基于Get3结构的真核生物尾锚定蛋白结合模型

摘要

尾锚定（TA）蛋白是一类广泛存在于所有生物体中的完整膜蛋白。这些包括许多类型的蛋白质，如SNARE、凋亡因子和蛋白质易位成分。TA蛋白的特征是在其末端C末端有一个跨膜螺旋（TM）。由于这种拓扑约束，这些蛋白质不能遵循SRP依赖的共翻译途径，而这是大多数完整膜蛋白的典型特征。相反，这些蛋白质必须找到正确的翻译后插入膜（参见参考文献。1和2).

ATP酶Get3是第一个直接参与TA靶向的蛋白质，是Get途径（现在称为尾锚定蛋白的引导进入）的一部分，该途径还包含ER膜蛋白Get1/2和假定的核糖体受体蛋白Get4/5(三——7)。多项研究表明，Get3直接与疏水性尾锚定物结合，并与核糖体和内质网（ER）因子结合，利用ATP循环结合，然后在ER膜上释放TA蛋白。

Get3最初注释为Asna-1/Ar4p，因为它与细菌亚砷酸盐转运蛋白组分ArsA明显同源（≈25%同一性）(8)。Get3同源物与一系列不同的功能有关，现在被认为与TA蛋白的正确定位有关(9——12)。Get3是一种蛋白质靶向因子，类似于信号识别粒子（SRP），并且类似于SRP成分(13)，对酵母的活力不是必需的；然而，这些细胞对各种压力（如热和金属）都很敏感(14).

Get3包含一个核苷酸水解酶域（NHD），类似于Ras特征的G型水解酶(15)]. 这些蛋白质都具有完全保守的“P-loop”，在NDP和NTP状态下识别α-和β-磷酸。G型水解酶的其他特征是开关I（A'）和开关II（Walker B）环，它们经历了剧烈的重排，将结构变化耦合到γ-磷酸盐的存在。在这些蛋白质中，催化作用是由一个带正电荷的残基刺激的，该残基稳定磷酸盐上的负电荷，以及一个定位催化水用于亲核攻击的残基。

Get3与ArsA和固氮酶铁蛋白（NifH）一样，属于一类特殊的ATP酶，它包含一个“异常”Walker a基序，该基序是一个带有附加不变赖氨酸（GK（K）Get3中的GGVGKT）(16)。这是一个罕见的基序，仅在其他两种酵母蛋白中发现[包括一个假定的铁蛋白同源物(17)]. 通过与ADP·AlF结合的NifH二聚体的结构可以推断出偏离P-loop ATP水解循环的基本模型₄^负极和它的合作伙伴MoFe蛋白(18)。NifH的ADP和apo形式为开放构象，对ATP水解无效(19)。MoFe蛋白与ATP结合，导致两个NifH单体发生大的旋转和平移移动，从而使来自相反单体的偏差P-loop赖氨酸稳定在磷酸盐上的负电荷积聚。这类似于Ras的机制，其中来自GAP的Arg指刺激ATP的水解，导致Ras失活(20，21)。这个界面的转变证明了ATP是如何调节巨大的结构变化的。对所有这些至关重要的是，重排通过MoFe蛋白的结合来稳定(18)。在ArsA的情况下，如果没有它的伙伴ArsB结合，则没有发现NHD与相同核苷酸结合的状态，因此有理由推测，在真正的ATP状态下，也必须发生剧烈的构象变化(22，23).

目前还没有关于Get3如何发挥其重要靶向功能的机制研究，而分子水平的理解需要结构信息。这里我们展示了Get3/TRC40的三种晶体结构，它是一种单体载脂蛋白形式酿酒酵母(Sc公司嗜热机会性人类病原体的二聚载脂蛋白和六聚ADP结合形式烟曲霉(阿富汗获取3和阿富汗获取3-ADP）。基于这些结构，我们通过表型拯救探索了功能界面和必需残基。我们的结果使我们能够定义Get3如何将ATP水解与TA-蛋白的结合和释放耦合的模型。更广泛地说，这项工作支持一类特殊ATP酶的机制。

结果

Get3结晶。

我们净化了Sc公司获取3和阿富汗从中表示的构造获取3大肠杆菌在还原条件下使用镍亲和性和尺寸排除色谱法。大多数蛋白质作为二聚体从两种结构中洗脱出来，并用于结晶试验。这个阿富汗在空间群P2中衍射到3.2分辨率的Get3 ADP晶体₁2₁2₁不对称单元中有一个六聚体。硒-甲硫氨酸数据集的分辨率为4.5-Å，相位通过多波长反常色散进行求解，并使用6倍非晶体对称性扩展到3.2-\8491 ;分辨率。最终的精制结构包含348个残基中的292个残基，游离R因子为25.1%(图1C类和图S1)。Get3的两种Apo形式通过截短的阿富汗Get3-ADP单体。这个Sc公司Get3-apo晶体在空间群H32中衍射至3.7-Å分辨率，并在不对称单元中包含单体。最终模型包含369个残基中的260个残基，并精炼为33.5%的Free-R因子(图S2A类和B类)。这个Af公司Get3-apo晶体在空间群P4中衍射至7.5-Å分辨率₂32，并且在不对称单元中包含一个二聚体，由于分辨率低，我们没有对其进行精炼(图S2D类)。结晶统计数据见表S1.

