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EMBO J。2009年8月19日；28(16): 2414–2427.
2009年7月23日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2009.196
PMCID公司：PMC2735177型
PMID：19629036

A型层粘连蛋白在端粒生物学和DNA损伤反应途径中的新作用

伊格纳西奥·冈萨雷斯-苏雷斯,1,* Abena B红木,1,* 斯蒂芬妮·M·珀金斯,1 巴特·弗莫伦,2 丹尼尔·利奇滕斯·斯泰金（Daniel Lichtensztejin）,三 大卫·A·格罗茨基,1 露西娅·莫尔加多·帕拉辛,1 埃里克·加普德,4 巴里·P·斯莱克曼,4 特蕾莎·沙利文,5 朱利安·塞奇,6 科林·斯图尔特,5,7 萨宾·迈,三和苏珊娜·冈萨洛1,一
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补充资料

摘要

A型层粘连蛋白是中间丝蛋白，为调节核结构和功能的蛋白质复合体提供支架。中的突变LMNA公司该基因与多种称为层粘连病的退行性疾病有关，而层粘连蛋白表达的变化与肿瘤发生有关。受A型层粘连蛋白改变影响的分子途径及其如何导致疾病尚不清楚。在这里，我们表明，A型层粘连蛋白在维持端粒结构、长度和功能以及稳定53BP1（DNA损伤反应（DDR）通路的一个组成部分）方面起着关键作用。A型层粘连蛋白的缺失改变了端粒的核分布，导致端粒缩短、端粒异染色质缺陷和基因组不稳定性增加。此外，A型层粘连蛋白对于通过非同源末端连接（推测是通过稳定53BP1）处理功能失调的端粒是必要的。本研究显示了A型层粘连蛋白在维持基因组完整性方面的新功能，并提示端粒生物学的改变和DDR中的缺陷有助于层粘连相关疾病的发病机制。

关键词：A型层粘连蛋白、DNA损伤反应、基因组不稳定性、核组织、端粒

介绍

几项研究表明，基因组的3D组织代表了基因组功能的额外调节水平(Misteli，2007年;德查特等, 2008). 尤其是核外围被视为积极参与基因转录和DNA修复的一个隔室(Therizols公司等, 2006;梅凯尔等, 2008;长井等, 2008). A型层粘连蛋白是构成核膜和核质网络的中间丝蛋白，是核结构的关键决定因素，为核功能的组织提供了支架(塔代伊等, 2004;德查特等, 2008). 因此，A型核纤层蛋白在DNA复制和修复、基因转录和沉默、核孔复合体定位、染色质重塑和有丝分裂期间核膜破裂中的作用已被提出(高盛等, 2002;格林鲍姆等, 2005). 然而，A型核纤层蛋白的改变与基因组功能调控之间的因果关系以及所涉及的分子机制仍不明确。阐明这些蛋白质的功能是一个热门话题，因为LMNA公司基因与各种称为椎板病的退行性疾病有关(布勒斯等, 2006;Capell和Collins，2006年). 此外，A型层粘连蛋白表达的变化与不同类型的人类肿瘤有关(阿格列罗等, 2005;普罗科西默等, 2006;威利斯等, 2008).

大多数关于A型层粘连蛋白功能的可用数据来自对人类细胞或小鼠模型的研究LMNA公司基因，尤其是前体(Mounkes和Stewart，2004年;瓦雷拉等, 2005;斯图尔特等, 2007). 常见特征包括核形态异常、异染色质紊乱、DNA损伤反应（DDR）通路和DNA修复缺陷(线路接口单元等, 2005;Capell和Collins，2006年). 特别是，对DNA损伤的敏感性增加与DNA损伤传感器53BP1延迟招募到γ-H2AX标记的DNA修复病灶以及Rad 51病灶的缺陷形成有关(线路接口单元等, 2005). 总的来说，这些数据表明基因组不稳定性的增加有助于LMNA公司基因。

