Joubert综合征基因座1(接线盒TS1，MIM%213300）被映射到9号染色体的远端q臂，位于D9S1826-D9S1838之间三在两个与视网膜病变有不同关联的JS酋长国家族中，以及一个已证实的“臼齿”症状（MTI-007和MTI-008以前分别称为a和C家族，,补充表1)三为了完善候选间隔，我们又招募了两名未受影响的MTI-007和两名受影响的MTI-008家族成员，并进行了5K SNP分析，证实了接线盒TS1在MTI-007中(补充图1). MTI-008系列在接线盒TS1在其他几个振幅相似的峰值中，LOD最大得分约为+1.94。因此，这些SNP扫描未能显著缩小候选间隔(补充表2).
基因编码酶域的错义突变INPP5E公司，（肌醇多磷酸盐-5-磷酸酶E）与接线盒TS1轨迹。（a）上图：脑轴位核磁共振成像显示臼齿征（红色圆圈），来自四个不同的来源国，分别来自每个相关家族。底部：正中矢状位MRI显示水平方向的小脑上脚（红色箭头），在对照组中不明显。每个家族中受影响者的序列色谱图，显示核苷酸变化（红色箭头），相应的氨基酸替换如下所示。MTI-007和MTI-134家族在接线盒TS1和COR-10和COR-21一样，它们有共同的突变。MTI-007和MTI-134具有双R512W的复合纯合突变；R515瓦。（b）用颜色表示INPP5E的预测蛋白质结构域。每个识别出的错义突变（箭头）都发生在催化域内的一个基本残基中，并改变电荷。（c）变异氨基酸的进化保护。
对另外25个患有JS的近亲家族进行了分析，其中三个家族（酋长国、土耳其和埃及后裔的MTI-134、MTI-610和MTI-627）显示至少有一个峰值与接线盒TS1两个意大利家族（COR-10和COR-21）也与接线盒TS1
4单倍型分析表明，MTI-007和MTI-134与COR-10和COR-21（数据未显示）具有相同的亲缘关系。这些分析共同确定了远端9q34.2-tel中3.5 MB的候选间隔，包含大约86个注释候选基因(补充表3)其中57个进行了序列变化筛选，而其余29个要么缺乏开放阅读框架，要么由于缺乏发育表达而被排除在外。这一广泛筛选确定了INPP5E公司每个基因中突变的基因接线盒TS1-有联系的家庭().
这个INPP5E公司突变之所以显著，有两个原因。首先，所有确定的突变都是聚集在酶活性磷酸酶域内的氨基酸颠倒(). 其次，每一个都改变了高度碱性进化保守氨基酸残基的电荷()这表明这些突变可能会改变酶的活性。来自健康人种匹配个体的188条控制染色体中均未发生上述突变，且每个家族中均与疾病分离。我们利用已发表的突触贾宁晶体结构来模拟这些突变5是唯一一种结构数据可用的肌醇5-磷酸酶。我们发现，每一个改变的残基（除了一个例外，R563）都会将其带电荷的尾巴投射到PtdIns底物的假定结合囊中(补充图2)表明这些突变可能改变底物特异性。
为了测试INPP5E突变对PtdIns磷酸酶活性的影响，我们用免疫沉淀法标记野生型和酶阴性（D477N6)连同与哺乳动物细胞分离的每个突变（导致相似的蛋白质水平，补充图3)然后分析对PtdIns（3,4,5）P3和PtdIns（4,5(). 我们发现接线盒TS1错义突变严重破坏了PtdIns（3,4,5）P3的磷酸酶活性(,第页每个突变体的活性<0.05，N=3个独立实验）。值得注意的是，由于在单个单倍型上观察到R512W/R515W变体，我们推断可能只有一个导致酶活性缺陷，并且在单独的分析中，R515W突变被证明是酶活性缺陷的主要原因（数据未显示）。使用PtdIns（4,5）P2作为底物与磷酸酶活性进行比较，结果显示类似，尽管与野生型相比，结果没有严重受损()表明PtdIns（3,4,5）P3可能是接线盒TS1因为先前研究表明INPP5E的过度表达可以阻止Akt磷酸化，以响应培养细胞中PDGF的刺激（可能是通过消耗PtdIns（3,4,5）P3和PtdIn（4,57接下来，我们在这项已发表的分析中测试了每个患者突变过度表达的影响。患者突变不仅不能阻断Akt信号传导，而且pAkt的基础水平升高在非刺激细胞中也很明显(补充图4). 我们的结论是接线盒TS1-相关的错义突变损害了磷酸酶对假定PtdIns底物的活性，这可能改变下游信号事件。
