衰老对CMV血清阳性健康献血者CMV特异性CD8 T细胞的影响

摘要

背景

免疫功能正常者中的人巨细胞病毒（CMV）感染通常无症状，但可能是免疫抑制者发病的主要原因。初次感染后，病毒以潜伏形式存在于各种组织中，尤其是单核细胞系的前体细胞中[1]. 针对被膜蛋白pp65的细胞毒性CD8 T淋巴细胞在很大程度上确保了宿主对CMV感染的防御[2]. 在免疫抑制的人，有时是免疫能力正常的人中，CMV可以被重新激活，在这些情况下，CMV特异性CD8 T细胞的存在并不产生IFNγ，因此潜在的无反应性或体内衰竭是常见的[三].

衰老与免疫系统的变化和T淋巴细胞亚群的实质性改变有关。CMV感染可显著调节健康献血者的外周淋巴池[4,5]. 巨细胞病毒还影响T细胞的功能，巨细胞病毒特异性T细胞的分化和大规模扩增与对其他免疫挑战的反应受损有关[6]. 此外，CMV特异性T细胞的克隆扩增可能会减少其他抗原的可用储备，并导致老年人感染性疾病的发病率增加[7-10]. 在老年人中，CMV磷酸蛋白pp65（UL83）是T淋巴细胞识别的主要抗原，靶向功能有效的T细胞效应器反应，大量产生Th1细胞因子并显示CD107a脱颗粒标记物[11]. 这些细胞的百分比显著增加，绝大多数是CD28^-[12,13]. 此外，CD8 T细胞亚群显示CD45RA显著增加⁺CD27型^-亚型，可能是急性CMV感染的结果[14].

记忆T细胞池是一个动态储存库，储存着在个体一生中积累的抗原经历过的T淋巴细胞。根据CCR7、CD45RA和细胞溶解效应分子的表达，定义了人CD8 T细胞的几个亚群[15-17]. CCR7的表达将人类记忆T细胞分为两个功能不同的亚群，具有不同的归巢能力和效应器功能[15,16]：表达CCR7的细胞被称为中央记忆（CM），而效应记忆（EM）细胞的特征是缺乏CCR7。虽然CM CD8 T细胞是表型均一的，但在CCR7中定义了不同的EM亚群^无效的根据不同标记物的表达（包括CD45RA的表达水平或共同刺激分子CD27和CD28的表达）进行分类[18-20].

体外衰老模型和横截面体外研究一致表明，衰老的T细胞和老年人的T细胞表达异常高密度的受体，这些受体通常存在于自然杀伤细胞上[21,22]. 在CD8 T细胞上，NK相关受体的表达随年龄增加而增加，而CCR7的表达则减少[23]. CD85j（也称为LIR-1/ILT2/LILRB1）是一种抑制性细胞表面受体，在NK细胞、B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和T细胞亚群上表达。CD85j识别多种经典和非经典MHC I类分子，CD85j触发抑制T细胞功能[24,25]. 相反，CD85j与人巨细胞病毒编码的MHC I类同源物UL18的相互作用导致T细胞的活化，导致CMV感染的细胞裂解[26,27]. CD85j的表达与CD8 T细胞分化为效应细胞有关，并且在慢性感染的病毒特异性CD8 T淋巴细胞上增加[25]. CD244（2B4）是Ig超家族的一种跨膜受体，主要由NK细胞和抗原相关的CD8 T细胞亚群表达[28,29]. 对CD8 T细胞和NK细胞的最佳激活是必需的[30]通过与CD48在某些靶细胞上的相互作用在激活细胞毒性中发挥重要作用[28,29,31].