基因组不稳定性增加也是导致肿瘤发生的已知因素。虽然A型层粘连蛋白突变形式的表达与人类或小鼠肿瘤易感性的增加无关，但在不同类型的人类肿瘤中观察到A型层黏连蛋白表达的改变(阿格列罗等, 2005;普罗科西默等, 2006,2009;威利斯等, 2008). 这个LMNA公司敲除小鼠提供了对A型核纤层蛋白丢失的细胞后果的见解(沙利文等, 1999).Lmna公司−/−细胞出现核膜改变，核外周异染色质丢失，两个肿瘤抑制蛋白家族成员（视网膜母细胞瘤（Rb）和ING家族）的栓系和稳定缺陷-(约翰逊等, 2004;汉族等, 2008). 总的来说，这些发现表明突变与沉默的共同以及不同的功能后果LMNA公司基因，A型层粘连蛋白的丢失与不受控制的增殖有关。A型层粘连蛋白的丢失对维持基因组稳定性的机制的影响尚不清楚。

DNA修复和DDR途径的缺陷以及端粒生物学的改变是癌症和衰老中基因组不稳定的主要原因。端粒是保护线性染色体末端的异色结构，对保持染色体完整性和控制细胞增殖至关重要(布莱克本，2001年;德兰格，2002年). 端粒DNA重复序列的最小长度和端粒结合蛋白的适当补充是保持端粒功能所必需的(线路接口单元等, 2004;德兰格，2005a). 此外，端粒异色结构的获得对于维持端粒长度的同型性至关重要(布拉斯科，2007). 有证据表明，A型层粘连蛋白与衰老、癌症以及细胞水平上的异染色质调节有关，研究人员认为端粒生物学的改变可能与层粘连病的表型有关。

关于a型层粘连蛋白在端粒生物学中作用的最佳证据是，Hutchinson–Gilford早衰综合征（HGPS）成纤维细胞的端粒磨损速度快于正常细胞(奥尔索普等, 1992;黄等, 2008). HGPS成纤维细胞也存在构成性异染色质特征的表观遗传标记缺陷，例如组蛋白H3在赖氨酸9（H3K9me3）处的三甲基化减少，组蛋白H4在赖氨酰20（H4K20me3）处三甲基化增加。然而，对着丝粒和端粒等特定结构域的影响尚不清楚(Scaffidi和Misteli，2006年;Shumaker公司等, 2006). 进一步证明a型层粘连蛋白和端粒之间存在串扰的证据是，表达层粘连a突变体的人成纤维细胞的增殖缺陷被端粒酶挽救(库德洛等, 2008)，并且导致衰老的核纤层的改变与核外周端粒的聚集有关(拉兹等, 2008).

为了了解A型层粘连蛋白在端粒生物学中的作用，我们确定了A型层黏连蛋白的缺失对端粒的核分布以及端粒结构、长度和功能的维持的影响。使用Lmna公司敲除小鼠成纤维细胞模型(沙利文等, 1999)，我们为A型层粘连蛋白在细胞核内端粒3D分布中的重要作用提供了证据。随着A型层粘连蛋白的丢失，端粒核区隔的改变伴随着端粒缩短、端粒染色质结构缺陷和基因组不稳定性的增加。此外，我们发现A型层粘连蛋白是通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径处理功能失调端粒所必需的。有趣的是，A型层粘连蛋白的丢失导致53BP1的细胞水平显著降低，53BP1是一种参与双链断裂修复的检查点蛋白，最近被NHEJ牵连到功能失调的端粒的处理中(季米特洛娃等, 2008). 总的来说，这项研究显示了A型层粘连蛋白通过参与维持端粒和53BP1稳定性在维持基因组稳定性方面的新功能。这些发现表明，端粒生物学的改变和DDR通路的缺陷可能与层粘连相关疾病的表型有关，特别是那些以A型层粘连功能丧失为特征的疾病。

结果

A型层粘连蛋白的缺失导致端粒核分布的改变和端粒缩短

端粒定位的3D分析表明，哺乳动物的端粒在细胞周期的G0/G1/S期分布于整个核体积，而在G2期，端粒在细胞核中心聚集成一个端粒盘(创等, 2004). 确保哺乳动物端粒正确核定位的分子机制及其在端粒代谢中的相关性尚不明确。有趣的是，肿瘤细胞中端粒的3D定位发生了改变(创等, 2004;Mai和Garini，2006年)以及核纹层有缺陷的衰老细胞(拉兹等, 2008)这表明端粒的核分布与衰老和永生期间观察到的端粒代谢变化之间存在关系。