5磷酸酶活性受损和PtdIns（4,5）P2与PtdIn（4）P比值改变与JBTS1输入5E突变。（a）PtdIns代谢概述。P=磷酸盐。INPP5E函数中的一个块预计会增加PtdIns（4,5）P2:PtdIn（4）P比率。（b-c）与PtdIns（4,5）P2底物相比，突变INPP5E对PtdIns（3,4,5。请注意，对于某些突变（突变体R435Q、R512W/R515W和K580E严重缺陷，而R378C和R563H仅略有减少），大部分活性都能抵抗PtdIns（4,5）2。与每个患者的突变相比，D477N是已知的磷酸酯酶。（每个样品N=3）（d）与对照成纤维细胞相比，患者原代成纤维细胞系MTI-610-V-2和V-1中PtdIns（4，5）P2与PtdIns（4）P的比率升高。*代表第页<0.05 ANOVA双向校正多重比较。
接下来，我们测试了缺乏内源性催化INPP5E活性是否会导致细胞内PtdIns谱的改变。虽然很难测量细胞中PtdIns组分的绝对水平，但该模型预测，由于该酶步骤中的阻滞，PtdIns（4,5）P2/PtdIns（4）P的比率增加()因此，对MTI-610患者1和2（兄弟姐妹）的皮肤成纤维细胞进行了PtdIns（4,5）P2/PtdIns（4）P比率评估。在对照组未刺激生长抑制的成纤维细胞中，我们发现PtdIns（4,5）P2/PtdIns（4）P的比率约为0.63，而在两个患者成纤维细胞样品中，该比率增加了约20%(第页=0.05、N=3个独立实验，). 我们发现INPP5E在该患者或其他患者成纤维细胞样本中的表达水平与INPP5E公司突变(补充图5). 我们得出结论，INPP5E的催化活性是维持细胞内PtdIns稳态比率所必需的。
为了研究与纤毛病变的可能联系，我们检测了INPP5E在纤毛清晰的细胞中的定位。RPE-hTERT线（永生化视网膜色素上皮）在80%以上的生长抑制细胞中显示初级纤毛8,9与中心粒周围基质标记物-中心粒蛋白联合免疫染色显示INPP5E紧邻纤毛基底(). 用乙酰化微管蛋白（睫状轴丝的标记物）和ARL13B（纤毛标记物）联合免疫抑制INPP5E证实了这一点10-12显示INPP5E与睫状体轴丝紧密共定位，只有极小的INPP5E定位于非睫状体部位(). 在允许睫状体的条件下，将野生型GFP标记的INPP5E转染IMCD-3细胞显示睫状体定位(补充图6)我们没有发现任何接线盒TS1-当在这些细胞中表达时，相关的患者错义突变（数据未显示）。相比之下，处于有丝分裂期（纤毛抽出后）的细胞显示出细胞质定位(补充图7). 数据表明，INPP5E在受试细胞系的间期主要定位于初级纤毛。
INPP5E的睫状体轴突定位和睫状体不稳定性增强INPP5E公司突变细胞系。（a）RPE-hTERT纤毛细胞INPP5E和纤毛标记物染色。INPP5E（红色，箭头）定位于近心点阳性（绿色，箭头）近心点基质附近。（b）INPP5E（红色，箭头所示）与睫状轴索乙酰化微管蛋白（绿色）的染色。（c-f）在GFP-CETN2转基因小鼠（绿色的一对中心粒，箭头）中显示INPP5E（红色）染色。（c）P10肾集合小管显示INPP5E阳性红色纤毛投射到肾小管管腔中（内破折号），小管界限由外破折号表示。（d）P5小脑内颗粒层，中心粒附近有INPP5E（红色，箭头所示）睫状轴丝。（e）P10视网膜，GFP-CETN2标记基底体和连接纤毛（CC，绿色，箭头）。INPP5E专门标记感光细胞（红色，箭头）(（f）)（e）的高倍视图，显示内节（IS）INPP5E染色（红色，箭头），紧邻基底体和CC（箭头）及其上方。蓝色=赫斯特。比例尺5 um（a-b，d），25 um（c），50 um（e），10 um（f）。
