前列腺癌细胞主要锌摄取蛋白hZip1的转录调控

2.2启动子区域的计算机分析

使用ElDorado和Gene2Promoter在线程序进行启动子预测和基因分析(网址：www.genomatix.de). 使用AliBaba 2.0、TFSearch、Match对潜在转录因子结合位点进行分析(www.gene-regulation.com)和MatInspector(网址：www.genomatix.de)在线节目。

2.3用5′RACE定位hZip1转录起始位点

根据制造商的说明，使用GeneRacer试剂盒（Invitrogen，Carlsbad CA）进行映射。cDNA是使用SuperScript III逆转录酶和寡核苷酸（dT₁₆)底漆。逆转录产物用GeneRacer 5′Nested引物和hZip1特异性逆转录引物5′-CTCCTTGAAGCCAGTGTATCT扩增，然后在Fox Chase癌症中心自动DNA测序设备中测序。

2.4报告向量设计

用正向5′-ATCTTTGGGTACCTGTGTTTTTCCTTGTGTTTCCGTTGGGTG和反向5′-ACTTGCTCGAGGGTGAGTGTGGTGTGGCGCTCC引物扩增PC-3细胞基因组DNA，并将840bp PCR产物克隆到pGL3-碱性荧光素酶报告载体的Kpn1/Xho1限制位点（Promega，Madison WI）。该片段用于后续生成5′-和3′-缺失的结构体，以及生成hZip1启动子和定点突变（引物列于补充，表1A).

使用跨越靶结合位点的改良反向引物通过PCR突变hZip1核心启动子内的转录因子结合位点(补充，表1B). 随后将产物与3′-侧翼区域连接，重新扩增并克隆。我们生成的所有报告人pGL3载体已在Fox Chase癌症中心自动DNA测序设施中使用GL2引物（威斯康星州麦迪逊市Promega）进行测序。

2.5瞬时转染和荧光素酶报告子分析

6×10⁴将PC-3细胞置于24孔板中，并在如上所述的完全培养基中孵育24小时。然后用0.5μg pGL3报告载体和各种hZip1启动子插入物、pGL3-basic载体或pGL3-promoter载体转染细胞。在每个孔中额外转染0.01μg phRL-TK质粒，以使转染效率正常化。根据制造商说明，使用TransIT前列腺转染试剂盒（Mirus，Madison WI）进行转染。使用DualGlo荧光素酶分析系统（Promega，Madison WI）在转染24小时后的细胞裂解液中测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性。所有实验重复三次，并使用Renilla荧光素酶活性对结果进行标准化。

2.6 SP1和CREB1 mRNA的敲除

根据制造商说明，使用DharmaFECT-1（Dharmacon，Lafayette，CO）转染试剂，在6孔板中对PC-3细胞进行250 pmol（每孔）靶向人类SP1（sc-29487）和/或CREB1（sc-2-9281）mRNA的siRNA双链体转染。使用不与RISC复合物结合的siRNA双链体（siControl RISC游离siRNA Dharmacon，Lafayette，CO）作为siRNA转染的阴性对照。转染48小时后收集细胞进行蛋白质和RNA提取。

2.7蛋白质印迹分析

在含有66mM Tris-HCl pH-7.6和2%十二烷基硫酸钠的裂解缓冲液中煮沸制备全细胞裂解物。蛋白质浓度通过Bradford分析测定（BioRad，Hercules CA）。然后，如前所述，使用特异性抗SP1（E-3）或抗CREB1（C-21）抗体（加州圣克鲁斯生物技术公司）进行蛋白质印迹分析(Crispen等人，2007年).

2.8 hZip1表达的RT-PCR分析

使用MINI RNA分离II试剂盒（加利福尼亚州Orange，Zymo-Research）从细胞中分离出总RNA，并使用无DNA-Free RNA试剂盒（Zymo-Research）纯化总RNA。随后，使用200单位的SuperScript III逆转录酶（Invitrogen）和25pM的寡核苷酸（dT），以20μl的总体积进行1μg总RNA的逆转录（RT）₁₆)底漆。然后用正向5′-CCCTGGAGCCTAGTAAGCTTTTC和反向5′-CTCCTGTCAGCAGTGCATCT引物扩增cDNA，并从RT反应中扩增1μl cDNA。GAPDH基因的扩增被用作所有RT反应的内部控制。GAPDH的特异引物对为5′-ATGGGAAGGAGGTGAGGTC（正向）和5′-TCAGGCATTGATGATCTT（反向）。

2.9电泳迁移率变化（EMSA）和超迁移分析

双标记DNA寡核苷酸是通过对互补的单链寡核苷酸进行退火而产生的(补充，表2). 将50微克每一互补单链寡核苷酸混合在250微升退火缓冲液中，该退火缓冲液含有20mM Tris-HCl（pH-7.6）、50mM NaCl和10mM MgCl₂，然后加热至95°C 5分钟，并缓慢冷却过夜。用20μCi的[γ]标记每一微克退火DNA寡核苷酸-³²P] ATP使用T4多核苷酸激酶（新英格兰生物实验室，伊普斯威奇MA），并在Sephadex G25 MicroSpin柱上纯化（英国白金汉郡GE Healthcare Ltd）。