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图1。

Get3的结构。(A类)一个阿富汗Get3-ADP单体，二级结构元件编号如所示图S1. (B类)NHD二聚体阿富汗Get3-ADP六聚体。一个单体的颜色从N-（蓝色）渐变到C-（红色），另一个单体色与文本中描述的图案相关：P-loop（绿色）、Switch I（洋红色）、Swit II（蓝色）、A-loop（红色）、SB1（紫色）和SB2（棕色）。(C类)阿富汗Get3-ADP六聚体的不对称单元被单体着色。标注二聚体接口和子单元。三次折叠用三角形表示，二次折叠用椭圆形表示。每个单体SB1的模拟残留物是透明的。核苷酸和桥联二硫化物显示为球体。(D类)臂二聚体阿富汗Get3-ADP六聚体。一个单体颜色渐变，如A类另一种是彩色鲑鱼。(E类)Sc公司Get3模型颜色为紫色，覆盖有阿富汗Get3-ADP单体着色和定向如B类.

核苷酸结合。

Get3核苷酸结合囊包含G型水解酶中普遍存在的所有特征。S7中完全保守的Asn(Sc/Af公司272）形成专门选择腺嘌呤的氢键。与A-loop完全腺苷识别的其他相互作用(图2A类)。典型的P环与α-和β-磷酸盐有广泛接触；然而，第二个赖氨酸在P-环中完全保守，其方向远离β-磷酸。这是由于臂二聚体中的相互作用导致SB2产生Arg所致(阿富汗200）移动到活性位点中，占据接近预期Mg的类似位置²⁺被约束(图2A类)。很明显阿富汗R200取代Mg²⁺通常会中断交换机I和II的交互。根据决议，我们无法确定是否没有镁²⁺; 然而，如果存在，它将处于一个独特的位置。阿富汗R200与β-磷酸盐形成盐桥；但它并不保守，这使得这些相互作用的程度令人惊讶。

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图2。

核苷酸结合囊以及Get3与其他水解酶的比较。(A类)核苷结合囊阿富汗获取3个ADP，残留物显示为条状。密度是以1.5σ等高线表示的2Fo-Fc省略映射。(B类)ADP形式的带状图Ec公司含ADP、Mg的ArsA（1f48）²⁺（绿色）和配位锑（紫色）作为球体。(C类)以Fe/S团簇（橙色/黄色）为球体的NifH（2nip）的apo形式的带状图。在中的右侧B类和C类单体覆盖层阿富汗Get3-ADP单体（灰色）位于相应的左侧亚单位上。标记重要的残基和图案。核苷酸结合基序中的所有残基均按1所示着色B类.

Tail Anchor装订口袋。

在寻找TA-蛋白结合囊的过程中，SB1和SB2的位置显然具有挑衅性。我们通过在分子可及性表面显示保守和疏水残基来分析NHD二聚体(图3)。由NHD二聚体形成的界面是高度保守的，正如常见折叠所预期的那样(图3A类)。在SB1/SB2形成的基底和凹槽处发现了其他浓度的保守残留物(图3C类)。SB1/SB2的整体校准很困难；然而，疏水残基和甘氨酸普遍保持不变(图S1)。此外，SB1包含无序拉伸，也可以在该区域提供表面积。二聚体表面上唯一的疏水斑是SB1和SB2之间形成的疏水斑(图3 B类和D类)。这个假定的TA结合区域类似于NifH中ArsA或Fe-S簇金属结合位点的位置(图2 B类和C类)有人推测ATP结合囊中的变化会传递到该区域。

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图3。

保护和疏水表面。(A类)前视图和后视图将一个单体显示为色带，如1所示A类另一个是可接近的表面，显示出保护色，从100%（紫色）到50%的保护色（灰色）。保护基于Get3路线图S1(B类)类似于A类根据Kyte和Doolittle刻度显示疏水性，最疏水的为深黄色。(C类)从顶部看的保护表面。(D类)从顶部观察疏水表面。

表型拯救。

为了探索Get3的功能部分，我们选择了一系列基于表面保守性或假定功能的突变体，并测试了它们拯救已知敲除表型的能力(30)。击倒（Δ获得3)在30℃时，合成完整培养基未显示出明显损伤，但在含有铜的培养基上无法完全修复²⁺或羟基脲或高温生长。替换质粒上的Get3基因(GET3公司)野生型启动子拯救了Δ获得3增长到接近野生型水平。我们还插入了阿富汗Get3基因位于同一质粒上，这也拯救了酵母敲除，表明蛋白质的功能方面在物种间是保守的(图4A类和图S3)。总的来说，我们产生了69个Sc公司突变体和两个阿富汗突变体，并将其一般功能丧失（LOF）表型评分为强、中度、弱或无(图4 A类和B类，中所有突变体的数据图S3和表S2).

