人类胚胎干细胞的功能性神经发育：通过星形细胞共培养加速突触活性

摘要

介绍

在小鼠皮层发育过程中，当心室区产生的新生神经元迁移到中间区时，胚胎后期很少发生生理变化。大多数迁移神经元表达未成熟钠（Na⁺)和钾（K⁺)电流(我_纳和我_K（K）)以相对于成人皮层神经元的小幅度为特征。相反，到达皮质板后，迅速成熟，其中我_K（K）,我_纳动作电位（AP）振幅随着AP持续时间的缩短而增加。同时，出生后早期神经元获得了激发重复性AP序列的能力(Annis等人，1993年;皮肯·巴里和穆迪，2003年). 这些特征，再加上突触活动，构成了成熟功能神经元的特征。

从小鼠胚胎干细胞（mES）产生的神经元也显示出类似的成熟模式在体外(贝恩等人，1995年;Strubing等人，1995年;Finley等人，1996年;Benninger等人，2003年). mES细胞源性神经元早期表达我_K（K）,我_纳、和我_钙分化后6天内，1周内可以看到自发和刺激的AP(Strubing等人，1995年). 将mES细胞移植到器官型海马小鼠脑片上，结果表明，在培养的前5天内，表达了类似类型的离子电流，并在接下来的2周内增加，与AP振幅增加和AP持续时间减少相关(Benninger等人，2003年). 尽管取得了这些进展，但大多数使用mES细胞源神经元的生理学研究都集中于具有多个区域特征的异质神经元群的成熟(贝恩等人，1995年;Strubing等人，1995年;Finley等人，1996年;Benninger等人，2003年;杜和张，2004). 这使得脑切片和mES细胞衍生神经元的发育研究之间的直接比较难以解释。

人类神经发育的最详细描述来自解剖学研究(O'Rahilly，1999年)概述了神经上皮组织在神经发生过程中形成主要中枢神经系统结构的复杂过程，但它们不能深入了解功能性神经元的成熟。为此，初级胎儿培养(加藤等人，1985年;Erkman等人，1989年;Kerkovich等人，1999年)来自胎儿脑组织的扩展神经祖细胞(Chalmers-Redman等人，1997年;Svendsen等人，1997年,1998;Carpenter等人，1999年;Piper等人，2001年)和永生化神经元细胞系(Li等人，2000年)一直是监测人类神经元发育的主要模型。这些方法提供了能够生理成熟的活神经元，但这些神经元的时间发育因组织年龄而异，在体外扩张和培养方法(Piper等人，2001年). 相反，人类胚胎干细胞能够分化为所有类型的细胞(汤姆森等人，1998年;Reubinoff等人，2000年)允许在高度可重复的条件下对神经发育进行系统功能评估。神经上皮细胞可以从hES细胞中高效生成，并形成区域化神经祖细胞(Zhang等人，2001年;Perrier等人，2004年;Li等人，2005年;Singh Roy等人，2005年;Yan等人，2005年). 有趣的是，hES细胞神经发育的早期阶段对应于大脑的早期解剖发育（有关综述，请参阅张，2006). 这种细胞分化模型为探索功能性神经元的发育和破译这些生理特性是如何调节的奠定了基础。

在这里，我们报告了均匀表达前脑标记物的hES细胞源性神经上皮细胞在分化3到10周期间以时间依赖的方式逐渐获得基本的电生理特性。我们还发现，hES细胞源性神经元培养物中的突触活动与星形胶质细胞分化暂时相关，外源性星形胶质细胞可以在AP成熟前促进突触传递。

材料和方法

结果

hES细胞衍生的神经祖细胞表达前脑标记物，并依次生成神经元和星形胶质细胞

使用最小形态原处理（见材料和方法）从hES细胞分化和富集神经上皮细胞3周(图1A类)之后，对神经上皮球进行铺板以允许神经元分化。电镀后24小时，β_三-微管蛋白⁺簇的外围出现单极和双极形态的神经元(图1B类). 大多数β_三-微管蛋白⁺神经元也开始表达树突状标记物MAP2（89.2±2.9%，从四种培养物中计数252个细胞），主要在胞体和主要的突起中(图1B类). 随着培养时间的延长，尤其是分化6-7周（电镀后3-4周）后，许多细胞显示出更复杂的树突状树枝状结构(图1C,D类).

