利用核糖体轮廓技术进行核苷酸拆分的体内翻译全基因组分析

摘要

监测细胞产生的蛋白质的特性和数量的能力将为生物学的几乎所有方面提供信息。基于微阵列的mRNA丰度测量革新了基因表达研究(1)。然而，由于几个原因，迫切需要直接监测蛋白质合成的技术。首先，mRNA水平并不完全代表蛋白质的产生，因为mRNA翻译受到广泛的调控(2-4)。其次，由于诸如内部核糖体进入位点、非AUG密码子的启动以及无意义读入等影响，无法从转录序列预测准确的蛋白质产物(5，6)。最后，蛋白质合成过程中的程序化核糖体暂停被认为有助于某些蛋白质的共翻译折叠和分泌(7-9).

从翻译核糖体中回收mRNA用于随后的微阵列分析的多聚体图谱可以提供对蛋白质合成的有用估计(10)。然而，这种方法的分辨率和准确性有限。此外，上游开放阅读框（uORF）-许多基因的5′非翻译区（5′UTR）中发现的短翻译序列-导致与mRNA结合但不翻译编码基因的核糖体(11)。定量蛋白质组学的进展绕过了其中一些问题(2，三)但目前，它们独立测定蛋白质序列和测量低丰度蛋白质的能力受到很大限制。

利用核糖体保护其mRNA模板上的离散足迹[～30个核苷酸（nt）]免受核酸酶消化的事实，可以精确地确定翻译核糖体的位置(12)。我们推断，深测序技术的进步使人们能够并行读取数以千万计的短（～35碱基对）DNA序列(13)，将允许对细胞的核糖体足迹进行全面分析。在这里，我们提出了一种基于核糖体保护片段的深度测序的核糖体增殖策略，并提供了具有亚密码子精度的体内翻译的全面高精度测量。

通过深度测序量化RNA

为了建立核糖体谱作为监测翻译的定量工具，我们需要执行三个步骤：（i）稳健地生成核糖体保护的mRNA片段（“足迹”），其序列指示活性核糖体的位置；（ii）将这些RNA印迹转化为DNA分子库，其形式适合于以最小失真进行深度测序；以及（iii）通过深度测序来测量该文库中不同足迹的丰度。我们首先确定，通过深度排序实验计算序列的读取次数，可以定量测量复杂库中序列的丰度(图S1) (14)。然后我们优化了核酸酶条件，以从体内翻译核糖体中获得核糖体足迹(图S2、A和B)。最后，我们测试了从随机片段酵母mRNA库中制备测序文库的各种策略，推断相同mRNA的不同片段的丰度应该是可比较的。使用此基准，我们优化了一项战略，如图1A，避免了以前将小RNA转化为DNA的方法中通常使用的RNA连接酶(15)因为它们在RNA物种的分布中造成了巨大的扭曲（图。第3章和S4系列) (16).

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图1

通过深度测序量化mRNA丰度和核糖体足迹。(A类)将核糖体足迹或随机片段mRNA转换为深测序文库的协议示意图。(B类)mRNA丰度测量的内部再现性。CDS按照图示进行概念划分，并绘制两个区域的mRNA计数。误差估计基于χ²统计的。

我们对从片段总mRNA生成的DNA文库进行了深度测序，以测量不同转录物的丰度(表S1)，聚焦于5295个相对无重复序列和重叠转录特征的基因(14)。我们在概念上将每个编码序列（CDS）划分为两个长度相等的区域。因此，与这两个区域对齐的读取数代表了在片段化之前对全长mRNA丰度的独立测量。这两个计数之间的误差仅略高于抽样统计规定的理论最小值(图1B)，证明了我们的库生成策略的准确性和顺序独立性。mRNA密度测量值具有高度重复性[相关系数(R（右）²) = 0.98; 生物复制之间的SD对数比对应1.2倍的变化](图S5)。我们的测量结果也与之前基于微阵列的mRNA丰度测量结果一致(R（右）²= 0.66) (图S6) (17，18)。我们定量信使核糖核酸水平的策略的一个特别优势是，它保留了链信息，并通过将信息片段化为小而均匀的大小，最大限度地减少了由RNA二级结构引起的扭曲，从而能够准确定量转录物的特定亚区（例如，单个外显子）。

用单密码子解析和深度测序监测核糖体位置

我们测序了4200万个片段，这些片段是通过对芽殖酵母进行核糖体保护试验产生的酿酒酵母(14)。700万（16%）的测序读数与CDS对齐，而其余大部分来自核糖体RNA（rRNA）(表S1)。由于大多数污染rRNA来自少数特定位点，因此在测序之前应通过消减杂交直接去除它们。

沿着给定的信息，我们发现足迹片段的5′端的位置突然从起始密码子上游12到13 nt开始，从终止密码子上游18 nt结束，并显示出很强的3-nt周期性(图2，A和B)。因此，核糖体足迹的覆盖定义了被翻译的序列。核糖体位置的高精度使我们能够监控正在翻译的阅读框。例如，75%的28-nt低聚物核糖体保护片段起始于密码子的第一个核苷酸(图2C)。虽然每个单独的足迹都提供了核糖体位置的不完善的统计证据，但平均多个密码子可以明确地确定阅读框架。这将有助于对程序性移码和终止密码子的通读进行全基因组研究(5).