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图4。

各种Get3突变体的表型拯救。(A类)在30℃和40℃的SC Ura平板上筛选并补充2mM CuSO的具有野生型启动子的质粒上的各种酵母突变体的点板分析₄30C和37C温度下。Δ获得3是用只含有启动子的质粒转化的敲除子。基于酵母编号的突变体相对于其表型显示为有色：强（红色）、中等（橙色）、弱（黄色）和无（青色）。(B类)两个视图，一个单体作为可接近表面，另一个根据表型呈带状着色，如A类.

与之前的结果一致，P环中的任一个突变(Sc公司G30R或阿富汗G38R）或形成二硫键桥的Cys对（C285T/C288T）具有较强的LOF表型(图4A类) (三，30)。G30R突变被认为破坏ATP结合。Cys突变体的作用尚不清楚。据推测，该界面有点不稳定，需要二硫化物来稳定二聚体，类似于ArsA的连接二聚体。由于细胞质是一个还原的环境，二硫化物可能会在体内形成，这很奇怪；然而，我们在所有缓冲液中都加入了还原剂，以及在这种情况下形成的二硫化物。另一种可能性是这些残基与金属配合或受氧化还原途径调节(30)作为中的简化形式Sc公司Get3-apo晶体是一种单体，与锌配合(图S2A类和B类).

最大的LOF突变体簇出现在NHD二聚体界面，主要出现在H8和H9上。界面是疏水基团和带电基团的混合物，与二聚体的重排密切相关（图S4B类，图S1和S4A类)。只有少数保守的表面突变没有在这种晶体形式中进行接触，从而产生LOF表型（R75A、D265A和Y338A），并且可能不会影响底物结合的构象变化(图S4B类)。这些表面残基可能在识别Get途径中的其他蛋白质中发挥作用。

开关螺旋线的变化通常与功能变化相耦合。虽然ArsA核苷酸结构几乎没有构象变化，但有人推测ATP的结合会导致Switch II的构象变化并传递给参与金属配位的His(22)。这个残留物(Sc公司H172）是在Get3中发现的来自ArsA的唯一配位残基，在我们的结构中，它可以与盐桥网络相互作用，盐桥网络似乎可以稳定SB1/2的基底(图S4C类)。这些残基的突变具有LOF表型；然而，它们并不强大，可能Switch II更改的耦合对于TA绑定来说不是必需的。

Get3通过疏水相互作用结合多种TA-蛋白底物(4)而且很难确定哪些突变会干扰结合。根据预测的口袋，我们在SB1和SB2中产生了广泛的突变。正如预期的那样，预测的TA蛋白结合口袋中的突变（I136S、D137A、L140S、S141A、M143S和L219S）具有LOF；然而，大多数残基没有表型，包括我们结构中的那些紊乱的残基(图4B类和图S4D类)。这种疏水性相互作用可能需要结合囊中的多个突变才能看到明显的破坏。

SB2残留物缺乏保护阿富汗R200在Sc公司不可能。由于其位于阿富汗Get3-ADP结构，我们决定通过阿富汗获取3.An阿富汗R200A突变是明显的LOF表型(图2A类和​和44A类)。这与SB2这一区域中的许多其他突变（包括一些无序残基）形成对比，这些突变没有表现型。很难想象阿富汗R200A在缺乏六聚体的情况下发生突变。

保守的异常P-loop赖氨酸突变有望完全丧失功能，并应为强表型。在阿富汗Get3-ADP结构此残留物不接触(图4和图S4A类)尽管如此，这个残基还是变成了Ala(Sc公司K26A）是所有表型中最强的。在Ras/RasGAP病例中，Arg-finger的任何突变都会导致总LOF，甚至Lys的看似良性突变(31)。我们做了相同类型的突变，Sc公司K26R，并发现该突变体是一个强大的LOF表型，尽管不如Sc公司K26A。