在单独的窗口中打开

图1。

hES细胞源性神经上皮表达前脑标记物，并依次生成神经元和星形胶质细胞。A类神经和胶质细胞分化时间表；H9 hES细胞分化为Pax6⁺/Sox1系列⁺神经上皮细胞（NE）在2周内，在悬浮培养中富集一周，然后在层粘连蛋白-多鸟氨酸底物上培养7周。B类表达β_三-微管蛋白在电镀后24h内从神经上皮簇迁移。C,D类，分化4–10周后（电镀后1–7周），神经元表达β_三-微管蛋白和MAP2，表现出越来越复杂的多极形态。插图提供了更大的细胞放大率，以清楚地显示形态变化。E类,F类,H（H），绝大多数未成熟神经元（β_三-微管蛋白⁺)Otx2阳性(H（H）)和Bf-1(E类)其表达在成熟的培养物中保留(F类).我、星形胶质细胞（S100β⁺)分化7周后（电镀4周后）开始出现，最初表现为形态简单，突起较少（插图）。G公司,J型分化10周后（电镀后7周），星形胶质细胞更大，显示更复杂的多极形态（插图），并进行GFAP染色(G公司)和S100β(J型). NF-68，神经丝-68。比例尺，50μm。

先前的研究发现，根据培养条件的不同，hES细胞可以分化为具有不同区域特征的神经元(杜和张，2004). 为了检验我们的培养物随着时间的推移所采用的区域特性，我们分析了同源结构域蛋白的表达，包括前脑特异性转录因子Otx2(Simeone等人，1992年)，端脑标志物Bf-1(Xuan等人，1995年;岛村和鲁宾斯坦，1997年;Watanabe等人，2005年)和Hoxb4，后者由后脑和脊髓表达。电镀后24小时，绝大多数细胞Bf-1阳性（97.2±0.9%，从6个培养物中计数1058个细胞）(图1E类)Otx2（98.9±0.3%，从六种培养物中计数1037个细胞）(图1H（H）). 簇内或外围的细胞均未被HoxB4染色（数据未显示）。前脑的特性至少保留到7周（电镀后4周），因为绝大多数神经元继续共存于Otx2（96.7±1.1%，从6种培养物中计数420个细胞）或Bf-1（96.8±1.2%，从4种培养物计数369个细胞）(图1F类)带有β_三-微管蛋白。

胶质细胞分化分析表明，分化6周（电镀后3周）后，没有细胞表达星形胶质细胞特异性Ca²⁺-结合蛋白S100β(Van Eldik等人，1984年)（未显示数据）。除了传统的星形细胞标志物GFAP外，我们还使用了S100β，因为GFAP也在神经前体细胞中表达(Kriegstein和Gotz，2003年;Casper和McCarthy，2006年). 7周后（电镀后4周）开始，少量S100β⁺细胞群的外围开始出现细胞(图1我). 此时，星形胶质细胞具有简单、圆形的形态，很少有短突起从细胞体发出(图1我). 培养9周后，GFAP或S100β标记的星形胶质细胞分布更广，出现在整个神经网络中(图1G公司,J型). 在随后的时间点，更复杂的形态明显，多个突起从细胞体中凸出(图1J型，插图）。从这些结果中，我们得出结论，前脑祖细胞和神经元的数量相对均匀，可以从hES细胞中分化出来，神经发生/胶质生成的时间模式在体外-产生的人类神经祖细胞保存在我们的培养系统中。

AP特征的渐进性变化对应于形态学和细胞化学成熟

接下来，我们通过测量一系列被动和主动特性，包括RMP、电容、输入电阻，对培养3到10周的神经元电生理成熟进行了表征(R（右）_在里面)去极化电流脉冲诱发的AP和自发突触活动。我们发现RMP的超极化程度稳步增加，到10周龄时（电镀后7周）达到平均值−58.1±3.2 mV。主要反映细胞大小的细胞电容从第3周的平均17±1.4 pF显著增加(n个=21）至25.6±2.2 pF（第10周）(n个= 11;第页< 0.05). 同样，R（右）_在里面与通道表达和活性水平呈负相关，但在培养中随着年龄的增长而降低(表1). 这些数据表明，神经元的大小增加了约50%，并开始在膜表面表达更多的离子通道，这可能有助于观察到的RMP降低。