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图2

核糖体足迹提供密码子特异性的翻译测量。(A类)接近CDS开始或结束时的核糖体足迹总数。(B类)在翻译起始和终止时，足迹的开始与P位和A位密码子之间的偏移(34)。(C类)28-nt核糖体足迹相对于阅读框的位置。(D类)两个完整生物复制品的核糖体足迹密度。针对总读取数和CDS长度校正了以每千基百万次读取数（rpkM）表示的密度(21)。低计数统计误差基因重复之间log2比率的直方图(图S7)以及正态误差曲线（平均值=0.084，SD=0.291，单位为log2；σ是SD，表示为折叠变化）。(E类)翻译效率直方图，核糖体足迹密度与mRNA密度之比。误差显示了生物复制之间的实际比率（SD=0.367，单位为log2）。(F类)读取密度作为位置的函数。将每个表达良好的基因分别归一化，然后以相等的权重求平均值(14).

翻译的全基因组测量

接下来，我们试图使用核糖体分析数据量化蛋白质合成速率。我们根据核糖体足迹密度估计蛋白质表达(14)，尽管进一步的改进可以包括消息翻译速度的变化（见下文）。从700万个足迹序列中，我们能够精确测量5295个基因中4648个的翻译(图S7)和重复性与我们的mRNA丰度测量值相当(R（右）²= 0.98; ∼生物复制之间的误差为20%）(图2D).

将翻译速率与同一样本中的mRNA丰度进行比较，结果显示，除了一部分翻译不活跃的转录子外，不同酵母基因之间的翻译效率大约是100倍（通过核糖体足迹与mRNA片段的比率进行测量）(图2E和图S8A)。因此，mRNA丰度测量无法发现的翻译效率差异对基因表达的动态范围起着重要作用(表S2).

预计蛋白质合成速率比mRNA水平的测量更好地预测蛋白质丰度。事实上，通过蛋白质质谱对蛋白质绝对丰度的估计具有以下相关系数R（右）²=0.42，我们的翻译率测量值与R（右）²=0.17，我们的mRNA丰度(图S9) (19)。蛋白质稳定性的差异导致蛋白质合成速率与其稳态水平之间的不完美相关性。因此，通过核糖体谱测定的合成变化与质谱测定的丰度之间的比较，应能揭示蛋白质受调控降解的例子(19).

核糖体分析揭示了翻译的不同阶段

先前的多糖体研究发现，较短的基因往往具有较高的核糖体密度(10)。我们看到了一个类似但较弱的趋势，以及核糖体分析和多糖体分析之间的总体一致性（图。S8B型和第10节)。这一现象令人惊讶，因为它表明翻译起始率对基因的总长度很敏感，因此可以更好地翻译较短的信息。或者，在每个基因开始的恒定长度区域中可能存在较高的核糖体密度，这将在较短基因的总核糖体占有率中占较大比例。然而，之前的一项研究没有发现六个mRNA的5′端核糖体密度较高的证据(20).

我们对核糖体占有率的全基因组位置特异性测量使我们能够更广泛地测试这种可能性。平均数百个翻译良好的基因显示，前30到40个密码子的核糖体密度要高得多（大约三倍）(图2F)在100到200个密码子之后，它会松弛到一个均匀的密度，一直持续到翻译终止(图S11A)。基因开始时核糖体的过剩解释了较短基因上核糖体密度较高的原因，并不是用放线菌酮处理固定核糖体或基因5′端的停滞核糖体造成的伪影(图S12)。5′核糖体密度升高似乎是翻译的一般特征，与CDS的长度、翻译水平和N端信号序列的存在无关(图S11，B至D)。对这种影响的蛋白质合成速率估计值进行修正，大大改善了与蛋白质丰度的相关性(R（右）²=0.60与R（右）²= 0.42) (图S13)。这表明，转录物中核糖体密度的降低是由于翻译延伸率增加和/或翻译提前终止所致。