四微克核提取物蛋白质（核提取物制备补充的)在25°C下，在20μl含有25mM HEPES（pH-7.6）、30mM KCl、5mM MgCl的结合缓冲液中平衡20分钟₂，5%甘油，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒，含1μg聚（dIdC）和500μg/ml牛血清白蛋白。二十纳克（10-20.000 Cpm）³²添加跨越hZip1核心启动子的P标记双链DNA寡核苷酸，并在25°C下再培养20分钟。在竞争分析中，核提取蛋白与结合缓冲液和100倍摩尔过剩的未标记双链DNA寡核苷酸（与标记探针相同）预先孵育。在凝胶超移分析中，在与poly（dIdC）和/或特定竞争物寡聚物预孵育20分钟后，将2μg抗SP1（E-3）或2μg抗CREB1（C-21）抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Crux CA）添加到结合反应中。在25°C下继续培养20分钟。

使用6%聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TAE中在140V下分离反应混合物4h。凝胶在滤纸上干燥后，通过放射自显影法检测分离的复合物。

3.2 hZip1转录起始位点的定位

为了鉴定TSS，我们将RNA-oligo连接到去盖的mRNA上，然后扩增hZip1 cDNA的5′端，进行5′RACE。然后，通过比较PCR产物与{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AK075257”，“term_id”：“22761226”}}AK075257我们从GenBank的cDNA中鉴定出位于hZip1翻译起始位点（ATG）上游−836位的TSS(补充，图1). 根据这一发现，我们将TSS−836称为所有所述实验中的+1位置。

3.3 hZip1启动子区的转录活性

为了构建hZip1荧光素酶报告系统，我们扩增了一个与代表hZipl启动子区的PC-3 DNA转录起始位点片段相关的−366/+472，并将其克隆到萤火虫荧光素酶基因上游的pGL3报告载体中。该向量用作模板来创建各种5′-和3′-删除结构，如图2.

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图2

用pGL3荧光素酶报告载体转染PC-3细胞，转染24小时后检测荧光素素酶活性。hZip1启动子区片段的转录活性由直方图表示。数据以三次独立实验的平均值（±SD）表示。(A类)−366/+472片段以及3′-和5′-缺失片段的转录活性。然后对−224/+167片段进行进一步的缺失分析。(B类)从hZip1启动子区生成5′-和3′-缺失结构，确定−224/+82片段具有最高的转录活性。这被认为是hZip1核心启动子。(C类)hZip1核心启动子5′-和3′-缺失片段的示意图，以及在萤火虫荧光素酶基因上游克隆的假定转录因子结合位点（用箭头标记）的位置。

hZip1启动子−224/+167区域在荧光素酶报告分析中显示出高转录活性(图2A)，与SV40启动子相当。在进一步进行3′-和5′-缺失后，一个−224/+82片段显示出最高的转录活性。该区域被认为是核心启动子(图2B和2C).

使用TFSEARCH、AliBaba2.1和MatInspector程序对hZip1−224/+82核心启动子区域进行的计算机分析揭示了几个转录因子的假定结合位点(图3). SP1、GATA1、CREB/ATF1和NF-κB具有较高的匹配分数，并进行了进一步评估。为了确定每个转录因子对hZip1启动子基础活性调节的实际贡献，我们在hZipl核心启动子内创建了这些转录因子的突变结合位点的构建物(图4A). GATA1一致序列在−118/−125位置的突变不影响hZip1核心启动子的转录活性。相反，位于−104位的CREB结合位点突变使转录活性降低50%(图4B). 由于在hZip1核心启动子区域中发现了几个SP1结合位点，我们最初在转录起始位点特异性位置−8、−12和−30附近突变了三个SP1位点(图4B). 所有三个位点的同时突变使hZip1核心启动子的转录活性降低约75%，如图4B和4CCREB和SP1结合位点的伴随突变对hZip1转录活性产生了更深远的影响(图4B).

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图3

TSS周围的hZip1核心启动子序列（用箭头标记）、转录因子结合位点（用方框标记）和用作EMSA探针的dsDNA寡核苷酸的位置（用序列下方的箭头标记）。

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图4

用具有突变转录因子结合位点的pGL3-hZip1（−225/+85）载体转染PC-3细胞。24小时后进行荧光素酶分析。数据表示为三次独立实验的平均值（±SD）。(A类)通过诱变使转录因子结合位点失活的−225/+82片段的示意图（下划线）。(B类)GATA1一致序列的突变不影响hZip1核心启动子的转录活性；而CREB和SP1结合位点的选择性突变分别损害了约50%和75%的活性。SP1和CREB结合位点的伴随突变导致hZip1核心启动子活性损失80%以上。这表明对hZip1启动子激活具有加性作用。(C类)在位于−8、−12、−30和−80位置的SP1结合位点中，SP1/−8和SP1/–80结合位点在调节hZip1核心启动子激活方面最为重要。