表1。

发育中hES衍生神经元的被动膜特性

时间（周）	RMP（毫伏）	上限（pF）	R（右）在里面（MΩ）
4	−39.2 ± 2.3	17.0 ± 1.4	2518.8±280.1
6	−45.8 ± 2.7	23.2 ± 1.5	2769.2 ± 503.1
7	−49.8 ± 2.3	24.2 ± 1.6	1190.8 ± 158.2
10	−58.1 ± 3.2	25.6 ± 2.2	1807.3 ± 253.6

在单独的窗口中打开

来自hES细胞的前脑神经元显示R（右）_在里面和RMP，而细胞电容（Cap）在培养4到10周时增加。

接下来，我们测试了神经元激发AP的能力，并测量了当细胞在自然RMP下休息时，神经元对去极化电流脉冲的响应特性。4周后（电镀后1周），50%的神经元(n个=20）能够发射AP(图2B类)具有明确的激活阈值，可被TTX阻止（未显示数据）。剩余的4周龄电池显示出瞬态电压偏转(图2A类，4W）未被TTX或CdCl阻止₂（未显示数据）。到6周时，能够激发AP的细胞百分比增加到83%(n个=12），这些细胞获得了更突然的激活阈值(图2A类，6W，箭头）。到7周时，88%的细胞可以激发AP(n个=9），同时显示振幅增加和持续时间缩短(图2A类，7瓦）。到10周时，100%的神经元可以激活AP(图2A类，10瓦）(n个= 16).

在单独的窗口中打开

图2。

AP成熟期为3至10周。A类，显示了生长4、6、7和10周（W）的神经元对30 pA电流注入的代表性电压响应。根据阈值的明确证据确定AP（箭头）。在10周（10Wi）时，在一些细胞中观察到重复的AP序列。B类这些神经元的总结数据表明，培养7周后，为响应30 pA电流脉冲而激发的AP数量显著增加。C,D类，AP振幅(C)分化6至7周时显著增加，半宽度显著减少(D类).E类，当神经元保持在−55和−60 mV之间时，在6周和7周之间没有观察到AP振幅的显著差异。F类，当细胞处于负电位时，AP半宽度在6周和7周之间仍存在显著差异*第页< 0.05; **第页< 0.01. NS，不重要。误差条表示SEM。

使用AP振幅和持续时间（半宽度）作为神经元成熟度的测量，我们发现AP振幅在分化4到6周期间保持不变(图2C)（4周，n个= 10; 6周，n个= 8;第页> 0.5). 然而，在6到7周之间，振幅发生了显著增加(图2C)（6周，n个= 8; 7周，n个= 7;第页< 0.05). AP振幅在随后的时间点保持升高，与之平行的是R（右）_在里面(表1). AP持续时间显著缩短反映了6至7周期间AP振幅的增加，随后在10周的分化过程中保持不变(图2D类).

神经元对电流注入产生一系列AP的能力也与细胞成熟度相关(Gao和Ziskind-Conhaim，1998年;Benninger等人，2003年;皮肯·巴里和穆迪，2003年). 我们发现，4周后（电镀后1周），神经元无法对30 pA电流脉冲触发多个AP，有些甚至无法触发单个AP，导致平均值<1(图2B类). 随着时间的推移，AP的平均数量增加，与4周龄细胞相比，培养7周后达到显著水平(图2B类). 虽然许多细胞表现出重复性的尖峰，但第二和第三个尖峰的振幅通常会减小，持续时间也会延长(图2A类、7瓦和10瓦）。相比之下，到10周时，一部分神经元能够激发一系列AP，而随后的棘波振幅没有降低，持续时间也没有延长(图2A类，10Wi）。