核糖体位置的密码子特异性测量

核糖体分析报告核糖体的精确位置，从而可以描述转录本的哪些部分正在被解码。我们数据集中几乎所有（98.8%）的核糖体足迹都映射到蛋白质编码区。尽管如此，这留下了56105个无法解释的脚印，这可能代表了真正的翻译事件，因为它们与80个铜净化了S公司核糖体。此外，它们在5′UTR中更常见(图3A)然而，我们预计RNA虚假捕获产生的背景在转录本中均匀分布。特别是内含子和3′UTR，其核糖体密度通常低于CDS中核糖体浓度的1%(图S14)，大多数人没有发现足迹。无片段内含子的缺失表明从mRNA测序实验中检测到的内含子区域(21)翻译活动很少；因此，核糖体分析可以简化剪接基因表达的分析。

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图3

上游开放阅读框和其他序列的核糖体占有率。(A类)相对于相关CDS，非蛋白编码序列上mRNA片段和核糖体足迹的密度。(B类)不同类别序列的翻译效率直方图。(C类)核糖体和mRNA密度显示uORFICY1系列5英尺UTR。(D类)核糖体和mRNA密度显示非AUG uORFPRE2前5英尺UTR。拟议的AAAUUG翻译起始位点与随后的开放阅读框和终止密码子一起显示（用垂直线表示）。

相比之下，约四分之一的5′UTR显示出实质性翻译活性，在许多情况下与CDS相当(图3B)。5′UTR翻译的一个来源是uORF的存在，uORF是CDS上游的短翻译阅读框，可以在翻译调节中发挥重要作用(11)。基于上游AUG密码子的存在，我们在酵母基因组中鉴定了1048个候选uORF(表S3) (22，23)。我们关注最丰富的信息中的86个上游AUG密码子(14)我们可以可靠地量化即使是低水平的翻译。在这一组中，只有20个uORF翻译得很好，一个突出的例子是ICY1系列(图3C和表S4)。更广泛地说，在所有注释的5′UTR中，我们发现了153个uORF的翻译证据(表S5)，其中不到30个之前已经过实验评估。

尽管如此，这些uORF仅占我们在5′UTR中发现大量翻译的706个基因中的一小部分。一些基因，例如PRE2前和5菲律宾第纳尔，具有由终止密码子终止的核糖体密度离散区域，但缺少AUG密码子(图3D和图S15)。在这两种情况下，可以通过UUG密码子的起始来解释翻译区域。有两个已知的例子，在酵母中翻译起始于非AUG密码子tRNA合成酶GRS1级(24)和ALA1公司(25)，这两者在我们的数据中都很明显(图S16)。非AUG密码子的启动强烈依赖于周围的序列上下文(26)与酵母中的典型起始形成对照(27)和中的非AUG启动站点PRE2前和5菲律宾第纳尔两者都符合实验验证的强起爆序列(26).

在这一发现的基础上，我们寻找了其他候选的非AUG起始位点，其中与AUG有单一错配的密码子具有有利的起始背景(14)。如图所示，大多数启动站点都会导致uORF变短PRE2前和5菲律宾第纳尔尽管有证据表明，包括细胞周期蛋白在内的一些基因中存在N末端延伸CLB1级(图S17)。总的来说，这1615个预测的uORF的翻译效率比5′UTR的其他区域大得多（约为三倍），尤其是当起始密码子在第一个位置与AUG不同时（约为六倍；见下文）。我们发现28-核苷酸低聚物足迹与这些非AUG起始位点下游的预测阅读框相一致，这与我们在蛋白编码基因中看到的效果类似(图S18).

此外，当伸长率不受抑制时，5′UTR的核糖体足迹与蛋白质编码基因开始时一样耗尽，表明它们是能够进行径流伸长率的活性核糖体(图S19)。总的来说，我们发现了143个有翻译证据的非AUG uORF(表S6)占5′UTR核糖体足迹的20%。因此，在特定的、有利的、非AUG站点存在普遍的启动。

饥饿的转化反应

高精度评估翻译速率和mRNA丰度的能力使翻译调控的定量测量成为可能。酵母中的急性氨基酸饥饿会产生大量的转录和翻译变化(28)包括翻译起始的全球减少(29)。我们对酵母进行20分钟的氨基酸剥夺，并进行核糖体指纹和mRNA丰度测量(图S20)。然后，我们比较了3769个基因的饥饿和对数期生长测量值，这些基因的统计计数误差并没有影响我们检测翻译调控的能力(图4A和图S7)。三分之一的基因在饥饿时表现出相对翻译效率的变化(图S21)，有291个受强烈影响（超过两倍）的基因(图4B和表S7)。111个下调基因中的43个(P（P）<10^-40)参与核糖体生物生成(图4A和表S8)这一过程在许多不同层面上受到抑制，以应对饥饿等压力(30，31).