在本研究中，我们分析了衰老对由CCR7和CD45RA表达定义的总CD8 T细胞亚群和CMV特异性CD8 T淋巴细胞亚群频率的影响。使用这些标记，我们定义了天真（CCR7⁺CD45RA^明亮的)，厘米（立方厘米7⁺CD45RA^空值)和三个EM CD8 T细胞亚群，特征是缺乏CCR7，并根据CD45RA的表达水平定义为EMRA^无效的，埃姆拉^昏暗的和EMRA^明亮的（图​（图1）。1). 还研究了CD27、CD28和NK细胞相关标记物CD85j和CD244在这些亚群上的表达。

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图1

根据CCR7和CD45RA表达的CD8 T细胞亚群分布五个CD8 T细胞亚群的示意图（左）和代表性实验（右），可通过分析CCR7和CD45RA标记来定义。

结果

与中青年人相比，健康老年人CMV pp65特异性CD8 T细胞的频率增加

使用A2/CMV-pp65五聚体对HLA-A2、CMV血清阳性供体中CMV pp65特异性CD8 T细胞的频率进行分析，如图所示​图2。2与年轻人相比，老年人的五聚体阳性CD8 T细胞增加(第页=0.03）和中年(第页=0.027）捐赠者。比较年轻和中年捐赠者的值时，没有观察到显著差异。

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图2

老年人CMVpp65特异性CD8 T细胞的频率增加分析年轻、中年和老年供体中A2/CMVpp65五聚体阳性CD8 T细胞的频率。数据以方框图的形式呈现；方框的下边界表示第25个百分点，上边界表示第75个百分点。方框上方和下方的误差条表示第90个和第10个百分位。方框内的一条线表示中间值。异常值表示为单个点。P值低于0.05被认为具有统计学意义。

效应记忆CMVpp65特异性CD8 T细胞的年龄相关扩增

幼稚、CM和EM三个亚群的年龄相关变化（EMRA^无效的，埃姆拉^昏暗的和EMRA^明亮的)在五聚体阳性和五聚体阴性CD8中，T细胞如图所示​图3。三结果表明，与年轻献血者相比，老年人中初生A2/CMV-pp65五聚体阳性CD8 T细胞的比例显著降低(第页=0.007）（图​（图3A）。3A级). 在CM五聚体阳性CD8 T细胞上未发现明显变化（图​（图3C）。3C公司). 当对五聚体阴性CD8 T细胞进行分析时，年龄相关的原始细胞比例下降（老年人与年轻的第页<0.001和老年人与中年人第页=0.003）和CM（老年人与年轻的第页=0.002），（图​（图3B第3页和​和3D）三维)证实了这些CD8 T细胞亚群的比例随着年龄的增长而降低。

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图3

年龄对CD8 T细胞亚群分布的影响根据图1所示的子集模型，CD8 T细胞被细分为naive、CM、EMRA^明亮的，埃姆拉^昏暗的，埃姆拉^无效的并对青年、中年和老年人的细胞进行了分析。显示CMV五聚体阳性（左）和五聚体阴性（右）CD8 T细胞的结果。数据显示为方框图，如图2图例所示。

与EM亚群相关，结果显示，在五聚体阳性和五聚体阴性CD8 T细胞中，EMRA百分比随年龄增长而增加^昏暗的单元格（图​（图3G第三代移动通信和​和3H），3小时)，而在EMRA中没有发现显著差异^明亮的（图​（图3E第三方和​和3F）第三层)或在EMRA中^无效的（图​（图3I第三章和​和3J）3J型)子集。在比较各年龄组五聚体阳性和五聚体阴性CD8 T细胞时，未发现幼稚/记忆CD8 T淋巴细胞亚群的分布存在显著差异。

老年人EM CD8 T细胞亚群CD27和CD28表达降低

为了进一步描述CCR7中与年龄相关的变化^无效的分析EM T细胞亚群、CD27和CD28的表达。结果表明，EMRA^无效的亚群CD27和CD28标记的表达高于EMRA^昏暗的和EMRA^明亮的青年、中年和老年供体组的亚群。此外，在所考虑的三个EM亚群中，与年轻人相比，中老年人组CD27的表达降低（图​（图4A）。第4页). EMRA中CD28的表达也出现了类似的年龄相关性下降^昏暗的和EMRA^明亮的而在EMRA中CD28的表达没有发现明显的年龄相关性差异^无效的子集（图​（图4B4B类).