为了确定A型层粘连蛋白是否在端粒的核分隔中起作用，我们比较了野生型和野生型之间端粒的细胞核分布(Lmna公司+/+)小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和不含A型层粘连的MEFs(Lmna公司−/−). 在自发绕过衰老并长生不老后分析MEF。我们进行了3D端粒荧光就地杂交后进行定量分析以监测端粒分布（参见补充数据). 端粒到核边缘的距离是使用TeloView程序确定的（参见Vermolen公司等, 2005和图1A).图1B显示了两种基因型之间端粒分布的明显差异，随着a型核纤层蛋白的丢失，端粒定位向核外周转移。通过计算端粒强度的累积分布(图1C)我们发现，在这两种基因型中，大约20%的端粒信号位于细胞核的最边缘（⩽0.4μm）。然而，尽管剩余的80%端粒Lmna公司−/−细胞在距边缘1.75μm处聚集，端粒位于Lmna公司+/+MEF在整个核质中膨胀，直至核中心（2.75μm）。这些结果清楚地表明，A型核纤层蛋白参与端粒在整个核体积中的正确分布，随着A型核纤维蛋白的丢失，端粒向核外周和远离核中心的分布发生了显著变化。荧光激活细胞分类分析Lmna公司+/+和Lmna公司−/−永生化成纤维细胞表明端粒分布的改变并不是由于基因型之间的细胞周期差异所致(补充图1). 此外，使用层粘连蛋白A/C抗体进行的染色质免疫沉淀（ChIP）检测显示层粘连分子与端粒结合(补充图2B)这表明端粒与层粘连支架的连接可能会调节其核分布。

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端粒核分布的变化Lmna公司−/−细胞。(A类)核的代表性重建图像Lmna公司+/+和Lmna公司−/−使用荧光端粒探针进行3D FISH后的MEFs。DAPI复染色显示为蓝色。显示了三维核空间中的端粒分布。(B类)端粒信号强度相对于信号与细胞核边缘距离的分布图。积分强度表示距离边缘⩽一定距离处所有端粒的总强度x个注意端粒分布向外围和远离中心的变化Lmna公司−/−MEF公司。(C类)累积分布函数（CDF）显示了与核边缘距离相关的积分强度。积分强度定义为：（距离边缘⩽处端粒的总强度x个)/（所有端粒的总强度）。在细胞核的边缘，两种基因型之间的端粒池没有变化。相反，在Lmna公司−/−MEF，与Lmna公司+/+MEF公司。进行了三次3D FISH。85个细胞核的端粒Lmna公司−/−MEF和81个核Lmna公司+/+对MEF进行了分析。

为了确定A型层粘连蛋白丢失后端粒分布的改变是否伴随着端粒代谢的改变，我们比较了多组Lmna公司−/−和Lmna公司+/+早期传代MEF（前基因）。关于进行末端限制性片段（TRF）分析(加西亚-考等, 2002)，我们观察到所有五个细胞的端粒迁移更快Lmna公司−/−行与相比Lmna公司+/+线，表明a型层粘连蛋白丢失导致端粒中度但高度一致的缩短(图2A). 这些结果通过定量荧光得到证实现场使用端粒探针进行中期细胞核杂交（Q-FISH）(加西亚-考等, 2002). 我们发现端粒的平均长度Lmna公司+/+各品系的端粒长度在37.6~40.8kb之间，平均为39.0kb。所有五行Lmna公司−/−MEF的平均端粒长度低于任何一种Lmna公司+/+端粒平均长度为34.6kb(图2B). 为了确定这些差异是否具有统计学意义，我们对t吨-将每个细胞系的平均值作为其中一个的独立样本进行测试Lmna公司−/−或Lmna公司+/+基因型。我们发现这两种基因型的平均端粒长度有显著差异(P（P）=0.0003). 此外，来自成人成纤维细胞的TRF分析Lmna公司−/−小鼠表现出更明显的端粒缩短表型(图2C). 为了测试A型层粘连蛋白的急性耗竭是否也会导致端粒磨损，我们以携带特定于A型层黏连蛋白耗竭（shLmna）的shRNA或特定于荧光素酶的shRNA的构建物为对照，慢病毒转导野生型MEF。使用shLmna的转导导致检测不到层粘连蛋白A/C的水平(图2D). 在这些细胞中进行的Q-FISH分析显示，在培养的细胞仅传代五代后，端粒长度显著缩短(图2E). 总之，这些数据表明，A型层粘连蛋白在维持端粒长度均匀性方面起着关键作用。