AP振幅受可用Na数量的影响⁺通道，部分由RMP控制。因为我们发现细胞在培养过程中随着时间的推移变得越来越超极化，所以我们询问超极化是否能够解释观察到的AP振幅变化。为了验证这一假设，我们将细胞保持在大约−55 mV（范围为−55至−60 mV）的RMP，这是7周龄细胞的平均RMP，并应用与上述相同的电流脉冲来诱导AP。当保持在−55 mV时，6至7周之间AP成熟度的显著变化被消除(图2E类). 相反，在研究的整个7周期间观察到AP振幅逐渐增加，与4周时观察到的振幅相比，在7周和10周时发现的振幅明显更大（第4周，35.4±2.2 mV；第7周，46.0±2.8 mV；第一周，49.9±3.4；第页< 0.05). 这些数据表明，当神经元不保持超极化电位时，钠的可用性降低⁺6周龄细胞中的通道（与7周龄和10周龄细胞相比）。有趣的是，尽管6周龄和7周龄细胞的RMP没有显著差异，但这种情况还是发生了(表1). 此外，调整RMP后，在6周龄和7周龄细胞中观察到的AP半宽度显著降低(图2F类)(第页< 0.01). 因此，我们推断除了钠之外，还必须存在其他离子流⁺影响我们细胞中AP成熟的因素（见下文）。

纳⁺电流随着细胞成熟而增加

当细胞保持在−55和−60 mV之间时，AP振幅稳定增加，这表明随着培养时间的推移，RMP降低并不是影响AP振幅的唯一因素。因此，我们检查了Na的数量是否增加⁺通道也可能有助于AP振幅的增加。保持电位为−70 mV的电压阶跃可靠地诱发了大量快速激活的内向电流(图3艾岛)并被应用于细胞外溶液的TTX完全阻断(图3艾伊). 值得注意的是，当我们检查这些电流随时间的变化时，峰值之间没有显著差异我_纳如预期的6周和7周。然而，有增加的趋势我_纳在这两个时间点之间（见讨论），7周龄的细胞确实显著增大我_纳4周龄以上的神经元(图3B类,C)（第4周，n个= 39; 第7周，n个= 9;第页< 0.05). 4周龄细胞（填充条）和7周龄细胞的电流-电压图显示，在较老的培养物中，半最大电流向左偏移了约6 mV。这与之前的报告一致，这些报告表明，大鼠新皮质神经元的激活电压依赖性在我_纳从P3到P21(康明斯等人，1994年).

在单独的窗口中打开

图3。

峰我_纳在开发过程中增加。艾岛，快速失活电压门控内向电流是通过从−70 mV的保持电位从−50到50 mV的阶跃去极化激发的。艾伊，这些内向电流被TTX（1μ米).B类，汇总数据显示峰值我_纳分化过程中增加，7周后达到显著水平(*第页< 0.05). 误差条表示SEM。C,I–V型神经元分化4周（填充菱形）和7周（开放方形）后的峰值内向电流的关系。七周大的神经元显示更大的峰值我_纳在半最大电流中出现明显的（～6 mV）左移，而最大电流总是在0 mV时出现。

K（K）⁺当前变化与AP成熟度平行

确定K中的更改⁺电流有助于AP半宽度的改变和触发多个AP的能力，我们分析了当电压阶跃为−80 mV时，外向电流的响应。我们观察到两种不同的K⁺当前组件。第一种在86%的受试神经元中显示出快速失活的大外向电流(图4艾岛). 4-AP治疗阻断了外向电流的瞬态分量(图4艾伊)也可以通过预脉冲到更正的保持电位（−40 mV；数据未显示）来阻止，这表明我_A类钾电流(Nerbonne和Gurney，1989年;McCobb等人，1990年;Birnbaum等人，2004年). 瞬态向外电流可以通过从未处理的电流中减去4-AP处理的电流来隔离(图4Aiii公司). 剩余的持续电流存在于所有电池中，可减少12 m米茶(图4Aiv公司). 持续电流不受正向保持电位预脉冲的影响（数据未显示），这与持续整流的描述一致我_K（K）电流(Nerbonne和Gurney，1989年;McCobb等人，1990年).