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图4

效应记忆CD8 T细胞亚群CD27和CD28的表达.EM CD8 T细胞定义为CCR7^无效的根据图1中的模型进一步细分为亚组，并对年轻人、中年人和老年人进行了分析。列和条表示平均值和SD。

大多数来自老年人的A2/CMV-pp65五聚体阳性CD8 T细胞是CD27和CD28阴性细胞，表达CD85j和CD244

对CMV pp65特异性CD8 T细胞中CD27和CD28表达的分析表明，老年人CD27的比例增加^-CD28编号^-与年轻人相比的细胞(第页<0.001）和中年人(第页<0.001）捐赠者（图​（图5A）。5A级). 尽管CD27随年龄增长而增加^-CD28编号^-A2/CMV-pp65五聚体阴性CD8 T细胞中也发现了细胞，未发现显著的统计差异（图​（图5B第5页).

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图5

大多数来自老年人的A2/CMV-pp65五聚体阳性CD8 T细胞显示CD27^-CD28编号^-表型和表达CD85j和CD244CD27的百分比^-CD28编号^-（A） ，CD85j⁺（B） 和CD244⁺（C） 在年轻、中年和老年供体的CMV五聚体阳性（左）和五聚体阴性（右）CD8 T细胞门控的PBMC上分析CD8 T淋巴细胞。数据显示为方框图，如图2图例所示。

为了进一步表征CMV pp65特异性CD8 T细胞的表型，我们分析了CD85j的表达，CD85j是人类CMV MHCⅠ类同源物UL18的受体。我们的结果显示，与年轻和中年供体相比，老年人A2/CMV-pp65五聚体阳性和五聚体阴性CD8 T细胞中CD85j的表达增加（图​（图5C5摄氏度和​和5D）。第五天). 五聚体阴性CD8 T细胞中CD244的表达随年龄增加而增加。当老年捐赠者与年轻捐赠者进行比较时，观察到统计学上的显著差异(第页=0.044）和中年(第页=0.042）个个体，而当考虑CMV pp65特异性T细胞时，CD244的表达没有发现统计上的显著差异（图​（图5E第五版和​和5F）。5英尺). 来自年轻人、中年人和老年人的五聚体阳性和阴性CD8 T细胞中CD85j和CD244表达的代表性流式细胞术分析如图所示​图66.

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图6

CD8 T细胞CD85j和CD244表达分析点图显示了五聚体阳性和五聚体阴性CD8 T细胞是如何被选中的。直方图显示了CD85j和CD244在代表性青年、中年和老年人的A2/CMVpp65五聚体阳性（深灰色）和五聚体阴性（浅灰色）CD8 T细胞中的表达。空直方图表示每个实验的阴性同型对照。

讨论

在这项工作中，研究了老化对CMV特异性CD8 T细胞亚群的频率和表型的影响。越来越多的证据支持，老年人T细胞室中观察到的许多改变可能是潜伏病毒（如CMV）慢性激活免疫系统的结果[9,10,13,32-40]. 因此，老年人CD8 T细胞室的重塑以原始细胞减少和具有记忆/激活表型的细胞数量增加为特征[13,41-48]，可能不仅是胸腺退化（与年龄相关的变化）的结果，也可能是最近表明的CMV慢性抗原刺激的结果[4,5,10,13,49].

与年轻和中年人相比，老年人中CMV特异性CD8 T细胞的频率增加。我们对年龄对CMV-特异性CD8 T细胞表型影响的分析结果表明，与年轻人相比，老年人具有原始表型的A2/CMVpp65五聚体阳性CD8 T淋巴细胞减少，而具有EM表型的CD8细胞增加[10,13]. EM亚群的增加主要是由于显示EMRA的A2/CMVpp65五聚体阳性CD8 T细胞的扩增^昏暗的表型，而EMRA的百分比值^明亮的和EMRA^无效的年轻、中年和老年供体的CD8 T细胞相似。