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A型层粘连蛋白丢失后端粒长度维持不良。(A类)几个独立基金会的代表性分析Lmna公司+/+（1-4）和Lmna公司−/−（A–E）早期传代的MEF行（第3–5段）。注意端粒的快速迁移Lmna公司−/−与比较时的行数Lmna公司+/+线，表明端粒缩短。(B类)端粒长度分布（以平均值±s.d.表示）Lmna公司+/+（1-4）和Lmna公司−/−Q-FISH确定的（A-E）MEF。显示了每个样本的单个值。Q-FISH进行了三次。对于每个实验，每个MEF线至少分析20个中期。注意所有Lmna公司−/−MEF系的端粒长度比Lmna公司+/+控制。(C类)成人成纤维细胞的TRF分析Lmna公司+/+和Lmna公司−/−小鼠表现出更快的迁移，因此，端粒在A型层粘连蛋白丢失时明显缩短。(D类)Western blot检测野生型MEF慢病毒转导过程中层粘连蛋白A/C的水平，构建物携带层粘连肽A和C特异性shRNA（shLmna）或shLucif对照。(E类)Q-FISH分析测量A型层粘连蛋白耗竭后MEF的端粒长度（比较shLmna和shLucif）。注意，培养细胞仅传代五代后，A型层粘连蛋白耗竭时端粒长度减少。*代表P（P）-统计显著性值。

端粒长度同源性主要由端粒酶维持(布莱克本等, 2006). 此外，庇护蛋白复合蛋白，特别是TRF1和TRF2，调节端粒长度(斯莫戈泽夫斯卡等, 2000;穆尼奥斯等, 2005). 为了进一步研究端粒缩短表型Lmna公司−/−MEF，我们评估了A型层粘连蛋白的丢失是否影响这些调节机制。我们发现端粒酶活性在Lmna公司+/+和Lmna公司−/−MEF公司(补充图2A). 此外，ChIP分析显示，基因型之间TRF1和TRF2的端粒结合水平没有可检测到的变化(补充图2B). 我们的结果表明，端粒长度均一性的这些已知调节因子的结合不受A型层粘连蛋白丢失的影响。然而，我们不能排除端粒酶对端粒的可及性，或与端粒代谢有关的其他因素的结合，特别是与端粒复制有关的因素，都受到A型层粘连蛋白丢失的影响。

A型核纤层蛋白的缺失导致端粒染色质结构的改变

端粒异色结构的维持对端粒长度均匀性很重要(贡萨洛等, 2005,2006). HGPS患者和表达前体蛋白的老年人成纤维细胞的一个共同特征是组成异染色质的组蛋白标记的改变(Scaffidi和Misteli，2006年;Shumaker公司等, 2006)虽然对端粒的影响尚不清楚。为了研究A型层粘连蛋白的丢失是否影响端粒异染色质的组装，我们使用识别公认异染色斑标记H3K9me3和H4K20me3的抗体进行了ChIP分析。虽然我们发现H3K9me3水平没有变化，但我们观察到端粒H4K20me3水平在Lmna公司−/−MEF公司(图3A). 这些结果表明，A型层粘连蛋白参与维持具有端粒异染色质特征的组蛋白标记。有趣的是，这些缺陷是由中心周围异染色质引起的(图3B)支持A型层粘连蛋白功能的改变影响组成异染色质的表观遗传状态的观点(Shumaker公司等, 2006). 尽管如此，这里报道的变化与HGPS细胞中描述的变化不同，这表明基因突变或沉默的不同功能含义LMNA公司基因。表观遗传缺陷Lmna公司−/−western blot分析证实了MEF，表明全球H4K20me3水平显著降低，而H3K9me3水平没有变化(图3C).

