种途径。国家免疫学评论。2006;6:532–540.[公共医学][谷歌学者] 46Kaisho T、Takeuchi O、Kawai T、Hoshino K、Akira S.内毒素诱导MyD88缺陷树突状细胞成熟。免疫学杂志。2001;166：5688–5694。[公共医学][谷歌学者] 47Liu H，Sidiropoulos P，Song G，Pagliari LJ，Birrer MJ，等。巨噬细胞中TNF-α基因表达：NF-κB的调节独立于c-Jun或c/EBPβ。免疫学杂志。2000;164:4277–4285.[公共医学][谷歌学者] 48Saha SK，Pietras EM，He JQ，Kang JR，Liu SY，等。TRAF3与Cardif之间的直接和特异性相互作用对抗病毒反应的调节。Embo J。2006;25:3257–3263. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Oganesyan G，Saha SK，Guo B，He JQ，Shahangian A等。TRAF3在Toll样受体依赖和独立抗病毒反应中的关键作用。自然。2006;439:208–211.[公共医学][谷歌学者] 50Xu Y，Cheng G，Baltimore D。TRAF3的靶向破坏导致出生后死亡和T依赖性免疫反应缺陷。免疫。1996;5:407–415.[公共医学][谷歌学者] 51Bonnard M、Mirtsos C、Suzuki S、Graham K、Huang J等。T2K缺乏导致肝细胞凋亡变性和NF-kappaB依赖性基因转录受损。Embo J。2000;19:4976–4985. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Yoshida R、Takaesu G、Yoshida-H、Okamoto F、Yoshoka T等。TRAF6和MEKK1在RIG-I类解旋酶抗病毒途径中发挥关键作用。生物化学杂志。2008;283:36211–36220. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53Asselin-模式C，Trinchieri G.I型干扰素的生产：浆细胞样树突状细胞及其以外。《实验医学杂志》。2005;202:461–465. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 54刘勇军。IPC：专业的1型干扰素产生细胞和浆细胞样树突状细胞前体。免疫学年度回顾。2005;23:275–306.[公共医学][谷歌学者] 55Diebold SS、Kaisho T、Hemmi H、Akira S、Reis e Sousa C.通过TLR7介导的单链RNA识别产生抗病毒反应。科学。2004;303:1529–1531.[公共医学][谷歌学者] 56Matsuyama T、Kimura T、Kitagawa M、Pfeffer K、Kawakami T等。IRF-1或IRF-2的靶向破坏导致I型IFN基因诱导异常和淋巴细胞异常发育。单元格。1993;75:83–97.[公共医学][谷歌学者] 57Ruffner H，Reis LF，Naf D，Weissmann C.在缺乏干扰素调节因子1的胚胎干细胞中诱导I型干扰素基因和干扰素诱导基因。美国国家科学院院刊。1993;90:11503–11507. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 58Tailor P、Tamura T、Ozato K.IRF家族蛋白和树突状细胞中的I型干扰素诱导。细胞研究。2006;16:134–140.[公共医学][谷歌学者] 59Honda K，Mizutani T，Taniguchi T。干扰素调节因子2对干扰素-α/β信号转导的负调控，用于树突状细胞的稳态发育。美国国家科学院院刊。2004;101:2416–2421. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 60根岸H、大叶Y、亚奈H、高冈A、本田K等。IRF-4对Toll样受体信号的负调控。美国国家科学院院刊。2005;102:15989–15994. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 61Richez C、Yasuda K、Watkins AA、Akira S、Lafyatis R等。在IFN-β启动后，TLR4配体诱导小鼠常规树突状细胞和人单核细胞产生IFN-α。免疫学杂志。2009;182:820–828. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 62Yasuda K、Richez C、Maciaszek JW、Agrawal N、Akira S等。人IgG-RNA免疫复合物诱导的小鼠树突状细胞I型IFN产生是IFN调节因子（IRF）5和IRF7依赖性的，是IL-6产生所必需的。免疫学杂志。2007;178:6876–6885.[公共医学][谷歌学者] 64Kumar H、Kawai T、Kato H、Sato S、Takahashi K等。IPS-1在对抗RNA病毒的先天免疫反应中的重要作用。《实验医学杂志》。2006;203:1795–1803. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 65Loo YM、Fornek J、Crochet N、Bajwa G、Perwitasari O等。先天免疫中RNA病毒的独特RIG-I和MDA5信号传导。《维罗尔杂志》。2008;82:335–345. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 66Koyama S、Ishii KJ、Kumar H、Tanimoto T、Coban C等。TLR-和RLR信号在对甲型流感病毒感染和疫苗接种的免疫反应中的差异作用。免疫学杂志。2007;179:4711–4720.[公共医学][谷歌学者] 67常泰，廖CL，林YL。黄病毒通过涉及RIG-I依赖性IRF-3和PI3K依赖性NF-kappaB激活的途径诱导干扰素-β基因表达。微生物感染。2006;8:157–171.[公共医学][谷歌学者] 68Gitlin L、Barchet W、Gilfillan S、Cella M、Beutler B等。mda-5在I型干扰素对多核糖核酸钠：多核糖胞苷酸和脑心肌炎小RNA病毒反应中的重要作用。美国国家科学院院刊。2006;103:8459–8464. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 69Perry AK，Chow EK，Goodnough JB，Yeh WC，Cheng G.I型干扰素对类toll受体活化和病毒感染反应中对TANK-binding激酶-1的差异需求。《实验医学杂志》。2004;199:1651–1658. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 70Ebel GD、Dupuis AP、2nd、Ngo K、Nicholas D、Kauffman E等。西尼罗河病毒株的部分基因特征，纽约州，2000年。突发传染病。2001;7:650–653. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 71Diamond MS、Shrestha B、Marri A、Mahan D、Engle M.B细胞和抗体在西尼罗河脑炎病毒播散性感染的即时防御中发挥关键作用。《维罗尔杂志》。2003;77:2578–2586. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 72Sheehan KC、Lai KS、Dunn GP、Bruce AT、Diamond MS等。阻断体内流体动力学转染免疫小鼠的小鼠IFN-α/β受体亚单位1（IFNAR-1）特异性单克隆抗体。干扰素细胞因子研究杂志。2006;26:804–819.[公共医学][谷歌学者] 73Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2（−Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25：402–408。[公共医学][谷歌学者] 