我们对GFP-Centrin2转基因小鼠JS中受影响的器官进行INPP5E染色（标记纤毛基底）13并确定了纤毛在每个组织中的定位。在肾集合管中，纤毛从上皮突出到管腔中。在这只小鼠中，许多细胞被一对中心粒的管腔定位所标记，从这个位置，大多数细胞都有一个INPP5E阳性纤毛投射到管腔中(). 在发育中的小脑中，在小脑内颗粒层的成神经细胞群中发现了纤毛14我们根据中心粒处的GFP信号鉴定了这些纤毛细胞，并鉴定了绝大多数这些细胞中投射到薄壁组织中的INPP5E阳性纤毛()在肝胆管中观察到类似的睫状体定位（未显示）。我们还观察到INPP5E定位于视网膜感光细胞中靠近基底体和连接纤毛的区域(). 因此，INPP5E主要位于JS患者各主要器官纤毛附近或纤毛内。
为了评估INPP5E在初级纤毛的潜在功能，我们使用了来自患者MTI-610-V-1的初级成纤维细胞。与对照组相比，这些细胞显示出基本正常的生长特征以及纤毛细胞的百分比（81%对76%，p>0.05，)，表明INPP5E公司纤毛发生或纤毛维持不需要酶活性，至少在成纤维细胞中不需要。然而，纤毛不是一个固定的结构，不适用于PDGF等血清衍生因子的应用15由于血清是培养细胞中PtdIns途径的有效激活剂，我们预测改变的PtdIn谱可能会使突变细胞中的纤毛更不易应用血清。我们将血清用于对照细胞和MTI-610-V-1细胞，并根据乙酰化微管蛋白和ARL13B染色在特定时间间隔对保留纤毛的细胞百分比进行评分。血清应用后4小时，野生型细胞的纤毛脱落率为8%，而INPP5E公司突变细胞的纤毛脱落率为33%（73%对43%，第页<0.01，N=3个独立实验）。在8小时和24小时的时间点，两种基因型中可见纤毛的细胞百分比约为40%，这表明INPP5E公司在对血清的早期反应中控制纤毛拆卸的时间。
（a）突变患者原代成纤维细胞纤毛的易感性INPP5E公司在血清刺激之前，缺乏血清的对照组和患者成纤维细胞显示出相当比例的纤毛细胞。血清刺激后4小时，患者成纤维细胞中的纤毛细胞降至43%，而对照组为73%（*=第页<0.01，N=3，每种情况下细胞总数>250）。刺激后8小时或24小时，纤毛细胞在患者和对照样品之间再次具有可比性。（b-e）对照组与突变患者原代成纤维细胞的扫描电镜照片inp5e基因在血清刺激之前，睫状体轴突长度是可比较的，尽管患者样本中稍短。刺激后4小时，患者样本中的轴突长度变短。比例尺以um表示。
为了确定纤毛突变体细胞数量减少是否是由于在缺乏功能性INPP5E的情况下纤毛提取速度加快所致，我们进行了扫描电子显微镜检查。在添加血清之前，我们发现对照组的初级纤毛长度与MTI-610-V-1缺乏血清的成纤维细胞大致相同，长度约为3 um(). 然而，在4小时的时间点（我们看到纤毛数量的最大差异），MTI-610成纤维细胞的纤毛长度约为对照组的一半。这些数据在x-y轴来自具有剩余可见纤毛的细胞的切片，如在添加血清之前、然后在4小时和8小时对ARL13B的免疫染色所证明的。我们发现，在血清刺激后4小时，突变体与对照组的平均纤毛长度显著下降（2.73 vs.1.28 um，野生型vs.MTI-610，第页<0.01，每种情况下n>30个细胞），而血清前或8小时后无明显差异(补充图8). 因此，与野生型相比，在缺乏完整INPP5E活性的情况下，睫状体解体更快。