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端粒异染色质结构的改变Lmna公司−/−MEF公司。(A类)用识别异色标记H3K9me3和H4K20me3的抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。将免疫沉淀的DNA与端粒探针杂交。注意H4K20me3的显著减少Lmna公司−/−在这个领域的一个典型实验中。下图显示了四个独立实验中输入信号归一化后免疫沉淀端粒重复序列的量化。(B类)将免疫沉淀DNA杂交到识别中心周围异染色质主要卫星重复序列特征的探针。该图显示了在三个独立实验中对输入信号进行归一化后，主要卫星重复信号的量化。请注意，H4K20me3的减少是由着丝粒周围异染色质引起的。(C类)用蛋白质印迹法监测从细胞裂解液中酸提取组蛋白后H3K9me3和H4K20me3的全球水平Lmna公司+/+和Lmna公司−/−MEF公司。免疫印迹显示H3K9me3水平没有变化，但随着a型层粘连蛋白的丢失，全球H4K20me3水平显著下降。(D类)总RNA来自Lmna公司+/+和Lmna公司−/−细胞被分离，用凝胶电泳分离，并用端粒探针进行northern印迹，以监测a型层粘连丢失时TERRAs水平的变化。与28S核糖体RNA特异探针杂交显示，从两种细胞系（底部面板）分离出的RNA水平相当。RNase A处理作为RNAs纯度的对照。该图显示了在三个独立实验中归一化到28S水平后TERRA水平的量化。注意TERRA水平的下降Lmna公司−/−关于Lmna公司+/+MEF公司。(E类)TERRA密度的量化Lmna公司+/+,Lmna公司−/−和缺乏一个、两个或三个Rb家族成员的MEFs。TERRA水平根据端粒DNA含量进行标准化，以纠正端粒长度的差异（参见补充图4). 注意，与野生型相比，Rb缺乏型MEF中每个端粒DNA含量的TERRA水平增加。相反，Lmna公司−/−MEF显示TERRA密度显著下降。横线表示标准误差。*代表P（P）-统计显著性值。R.U.代表相对单位。

最近，端粒异染色质的新成分被鉴定出来。这些是非编码端粒RNA（TERRAs或TelRNAs），由DNA-dependent RNA聚合酶II转录(阿扎林等, 2007;Schoeftner和Blasco，2008年). 虽然TERRA在端粒代谢中的作用尚不清楚，但不同的证据表明TERRA可能抑制端粒酶活性(卢克等, 2008;Ng公司等, 2009). 事实表明，A型层粘连蛋白的改变会影响RNA pol II定向转录(古玛兰等, 2002;斯潘等, 2002)，促使我们评估TERRA水平的维持是否受到损失的影响。我们观察到Lmna公司−/−MEF公司(图3D)这表明，A型层粘连蛋白的缺失要么抑制了TERRA的RNA pol II定向转录，要么改变了其稳定性。总之，我们的数据表明，A型层粘连蛋白通过稳定H4K20me3和维持TERRA水平，在端粒异染色质的组装中发挥作用。

我们之前已经证明，H4K20me3在端粒的稳定需要组蛋白甲基转移酶Suv4-20h1和Suv4-20 h2以及Rb家族成员的作用(Gonzalo和Blasco，2005年;贝内蒂等, 2007). 此外，Rb家族成员是转录调节因子，可以推测其调节TERRA的转录。鉴于A型层粘连蛋白有助于稳定Rb家族成员(约翰逊等, 2004)，我们假设端粒染色质结构缺陷导致A型层粘连丢失是由于Rb缺乏。我们确认，我们的Lmna公司−/−MEF管线(补充图3)表明端粒H4K20me3水平较低，至少部分原因是Rb家族功能降低。然而，我们不能排除Suv4-20h1/h2 HMTase活性降低在A型层粘连蛋白丢失时也会导致这种表型。接下来，我们测试了Rb家族功能的降低是否也可能是A型层粘连丢失导致TERRA水平降低的原因。我们监测了Rb家族缺陷MEF的TERRA水平(卢比−/−,卢比−/−第107页−/−在此DKO，以及卢比−/−第107页−/−第130页−/−此处为TKO）。有趣的是，我们发现在失去一个、两个或三个Rb家族成员时，TERRA水平增加(补充图4A). 控制Rb缺乏MEF端粒长度的差异(补充图4B)，我们将TERRA水平标准化为端粒DNA序列(补充图4C). 值得注意的是，虽然A型层粘连蛋白的丢失导致每个端粒DNA重复序列的TERRA水平降低，但在所有Rb缺乏的MEF中观察到TERRA密度的类似增加(图3E)表明Rb功能降低不能解释Lmna公司−/−MEF公司。因此，我们的研究结果表明，A型层粘连蛋白通过Rb依赖和Rb非依赖机制在端粒异染色质组装中发挥作用。