为了进一步表征三个SP1位点对hZip1基础转录调控的相对贡献，我们产生了只维持一个完整SP1结合位点的突变(图4A). 荧光素酶报告分析(图4C)揭示了位于−8位的SP1结合位点在hZip1启动子激活中起着最重要的作用，因为该特定位点的突变显著降低了hZip1启动子的转录活性。我们还评估了SP1结合位点在−80位置的作用。虽然这个结合位点与一致序列的方向相反，但它对hZip1启动子的转录激活同样重要(图4C). 因此，我们的实验证明SP1和CREB蛋白在hZip1基础启动子活性的调节中都是重要的转录因子。

由于NF-κB结合位点包括TSS，并且该结合位点的突变可能损害转录起始，因此未进行该位点的突变。用TNF-α刺激NF-κB并没有增加hZip1的表达，NF-kb B抑制剂BAY-1185也对hZipl的表达没有影响（数据未显示）。EMSA对NF-κB的作用进行了进一步评估（见下文）。

3.4转录因子结合hZip1启动子的能力分析

为了研究转录因子结合hZip1核心启动子的能力，进行了EMSA和凝胶超移分析。对于EMSA，我们创建了几个覆盖hZip1核心启动子区域的30bp双链DNA寡核苷酸，其中包含转录起始位点周围的假定转录因子结合位点，如图所示图3.核提取蛋白结合[γ]的能力-³²P] EMSA使用特定竞争对手对标记的寡聚物进行了检测。核提取蛋白与DNA-寡核苷酸#1、#2、#3、#4和#5特异结合(图5和​和6）。6). 在DNA-寡核苷酸#6和#7的情况下，与核提取蛋白没有特异性结合(图5D). 为了确定哪些转录因子可以与寡核苷酸结合，我们使用了双链DNA寡核苷酸形式的特定竞争物，其中包含SP1、CREB、GATA1、NF-κB转录因子和突变类似物的一致结合位点。EMSA结果表明，只有SP1和CREB蛋白能够在其一致结合位点结合相应的DNA-寡核苷酸(图5A和​和6）。6). 我们还进行了凝胶超移，其中位于hZip1−224/+82核心启动子中的六个SP1结合位点能够与SP1相互作用。同样，CREB1转录因子被允许与寡核苷酸#2上的结合位点相互作用(图5B). 我们观察到SP1与其相应结合位点在−8、−80和−140位置的特异性结合(图6). 我们没有发现SP1与含有SP1/12和SP1/−30结合位点的寡核苷酸#4的结合。这些GelSupershift结果证实了荧光素酶分析结果，即位于−8和−80位置的SP1和CREB1在hZip1启动子活性中起着关键作用，但位于−12和−30的结合位点较少参与调节转录。

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图5

使用ESMA分析核提取蛋白结合靶向hZip1启动子的dsDNA寡核苷酸的能力。核提取蛋白与³²P-标记的dsDNA寡核苷酸#2、#5、#6和#7的摩尔过剩是未标记竞争对手的100倍。(A）使用含有GATA和/或CREB共识结合位点的特定竞争对手，我们表明CREB而非GATA蛋白质特异性结合到寡核苷酸#2。(B）使用特异性CREB1抗体进行GelSupershift分析，以检测与寡核苷酸#2结合的CREB1转录因子。(C）NF-κB与5号寡核苷酸没有特异性结合。包含NF-κB共识序列的特定竞争对手并没有改变ESMA图谱。(D）核提取蛋白不与寡核苷酸#6和#7结合。

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图6

使用GelSupershift测定法表征SP1与hZip1启动子的结合。核提取蛋白与特异性³²P-标记的dsDNA寡聚体#1、#3、#4和#5，存在其未标记竞争对手的100倍摩尔过量。³²以P标记的SP1-oligo作为对照。SP1可结合除4号寡核苷酸外的所有检测寡核苷酸。SP1与寡聚物#4和#5结合的GelSupershift图谱比较表明，仅与SP1/−8结合位点结合。

3.5 SP1和CREB1转录因子与hZip1启动子的特异性结合

确定SP1和CREB1是否与hZip1启动子特异结合体内，进行ChIP测定。用蛋白-G琼脂糖珠预先清除超声染色质样品，然后用SP1和/或CREB1的特异性抗体或正常小鼠IgG或RNA-聚合酶II的对照抗体沉淀过夜。用蛋白-G琼脂糖珠培养1小时后，洗涤和洗脱，然后反向交联，纯化DNA样品，并用引物对hZip1核心启动子的−174/+51区域进行PCR分析。正如预期的那样，当使用抗SP1或抗CREB1抗体沉淀染色质时，以及在阳性对照（抗RNA-聚合酶II抗体）中，我们观察到特定的225 bp PCR产物；PCR后作为阴性对照的正常小鼠IgG抗体未显示任何阳性信号(补充图2).

基金

这项工作得到了国立卫生研究院拨款RO1 CA108890（给V.M.K.）的支持。