在确定其他患者的成纤维细胞样本后INPP5E公司突变，我们注意到培养中细胞增殖率发生了一些变化，从而测试了静止细胞重新进入细胞周期的能力。虽然MTI-610成纤维细胞在细胞周期重入中没有明显变化（基于Ki67染色或BrdU掺入），但MTI-134和MTI-627在添加血清后表现出有丝分裂活性细胞的百分比降低(补充图9). 由于MTI-134和MTI-627在在体外检测（0%和8.5%vs.15%，见)数据表明，这种基于血清的细胞周期再进入可能需要INPP5E的剩余但不是全部功能。MTI-610成纤维细胞表现出正常的有丝分裂活性细胞百分比，然而，与对照成纤维细胞相比，这些有丝分裂同步细胞重新进入细胞周期的比例更高（18-24小时内Ki67染色），并且在细胞周期中进展更快（BduU掺入从24小时减少到30小时），提示INPP5E酶活性也可能影响细胞周期进展速度。然而，在这些患者样本中，并非所有基于血清的反应都是异常的。例如，低剂量血清依赖性划痕试验的愈合没有改变(补充图10)，我们设计为依赖迁移，但在很大程度上不依赖增殖16我们得出结论，INPP5E可能发挥特定的血清依赖性细胞作用，介导睫状体稳定性和细胞周期动力学。
我们的数据表明INPP5E公司导致JS，首次证明了PtdIns信号与纤毛病变之间的联系。重要的是要确定JS中观察到的发育缺陷是由于纤毛维持缺陷还是由于更广泛定义的PtdIns信号中断所致。自从PDGFα受体定位于初级纤毛17由于PDGF是一种关键的血清衍生因子，在细胞周期重新进入的同时，调节纤毛脱落18PDGF和其他利用纤毛作为信号中心的因子可能具有下游通路，这些通路通过INPP5E的特定定位和功能进行调节。
先前的研究暗示了PtdIns信号与纤毛之间可能存在联系。Tubby突变小鼠具有纤毛样表型，突变基因编码的蛋白质与包括PtdIns3,4,5（P3）在内的特异性PtdIns结合19此外，Bardet-Biedl综合征与JS具有相似的纤毛病变特征，并且BBS5蛋白可以结合PtdIn9然而，据我们所知，我们的发现是第一个直接暗示PtdIns类中有缺陷的酶转化。事实上，INPP5E在睫状体轴丝内表现出富集，这使得我们很容易推测PtdIns信号不仅可以调节纤毛的稳定性，而且这种信号也可能发生在内部纤毛。另一种模型是INPP5E可能被隔离在纤毛内，但在细胞质内发挥其活性，类似于提出的声波刺猬信号传递模型20在这一过程中，关键调节酶的鉴定突出了具有临床相关性的重要研究领域。
方法
患者和家属
根据以下标准，本研究纳入了来自中东、土耳其和欧洲的27个近亲家庭：1）至少有一个人的神经影像学证实的“臼齿征”与任何JS或相关疾病表型相关；2） 与JBTS1型位点；3） 排除与任何其他已知JBTS位点的连锁(JBTS2-9型). 如前所述，只要可能，患者都会接受完整的诊断方案21在临床评估期间，使用标准序列协议完成了脑部MRI分析。所有家庭都获得了父母的书面知情同意书，该研究得到了加州大学圣地亚哥分校（拉荷亚）和CSS-Mendel研究所（罗马）HRPP委员会的批准。
全基因组筛选和精细绘图接线盒TS1基因座
使用Illumina linkage IVb映射面板对所有信息丰富的家族进行5K全基因组连锁扫描22，并使用easyLINKAGE-Plus软件进行分析23它在PC Windows界面中运行Allegro 1.2c版，以计算多点LOD分数。参数设置为全外显率常染色体隐性遗传，疾病等位基因频率为0.001。使用Affymetrix 250K Nsp1 SNP阵列对选定的个体进行精细定位，并使用无家系的逐代同一性定位对结果进行分析。短串联重复序列多态性标记接线盒TS1该基因座与之前发表的相同4.
