BDNF通过TrkB促进存活、增强突触可塑性和改变脊椎形态来关键性调节神经元功能1,2然而，BDNF最初是作为前体物proBDNF合成的，它被伴侣蛋白（包括sortilin）转运到调节分泌途径三虽然proBDNF可能在细胞内被裂解，以活性依赖的方式释放成熟的BDNF4,5目前尚不清楚这种处理的效率如何，以及神经元分泌了多少proBDNF。因为重组proBDNF不激活TrkB，而是激活p75以促进细胞死亡并减弱突触传递6,7，这是一个重要的问题。
为了可靠地测量极低水平的内源性前BDNF，我们制备了对前体蛋白特异的单克隆抗体（mAb287）。该抗体检测到来自Bdnf公司+/+，但不是Bdnf公司 −/−，同窝的(补充图1和补充方法在线），在分子量上与重组proBDNF相对应；然而，我们没有观察到切割的前结构域（14-16kDa；补充图1). BDNF前体蛋白免疫反应存在于来自Bdnf公司+/+，但不是Bdnf公司−/−，小鼠齿状回的海马颗粒神经元，最显著的是其苔藓纤维从组织切片上的投射Bdnf公司+/+，但不是Bdnf公司−/−，小鼠（培养的神经元来自Bdnf公司+/+，但不是Bdnf公司−/−，只老鼠(补充图1). 我们还观察到CA2和CA3锥体细胞体以及透明层中的前体蛋白免疫反应，这与之前BDNF在大鼠体内的免疫定位一致8这些结果表明，完整的proBDNF在成人大脑中，特别是海马苔藓纤维中的区域性表达水平很高。
为了促进对前BDNF和成熟BDNF的定量检测，我们制作了一个敲除小鼠，其中内源性BDNFBdnf公司编码外显子被小鼠替换Bdnf公司带有C末端血凝素（HA）表位标签的序列(Bdnf-HA公司;补充图2在线）。两者都是纯合的(Bdnf-HA/Bdnf-HA)和杂合子(Bdnf-HA公司/+)小白鼠是活的、可繁殖的，与野生型同窝小白鼠没有区别。通过ELISA检测BDNF的区域表达，证明了BDNF在大脑皮层和海马中的可比水平Bdnf-HA公司/+小鼠和野生型同窝动物(补充图2). 此外，野生型和Bdnf-HA/Bdnf-HA通过western blot对小鼠进行比较(补充图1).
为了定量前BDNF和成熟BDNF，我们从野生型、，Bdnf-HA公司/+和Bdnf HA/Bdnf HA用HA抗体检测HA免疫反应。成熟BDNF-HA（~14.2kDa=~13.5-kDa成熟BDNF+~0.7-kDa-HA）和proBDNF-HA（~32.7kDa=~32-kDa-proBDNF+~ 0.7-kDa-HA）可从Bdnf-HA公司/+和Bdnf-HA/Bdnf-HA，但不是野生型海马裂解物(); B32.7-kDa的前BDNF条带是通过用前BDNF的抗血清探测证实的()用成熟BDNF抗体检测到~14.2-kDa成熟BDNF(). 我们的分析证实了BDNF-HA是定量沉淀的，在Bdnf-HA公司/+检测到约50%的BDNF-HA亚型Bdnf-HA/Bdnf-HA老鼠().
检测小鼠海马中的前BDNF和成熟BDNF，以及培养海马神经元分泌前BDNF-和成熟BDNF。(一)用HA抗体免疫沉淀指定基因型4周龄小鼠的海马裂解物，并按指示进行免疫印迹。mAb287是我们鉴定的BDNF前体的单克隆抗体补充图1. (b、 c（c）)将所示基因型的P0小鼠的神经元培养7天(b)或缺席(c（c）)α2抗纤溶酶。培养基（M）和细胞裂解物（L）用HA抗体免疫沉淀（IP）。用HA.11抗体检测前BDNF和成熟BDNF。(d、 e（电子）)神经细胞培养如b所示。我们添加了TrkB-Fc(d日)或TrkB-Fc或TrkA-Fc(e（电子）)在收获前3d将其放入培养基中。在没有TrkB-Fc的情况下培养的神经元作为对照进行分析。裂解物经免疫沉淀；Fc蛋白由蛋白A-琼脂糖捕获（捕获）。(（f）)在胚胎第16.5天（E16.5）培养神经元b并用56 mM KCl刺激90分钟。按指示处理培养基和细胞裂解物。(克)如前所述培养E16.5海马神经元9服用或不服用氟尿嘧啶2天。服用7天在体外，用56 mM KCl刺激细胞90 min，并按指示进行免疫沉淀/western blot分析。我们所有的动物研究都得到了威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会的批准。