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图4

对饥饿的转化反应。(A类)饥饿对mRNA丰度和翻译效率的影响。(B类)翻译效率的分布随着饥饿而变化。测量误差是根据生物复制品之间比率的实际分布估算的。10%的错误发现率阈值对应于翻译效率的两倍变化。

与多聚体相关的每个基因的mRNA部分以前曾被用于提供翻译效率的半定量测量(32)。许多核糖体生物发生转录物在饥饿时离开多聚体部分，这与我们的观察结果一致，并且多聚体关联的变化与核糖体图谱测量的翻译变化显著相关（上调的基因，P（P）<10^-12和下调基因，P（P）<10^-6) (图S22)。核糖体分析也使我们能够检测到七倍的翻译诱导GCN4号机组，一个经过深入研究和翻译调控的基因(29)其对饥饿的反应未被早期的多聚体研究发现(32).

关于GCN4号机组5′UTR中四个uORF的翻译结果(29)]. 在对数增长期间，我们看到GCN4号机组uORF 1，以及uORF 2到4的一些翻译，但很少翻译主要的GCN4号机组客户尽职调查(图5A)。核糖体占据的这种模式与GCN4号机组5′UTR功能，其中uORF1是组成性翻译的，但允许下游重新启动。在对数期生长中，再活化发生在uORF 2至4处，而不是发生在GCN4号机组自身。然而，在饥饿时，再活化绕过uORFs2至4并到达主CDS，从而缓解GCN4号机组事实上，我们看到抑制性uORF的核糖体占有率下降，以及饥饿时蛋白质编码区的翻译增加。出乎意料的是，我们还观察到特征uORF上游5′UTR的额外翻译。即使在对数生长期，也可以检测到该区域的翻译，并且在饥饿状态下其翻译大大增强(图5B)。该地区的大多数翻译都是从非标准AAA开始的AUA公司尽管也有来自上游帧内非标准UUU的启动UUG公司现场。uORF 1需要重叠该区域的序列进行适当的翻译调控(33)支持这些非AUG uORF发挥功能作用的想法。

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图5

饥饿期间5′UTR翻译的变化。(A类)抑制和诱导条件下GCN4 5′UTR的核糖体和mRNA密度。指出了四个已知的uORF以及上游翻译的拟定起始位点。(B类)非AUGuORF上游GCN4号机组所示为（A）中灰色方框区域的放大图。(C类)非编码序列的核糖体占有率。映射到不同区域类别的核糖体足迹数量与CDS读取数量相关。(D类)uORF的总平移效率(14).

更广泛地说，在饥饿期间，我们发现来自5′UTR的核糖体足迹的比例大幅增加（六倍），但内含子几乎没有变化(图5C)。尽管总密度仍然很低，但3′UTR核糖体占有率的增加也不太明显。非AUG uORF在饥饿期间表现出核糖体占有率的显著增加，显然不仅超过了标准AUG uorF的翻译，也超过了CDS本身的翻译(图5D)。基因上游的非AUG uORF，如GLN1型和预9在对数生长期边缘转化的核糖体在饥饿后具有更高的核糖体密度（图。S23型和S24型)。然而，即使在GLN1型很明显，单个uORF不能解释核糖体在5′UTR上的全部分布。相反，起始密码子选择的严格程度发生了更普遍的变化，有利于某些非经典起始位点，但也有更广泛的影响(图S25)。启动因子eIF2α，其磷酸化介导饥饿对翻译的影响(29)在引发子密码子选择中也有显著作用(34)因此可能有助于放松。

观点

核糖体分析大大提高了我们定量监测蛋白质生产的能力，我们对蛋白质丰度的预测大大提高了这一点。这项技术应该成为研究细胞内部状态的核心工具。这一基本策略很容易适应包括哺乳动物在内的其他生物，并且可以通过使用表位标记核糖体的限制性表达来实现组织特异性翻译图谱(35)。核糖体分析的直接应用包括研究基因表达的翻译控制和疾病状态（如癌症）的分子特征，其中相关的细胞应激可能会直接影响翻译(36)。此外，准确确定信息解码区域的能力将大大有助于实验确定复杂生物体（如人类）的完整蛋白质组。

我们的方法还允许深入分析体内翻译过程。例如，核糖体分析揭示了翻译的意外复杂性，导致CDS长度上的核糖体密度差异。这大概反映了核糖体功能状态的差异，这些差异会影响核糖体的延伸率或加工率。从早期延伸阶段到晚期延伸阶段的转换始于核糖体中初生肽的首次出现，允许初生链和分子伴侣之间的相互作用(37)。饥饿对翻译活性的影响的测量也揭示了非AUG密码子的广泛且受调控的启动，这表明了研究充分的eIF2α介导的应激反应的一种新作用。最后，高分辨率基因特异性核糖体密度谱将有助于探索翻译速率的变化以及核糖体暂停、调节蛋白质合成和折叠等效应。

补充材料

致谢

参考文献和注释