突变筛选
如前所述，利用单链构象多态性分析和直接测序相结合筛选突变24,25.
生物信息学
蛋白质进化保护是通过从人类基因组浏览器中比对氨基酸来确定的(http://www.genome.ucsc.edu). 使用网络工具搜索纤毛蛋白质组26,27使用Swiss-Model预测了蛋白折叠和分子间相互作用，该模型具有与Ca（2+）和PtdIns（1,4）P2结合的突触janin的结晶PtdIns 5-磷酸酶结构域5通过导入野生型和突变型的氨基酸序列，并比较PtdIns可能的对接位点，使用PyMOL软件操纵得到的INPP5E结构。
生化分析
INPP5E cDNA7在含有EGFP的框架中克隆到pcDNA3.0中进行表达。患者突变被单独设计成INPP5E公司使用T-Rex四环素调节系统（Invitogen）稳定转染293T细胞的Myc-tagged载体中的cDNA7，使用Myc标签进行免疫沉淀，经Western证实，每个表达量相当(补充图3)，然后用于所述的改良PtdIns（4,5）P2水解分析28将纯化底物添加到37°C下的免疫沉淀物中10分钟，然后再添加孔雀石绿10分钟，以测定PtdIns（3,4,5）P3水解29在650 nm处测量释放的无机磷酸盐，与标准曲线进行比较，并一式三份。对患者原代细胞中的PtdIns（4,5）P2/PtdIns（4）P比率进行评估，并按所述进行代谢标记30用50ng/ml PDGF刺激稳定转染的293T细胞，并分析Akt信号传导，如所述7.
组织学
用亲和纯化肽特异性INPP5E兔抗血清对野生型或GFP-CETN2小鼠的小鼠组织进行免疫染色，该抗血清与人和小鼠反应31在1:200，在DeltaVision成像系统上通过5-10个反褶积周期采集图像。
成纤维细胞测定
在无血清的情况下，患者和未受影响的年龄匹配对照组的原代皮肤成纤维细胞以类似的汇合点生长3天。如前所述评估纤毛拆卸和伤口愈合18,32.如前所述，对牢房循环重返进行了审问33将20%的血清添加到亚汇合成纤维细胞中。应用BrdU（10 uM）1小时，并用Ki67（1:1000）和BrdU的抗体（1:1500）检测抗原（Abcam#ab66155和ab6326）。
扫描电子显微镜
成纤维细胞在2.5%戊二醛/0.1M二羧酸缓冲液（CB）（pH 7.4）中25℃下固定30分钟，漂洗（0.1M CB），4C下后固定（1%OsO4/0.1M CB，蒸发过夜，然后用钯溅射涂层样品，并在XL30 ESEM-FEG上成像。
Cilia长度量化
纤毛长度与x-y-z轴与。x-y轴使用Volocity渲染软件。使用DeltaVision成像系统进行纤毛的三维重建，100倍物镜，0.1微米z（z）-无论方位角如何，允许进行长度评估的台阶。在相同的细胞中也使用x-y轴只比较了五个细胞的投影和测量值。在纤毛长度测量中没有发现明显的差异，因此从x-y轴预测。