CD8 T细胞室整体上显示原始细胞和CM细胞的频率降低，EMRA增加^昏暗的CD8 T细胞亚群。这些结果证实了先前的研究表明，随着年龄的增长，EM CD8 T细胞的原始比例和扩增率显著下降[10,48,50]. 原始CD8 T细胞（定义为CCR7+CD45RA+CD28+CD27+）的百分比下降和EM CD8 T淋巴细胞的扩增，显示出广泛的表型[19]，已在多项研究中用作免疫衰老的生物标志物[38,40,48]. 最近的一项研究分析了CMV血清阴性和血清阳性个体CD8细胞的年龄相关性变化，有力地支持了CMV是CD45RA+EM CD8细胞生成的主要刺激因素[4]. 然而，我们的结果显示，A2/CMV-pp65特异性和非特异性CD8 T细胞之间的原始/不同记忆T细胞没有显著差异，这表明这不是以前在北欧人群和CMV阴性老年献血者中所证明的唯一慢性刺激[4,5,7,51,52].

CD28的表达^-表型是复制衰老的特征[53,54]. 慢性抗原刺激与CD28的外周血扩张有关^-CD8 T细胞的特征还包括CD27的丢失和NK细胞相关标记物CD57的表达[22,28,55-57]. 我们观察到CMV特异性CD8 T细胞增加，显示CD27^-CD28编号^-老年人的表型表明，T细胞对慢性抗原刺激的克隆性扩增导致衰老T细胞的积累。在五聚体阴性的CD8 T细胞中，在CD27和CD28的表达中观察到类似的趋势，尽管在年轻人、中年人和老年人之间没有观察到显著差异。

CD85j是一种抑制性细胞表面受体，与人类巨细胞病毒编码的MHC I类同源物UL18具有高亲和力。尽管CD85j具有明确的抑制功能，但它与UL18的相互作用导致T细胞活化，导致CMV感染细胞溶解[26,27]. CD85j的表达与CD8 T细胞分化为效应细胞有关[25]. 据报道，CD8 T细胞上CD85j的年龄相关增加与CD28下调和CD57上调相关[23,58,59]. 这里我们显示，老年人在CMV特异性和五聚体阴性CD8 T细胞中CD85j的表达增加。因此，其表达可作为APCs向CD8 T细胞表达CMV pp65表位的指标。此外，CD85j的表达可以作为复制性衰老的标志物[23,59]与CD27并行^-CD28编号^-表型或CD57表达。CD85j型⁺CD27型^-CD28编号^-老年人CMV pp65特异性CD8 T细胞较中青年人增多，表明CMV特异性CD8T细胞经历了广泛的CMV抗原驱动刺激，达到复制性衰老。CD244的表达，一种T细胞分化为效应细胞的标志物[60,61]在CMV特异性CD8 T细胞中发现，与整个CD8 T淋巴细胞相比升高。

在年轻和中年供体中可以发现CMV特异性CD8 T细胞和CCR7和CD45RA定义的T细胞亚群的相似频率。中年人群的高变异性可能与CMV感染的时间点或每个人对病毒的不同免疫反应有关。了解这个年龄组中这些个体的进化应该很有趣。可以推测，年轻和中年供体CMV特异性CD8 T细胞的慢性激活可能对该人群的年龄相关疾病产生不利影响。

结论

已经证明，在许多受试者中可以检测到自然发生的CD4和CD8 T细胞对pp65的反应[62]. CMV特异性CD8 T细胞的表型特征有助于过继疗法和疫苗接种方案的发展。研究发现，老年人中CMV特异性CD8 T细胞表型与CD8 T淋巴细胞的主要表型总体相似，提示CMV潜伏感染可能是导致CD8 T分化为CD27的主要因素^-CD28编号^-细胞。这些数据证实，CMV等持续性病毒终身感染诱导的慢性抗原刺激可能会导致CD8 T细胞室发生重要变化。

捐赠者、材料和方法

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

MLP帮助设计了该研究，进行了流式细胞术研究，并帮助起草了手稿，为其博士论文中的工作做出了贡献。IG进行并分析了一些流式细胞术。ODR参与了流式细胞术数据的研究和分析的设计。肌电图进行统计分析。CA为捐赠者的选择和讨论做出了贡献。RT&JGC参与结果讨论和手稿撰写。RS构思了这项研究，参与了其设计和协调，并起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

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