在单独的窗口中打开

图4。

我_A类增加平行AP成熟度，而我_K（K）在整个成熟过程中减少。艾岛，一个代表性的轨迹，显示了由电压阶跃从−80 mV的保持电势引发的快速失活和持续输出电流。艾伊，4-AP（1米米)消除了快速灭活K⁺电流，留下持续的K⁺电流。Aiii公司，总K减去持续电流⁺电流隔离了瞬态K⁺电流。Aiv公司，浓度为12μ米TEA进一步降低了持续的K⁺电流。B类，总结数据表明瞬态K⁺电流密度在6到7周之间显著增加，并在分化10周前保持升高。C，持续K⁺电流密度在培养过程中随着时间的推移而稳定下降，并且在分化10周后显著降低(*第页< 0.05). 误差条表示SEM。

为了补偿细胞大小的变化，我们计算了最大K⁺两者的电流密度我_A类和我_K（K）与AP中的变化类似，我_A类分化6至7周时，密度显示振幅显著增加(图4B类)（第6周，n个= 7; 第7周，n个= 8;第页<0.05），然后保持不变，直到10周。不同于我_A类，持续我_K（K）分化过程中密度稳步下降，仅在电镀7周后才变得显著(图4C)（第4周，n个= 9; 第7周，n个= 7;第页< 0.05). AP特征在发育6至7周之间的相对突然变化与我_A类密度表明该K的发展起作用⁺当前AP成熟。

自发突触活动与星形细胞生长相关

除了产生AP外，神经元在神经网络中形成突触连接的能力也是功能成熟的一个组成部分。因此，我们检测了突触蛋白的定位以及神经元成熟4到10周时自发PSC的生成。在电镀后的前3周内（总共3-6周），突触蛋白synapsin-1广泛分布在细胞质和突起内(图5艾岛，箭头），很少沿着MAP2形成突触点⁺树枝晶(图5艾岛，箭头）。然而，突触蛋白-1点在以后的时间点发生了显著变化(图5艾伊)，从6周时的4.4±4.0%（三种培养物中有746个细胞）增加到9周时的85.7±3.0%(图6B类)（从四种培养物中计数403个细胞；第页< 0.05).

在单独的窗口中打开

图5。

内源性和外源性星形胶质细胞诱导突触蛋白定位并促进突触活动。艾岛在没有外源性星形胶质细胞的神经元中，突触蛋白-1（绿色）在分化6周后弥散分布在MAP2阳性神经元（红色）的细胞质中（箭头）。在−70 mV下保存的细胞的典型电压灯记录显示，这些细胞中没有自发PSC（见下文）。艾伊相反，在分化6周时，生长在单层星形胶质细胞上的神经元显示突触蛋白-1（箭头所示）和显著的PSC（下图所示）的点状定位。Aiii公司,Aiv公司9周后，两组均显示突触蛋白-1蛋白的标点定位（箭头）和显著的突触活动。Bi公司,Bii公司突触活性由AMPA受体介导的电流组成，这些电流被CNQX（100μ米)以及荷包牡丹碱（bic.）（50μ米).C总结数据显示，在星形胶质细胞（开放栅）上生长的1至3周内，显示突触活动的神经元明显多于在层粘连蛋白（填充栅*第页< 0.05). 在随后的时间点，当神经元被镀上或不镀上星形胶质细胞时，显示突触活动的细胞数量没有显著差异。比例尺，20μm。

在单独的窗口中打开

图6。

ACM诱导突触蛋白-1的早期定位。艾岛分化6周后，ACM培养的神经元在MAP2内主要表现为弥漫性突触-1染色⁺神经元（箭头），分化8周后变成点状(艾伊，箭头）。B类，ACM显著增加MAP2的百分比⁺分化6周后，点状突触蛋白-1染色的神经元与未经处理的培养物（6周-）相比。然而，这种影响明显小于直接接触星形胶质细胞的影响（6周以上）。到8-9周时，所有组的点状突触蛋白-1染色百分比相似。C同样，在分化6周后，ACM处理显著增加了每50μm树突的点状点数量，但没有达到与星形细胞直接接触相同的程度。D类.MAP2的平均数⁺分化6周后，ACM和星形胶质细胞直接接触增加了细胞体的树突*第页< 0.05; **第页< 0.01. 比例尺，20μm。误差条表示SEM。