为了确定是否确实分泌了前BDNF，我们培养了来自Bdnf医院/+或野生型小鼠，以减少胶质细胞污染，使用α2抗纤溶酶来防止分泌的proBDNF分裂。神经元成熟后在体外，使用HA抗体的免疫沉淀/蛋白质印迹分析从培养基和细胞裂解物中收集BDNF亚型。在海马神经元裂解物中很容易检测到前BDNF和成熟BDNF(). 出乎意料的是，在7或14天时，只有proBDNF在神经元介质中被检测到在体外(和补充图3分别在线）。在缺乏纤溶酶抑制剂的培养基中也检测到ProBDNF水平降低(与相比)表明分泌的proBDNF是在细胞外加工的。培养基中缺乏成熟的BDNF让我们感到惊讶，我们考虑了分泌的成熟BDNF是否与神经元TrkB结合并被其内化。因此，我们将TrkB-Fc受体体添加到已建立的培养基中，以捕获分泌的成熟BDNF。TrkB-Fc沉淀后，在培养基中检测到成熟的BDNF()，但在缺乏TrkB-Fc的培养基中未观察到()或使用TrkA-Fc(). 此外，我们用56 mM KCl去极化培养神经元90分钟，记录了前BDNF和成熟BDNF的释放(). 这些研究表明，成熟和前BDNF均由去极化海马神经元分泌。
这些结果与最近一份报告的结果大不相同9，其中成熟BDNF是在细胞裂解物中检测到的主要形式，未观察到分泌的前BDNF。在该研究中，实验设计的差异可能会损害对前BDNF的检测，包括使用神经元和胶质细胞的混合培养物，省略纤溶酶抑制剂，以及延长50µM荷包牡丹碱的治疗时间（24小时），这可能会导致兴奋毒性。我们直接将我们的培养条件与最近报告中使用的培养条件进行了比较9，使用Bdnf-HA公司/+或野生型海马神经元和短暂KCl治疗（90分钟）诱导BDNF亚型分泌。在缺乏纤溶酶抑制剂的混合神经元/胶质细胞培养物中，可以在细胞裂解液和培养基中检测到前BDNF()，但与缺乏纤溶酶抑制剂的神经胶质细胞培养物相比，分泌的前BDNF水平降低(). 这些结果强烈表明，胶质细胞可能会增强proBDNF的处理或摄取，这与胶质细胞合成的高水平蛋白酶（包括组织纤溶酶原激活物）一致10此外，与BDNF成熟域抗体相比，表位标记的BDNF小鼠的产生和使用大大增强了我们对BDNF亚型的检测(补充图1).
由于proBDNF和成熟的BDNF在细胞存活和突触可塑性方面表现出不同的作用，我们接下来要问的是，当轴突投射建立和突触形成时，proBDNF是否表达得更高。在齿状颗粒神经元，尤其是苔藓纤维中，前体蛋白免疫反应和HA免疫反应的细胞定位具有可比性和显著性()来自Bdnf医院/+因此，我们评估了出生后第3至21天（P）海马proBDNF的表达，此时苔藓纤维投射和突触发生。事实上，在出生后第二周，proBDNF的表达最高，在成熟的海马中水平下降，但仍可以检测到(). 相反，成熟的BDNF在出生后的整个发育过程中都有表达，并且是成人的主要亚型。同时，p75在出生后第一周的海马表达最高，在4周和6周时显著降低(). 出生后海马体的免疫定位显示，p75和proBDNF在出生后第1周广泛表达，但在以后的年龄中主要局限于透明层(). 这些结果表明，前BDNF和p75的空间和时间表达是协调的，在围产期窗口期，当轴突生长和突触成熟时，观察到高水平的表达，并且在青春期/成年期出现更多的局部但维持的表达。
proBDNF和p75表达的发育调节。(一)用单抗287、HA和Cy3-结合链霉亲和素抗体免疫荧光检测小鼠海马（P28）中的BDNF，如Bdnf-HA公司/+或野生型大脑。以非免疫小鼠IgG作为对照。比例尺代表250µm。(b)对来自指定基因型和年龄的小鼠的海马裂解物进行BDNF亚型免疫沉淀/western blot分析（顶部），探测以检测p75（中部）或探测ERK作为负荷对照（底部）。（e） 使用1周龄和4周龄小鼠大脑免疫荧光检测proBDNF或p75。非免疫IgG作为对照。比例尺代表250µm。
我们的结果表明，proBDNF不是一种短暂的生物合成中间体，而是在出生后的发育过程中在苔藓纤维中有效表达和运输的。神经元中BDNF-GFP的实时成像显示，60%的BDNF快速顺行运输11与之前的研究表明BDNF被分类为致密核小泡相一致12并在去极化时释放。这些结果支持一种模型，即BDNF亚型，可能包括前BDNF和成熟BDNF，可以被靶向并释放以调节突触可塑性。出生后早期大脑中相对较高水平的proBDNF，以及随后在青春期和成年期更有效地转化为成熟BDNF表明，proBDNF-转化的效率受到发育调控。然而，阻止前BDNF在围产期有效转化的机制尚不明确，因为众所周知，前转化酶2能够在细胞内裂解前BDNF-，在妊娠中期在中枢神经系统中广泛表达13然而，出生后海马中p75和proBDNF的协调调节强调了proBDNF:p75受体配对的严格调节的时间和区域模式。总之，这些研究表明，当轴突延伸时，proBDNF-的作用可能在出生后发育期间最为强大，树突状棘修剪和突触成熟普遍存在，而proBDNF的作用在区域上更受限制，但在成年期仍保持不变。