讨论

Get3必须将ATP水解与TA-蛋白结合和释放偶联。为了提出TA蛋白的Get3结合机制，我们可以基于NifH结构对向封闭结合状态的转变进行建模。我们相信，我们的结构代表了各种开放的、非底物结合构象，其中疏水性SB1/2具有高度的灵活性，并且可以与蛋白质相互作用，可能处于亚稳六聚体状态。ATP的绑定耦合到将传输到SB1/2的交换机环路的重新安排。结合还包括移动桥联的二聚体界面的旋转和平移Sc公司K26公路(阿富汗34），以抵消γ-磷酸盐的额外电荷（模拟于图5A类)。这个阿富汗Get3-apo二聚体显示了当它向内旋转时，相对于Af公司Get3-ADP二聚体，证明该界面的灵活性(图S2E类)。在这个简单的类NifH模型中存在冲突，我们认为必须发生额外的构象变化。

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图5。

类NifH模型。(A类)覆盖Af公司在开放二聚体和封闭NifH（1m34）样模型中获取3-ADP。这个阿富汗Get3-ADP二聚体，类似于图1B类，按特征用右侧单体着色，左侧用紫色着色。模型化的旋转单体呈浅蓝色。阿富汗K34和桥联半胱氨酸显示为球体。箭头表示运动方向。(B类)NifH-like模型的守恒曲面向左A类. (C类)NifH-like模型的疏水表面向右A类.

这种ATP结合的复合物将在二聚体界面埋藏大量保守残基(图5B类)并将来自相反二聚体的SB1/2推向更近的方向，在界面顶部形成一个大的疏水沟槽(图5C类)。这种结构与我们的六聚体不兼容，但可以为TA-蛋白提供良好的结合表面。TM螺旋将停靠在SB2底部形成的凹槽中，SB1的疏水性柔性环随后可以缠绕在其周围，类似于SRP信号序列的指尖绑定(32)。这种模型中唯一缺少的成分是将激活催化水的残留物。膜上额外的伴侣结合可能会贡献这一组或导致Get3中的额外构象变化，一旦底物被传递，这些构象变化将刺激ATP水解。

基于这项工作的Get3寡聚状态导致了关于功能的开放性问题。通过与NifH和ArsA的同源性，我们描述了NHD二聚体相互作用与TA-蛋白结合最相关的模型；然而，我们发现很难忽略arm二聚体界面。在我们所有的晶体结构中，SB1/2相互作用掩埋了大量疏水表面，这意味着它们对结合蛋白具有高亲和力(图1D类和图S2C类和F类)。在开放状态下，这些表面应该非常不稳定，很难想象它们会自由存在于细胞质中。在我们的晶体结构中看到的六聚体可能是蛋白质的一种稳定的静止形式，需要额外的因素，例如Get4/Get5蛋白质(7)，转变为开放的二聚体状态。另一种可能性是六聚体作为ADP交换因子（如Ras的全球环境基金）通过取代Mg稳定ATP结合的载脂蛋白形式²⁺释放ADP。在阿富汗获得R200盐桥到ADPβ-磷酸，这似乎可以稳定ADP形式；然而，在我们的晶体条件下，ADP的浓度非常高，这种结合可能是人为的。第三种可能性较小，可能是六聚体是复合物的活性形式，TA蛋白稳定在柔性疏水中心，类似于一些AAA ATP酶(33)。支持六聚体作用的证据是阿富汗R200，一种纯化的人类获得兼容大小的复杂沉积物(4)，ArsA的功能形式是多聚体(34)，通过EM和色谱法观察到三体形式的ArsA(35).

通过Get途径正确合成和靶向TA-蛋白在生物学上具有广泛的意义，因为它们在许多细胞内环境稳定和运输过程中至关重要。我们的结构和功能研究是对最近发现的通路成分Get3的一种机制研究。这些实验使我们能够定义一个模型，预测与TA-蛋白和核苷酸结合有关的Get3构象变化(图S5)。他们还提出了一种可能发挥关键作用的低聚形式。TA-蛋白靶向的许多方面，如底物结合的细节、伙伴的相互作用以及识别和释放的动力学步骤，仍有待确定。

方法

完整的方法在SI文本包括一张晶体学表和一份完整的测试突变体列表。我们在这里简要讨论了这些方法。C-末端6×His标记烟曲霉和酿酒酵母将Get3编码序列克隆到pET33b载体中。Get3表达于大肠杆菌细胞，并用镍亲和性和尺寸排除色谱纯化。在标准筛网中确定了初始结晶条件。阿富汗Get3-ADP实验相由硒甲硫氨酸衍生物通过多波长反常色散获得。两种载脂蛋白形式的相均通过分子置换获得。对于生长分析，阿富汗和Sc公司将Get3编码序列克隆到YEp352载体中，通过定点突变进行突变。将构建物转化为菌株BY4741和Get3敲除菌株BY47 41YDL100c:：kanMX4.

补充材料

致谢。

脚注

工具书类