为了研究观察到的突触蛋白定位增加是否与突触活动的发展相关，我们使用全细胞电压灯记录来监测自发突触电流。在培养的前6周，细胞没有显示任何自发的突触活动(图5艾岛,C). 在培养7周时，首次在40%的细胞中观察到自发的突触活动(图5C)(n个= 5). 有趣的是，这也是培养物中星形胶质细胞生长的时间点(图1我)以及观察到的突触蛋白-1的点状定位(图5艾伊). 在培养物中观察到两种自发事件：一种快速上升和下降的内向电流，被AMPA拮抗剂CNQX阻断(图5Bi公司)以及一个被GABA阻断的缓慢衰减的内向电流_A类拮抗剂荷包牡丹碱(图5Bii公司). 电流轨迹的负偏转(图5Bii公司)与在我们的记录条件下氯化物（−33 mV）去极化反转电位产生的氯化物介导电流一致（参见材料和方法）。

讨论

在当前的研究中，我们使用了一个已建立的系统，该系统可以有效地将hES细胞分化为神经上皮细胞(Zhang等人，2001年)以产生具有几乎一致的前脑身份的神经元。通过系统追踪起源于hES细胞源性神经上皮的神经元的功能成熟，我们提供证据表明，分化的人类神经元以时间依赖的方式逐渐获得基本的电生理特性，包括RMP的协调成熟，特征我_K（K）和我_纳和自发突触电流。我们还发现，hES细胞源性神经元培养物中的突触传递与星形胶质细胞分化在时间上相关。有趣的是，我们发现外源性星形胶质细胞可以显著加快突触活动的开始，尽管它们不会显著影响AP的发育。这些发现为未来对人类神经元功能成熟的研究奠定了基础。

形态学和组织学研究表明，mES细胞和hES细胞衍生的神经元显示出时间上不同的发育进程，这与解剖学研究密切相关。在mES细胞中，类似神经管的玫瑰花状结构在5天内（相当于妊娠期，8.5天）很明显，并在分化后7天内达到成熟[相当于怀孕期，10.5天(Ying等人，2003年)]. 这个时间类似于小鼠神经管的形成体内此外，小鼠的神经发生从皮层内的E11开始，并在出生后继续(拜耳，1991年)与许多实验室报告的mES细胞有丝分裂后神经元的生长很相似(贝恩等人，1995年;Lang等人，2004年;Miles等人，2004年)（S.C.Zhang，未发表的意见）。我们之前已经证明，hES细胞在分化2周后形成神经管状玫瑰花结(Zhang等人，2001年)考虑到hES细胞来源于1周龄的胚胎，这大约相当于妊娠第三周。玫瑰花结的形成与18天后神经沟的形成在时间上相关体内以及随后20天的口直肠轮廓(O'Rahilly，1999年). 在发育中的人类胚胎中，最近的证据表明，到31天时，有一群迁移的有丝分裂后神经元，这与前脑内明显存在的Cajal-Retzius细胞不同(Bystron等人，2006年)现在被认为是最早出生的神经元。这与胚胎干细胞在21天（相当于妊娠27天）时培养系统中神经元的生长密切相关。

令人惊讶的是，我们描述的人类神经元成熟的一些电生理特征反映了在动物研究中观察到的特征，并且可以从动物和人类妊娠期的时间差异中进行预测(Clancy等人，2001年). 在发育中的小鼠皮层从E14到P0的切片培养中，皮层板中能够激发AP的神经元百分比从31%增加到80%。同时，这些细胞中的AP持续时间从E14时的8.8 ms减少到P7时的3.7 ms(皮肯·巴里和穆迪，2003年). 我们分化的人类神经元需要4周的AP持续时间才能从6.9毫秒减少到2.3毫秒，并且直到10周才能观察到重复的AP序列在体外（与小鼠ES细胞衍生神经元的9天相比）。在功能上，分化的神经元在7周时开始释放AP，这与7至8周时发育中的人类胎儿内自发抽搐的最早迹象相吻合(Birnholz等人，1978年). 总之，这些数据表明，成熟的内在时间模式得到了保留在体外(Zhang等人，2001年,张，2006). 因此，除了其可能的治疗潜力外，hES细胞还为我们提供了第一个研究早期人类神经功能发育的可用系统。

虽然钠和钾电流的传统作用在hES细胞源性神经元中保持不变我_A类似乎在AP复极中起主导作用。我_纳发现在分化的前7周内逐渐增加，类似于啮齿动物神经元、mES细胞源神经元的切片记录以及对人类神经元的有限研究中的变化(Gao和Ziskind-Conhaim，1998年;Piper等人，2001年;Benninger等人，2003年,皮肯·巴里和穆迪，2003年). 我们也证明了这一点我_纳与RMP相结合，似乎在AP振幅中起着重要作用，这与以前的报道一致(霍奇金和赫胥黎，1952年). 尽管我_K（K）密度总是大于我_纳AP半宽度减少的同时我_A类，表明我_A类是AP成熟的主要因素(图1E类,F类). 每种电流占总电流的相对比例我_K（K）这并非完全出乎意料，因为发育过程中钾电流的变化在大脑区域和神经元亚型之间差异很大(艾哈迈德，1988年;韦斯特布鲁克和凯尼恩，1990年;Beck等人，1992年;Spigelman等人，1992年;劳彻和德莱尔，1994年;Gao和Ziskind-Conhaim，1998年;Reiff和Guenther，1999年;Nakamura等人，2001年;邓等人，2004).

有趣的是，我们观察到的一些电流可能会受到培养条件的调节。最近的一份报告Goetz等人（2006）证明层粘连蛋白（用于本研究）和纤维连接蛋白底物可以不同地影响我_纳以及我们和其他人归因于的重复AP发射我_A类电流(康纳和史蒂文斯，1971年;奈尔，1971年;1987年风暴;Kang等人，2000年). 他们继续表明，底物可以改变培养物中神经元亚型的组成，由此产生了一个有趣的想法，即不同神经元亚型与ES细胞的分化可能产生具有不同（和适当）生理特征的神经元。目前正在进行利用基因操纵来确定特定神经元亚型以进行电生理表征的研究。

虽然神经元的基本电生理特性是在星形胶质细胞发育之前获得的，但突触活动的开始与星形胶质细胞与人胚胎干细胞的分化有关。这与发育中的啮齿类动物中星形胶质细胞的平行出现和第一波突触发生有着惊人的相似之处(Slezak和Pfrieger，2003年).体外使用多种神经元细胞类型的研究表明，神经元与星形胶质细胞的共培养增强了突触发生(Pfrieger和Barres，1997年;Ullian等人，2001年,2004年a;Christopherson等人，2005年;Steinmetz等人，2006年). 在这里，我们表明内源性星形胶质细胞分化与突触蛋白的定位和PSC的发病有关。此外，外源性星形胶质细胞增加了早期突触蛋白的定位和PSCs的发生，而不改变发育中神经元的放电特性。有趣的是，ACM已经被证明对自发突触电流的发生率和频率有不同的影响，从没有变化(Christopherson等人，2005年)微型EPSC频率增加至23倍(Pfrieger和Barres，1997年). 在我们发展中的神经元培养中，ACM表现出适度的反应，显著增加了突触蛋白的定位，而对PSC的发生率没有影响。在视网膜神经节细胞培养中，ACM的一种成分胆固醇可以增加突触发生(Mauch等人，2001年)，这是由树枝状树枝状化增加引起的影响(Goritz等人，2005年). 我们发现，ACM增加树突状树枝状结构的程度与直接接触星形胶质细胞的程度相同。因此，尽管星形胶质细胞分泌因子可能影响我们细胞中的突触发生，但我们认为非分泌因子在增加突触蛋白定位和发育hES细胞源性神经元的突触活性方面起着主要作用。这些结果之间的差异可能归因于物种差异或研究之间发育阶段的差异。

目前的研究建立在先前证据的基础上，证明hES细胞向神经谱系的细胞和功能分化在体外利用人类胎儿组织进行的镜像解剖学研究。此外，这些数据与动物模型的功能分析密切一致，表明hES细胞的神经分化是研究人类早期神经发育的现实工具。使用该模型，我们表明，一旦细胞选择神经元命运，神经元的基本属性，如膜电位、AP特性和离子电流，很可能受到内在调节，而突触传递可能会受到星形胶质细胞的显著影响。星形胶质细胞促进突触传递的发现可能对开发将未成熟神经元移植到成人大脑环境的最佳方法具有实际意义。

脚注

工具书类