有趣的是，Rb缺乏、H4K20me3水平降低和TERRA水平降低与端粒延伸表型一致(加西亚-考等, 2002;贡萨洛等, 2005;贝内蒂等, 2007;Schoeftner和Blasco，2008年和补充图4B). 尽管Rb和H4K20me3缺乏，但A型层粘连蛋白的丢失导致端粒缩短，这一事实增加了A型层黏连蛋白在这些情况下对端粒延长具有积极作用的可能性。总之，这里描述的端粒染色质结构的改变不能解释在A型核纤层蛋白丢失时观察到的端粒缩短表型。这种表型可能是由于a型层粘连蛋白丢失后核结构的改变而导致的染色质结构和DNA代谢的更全面的缺陷。

A型层粘连蛋白缺失对端粒功能和基因组稳定性的影响

我们评估了上述端粒核分布、端粒长度和端粒染色质结构的变化是否转化为端粒功能障碍和基因组不稳定性。我们测定了端粒信号（无信号末端）的丢失，染色体/染色单体断裂和端到端融合的频率，以及前基因非整倍体的存在Lmna公司−/−和Lmna公司+/+MEF公司(图4和补充图5). 我们发现无信号端的数量增加了三倍(图4A和补充图5A)休息时间增加了两倍(图4B和补充图5B)英寸Lmna公司−/−MEF，表明基因组不稳定性增加。这一发现得到了表现为基础DNA损伤的细胞核数量增加的支持，如在a型核纤层蛋白丢失时表现为γ-H2AX标记病灶的细胞数量增加了两倍(图4C).

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A型核纤层蛋白的缺失影响基因组稳定性。(A类)不同行中无信号末端的中期百分比的量化Lmna公司+/+（1-4）和Lmna公司−/−（A–E）MEF。注意无信号端增加了三倍Lmna公司−/−MEF公司。(B类)染色体和/或染色单体断裂的中期百分比的量化。在Lmna公司−/−线。(C类)出现>5γH2AX标记DNA修复病灶的细胞百分比的量化。注意基底损伤的增加Lmna公司−/−MEF公司。图表显示了至少三个独立实验的结果。横线表示标准误差。(D类)对100多个中期的核型分析表明，中期数量明显增加，染色体数目异常Lmna公司−/−MEF公司。(E类)数量和百分比的量化Lmna公司+/+和Lmna公司−/−通过抗γ微管蛋白抗体标记，MEF呈现两个以上的中心体。*代表P（P）-统计显著性值。

在正常细胞中，姐妹染色单体端粒之间的不适当重组可能导致一个端粒变长，而另一个端粒却变长(贝利等, 2004;劳德等, 2005). 为了测试涉及端粒重复序列的异常重组是否有助于端粒信号的丢失Lmna公司−/−MEF，我们进行了染色体定向荧光就地杂交（CO-FISH）(贝利等, 2004). 这种技术允许对端粒的领先和滞后链进行差异标记。在端粒序列之间没有重组事件的情况下，每个染色体末端只有一个端粒被超前或滞后链探针标记。如果发生重组，标记会在两个姐妹端粒之间分裂，从而产生带有超前和滞后链探针标记的端粒。CO-FISH结果表明，A型层粘连蛋白的丢失不会导致涉及端粒的重组事件的频率增加(补充图6). 因此，替代机制是导致A型层粘连蛋白丢失后端粒信号丢失增加的原因。

此外，核型分析显示，染色体剂量异常的中期数目增加Lmna公司−/−MEF公司(图4D). 早期研究表明，Rb家族功能降低导致非整倍体，部分原因是中心体复制缺陷(奥维诺等, 2006). 为了测试A型层粘连蛋白的缺失是否影响中心体复制控制，我们在Lmna公司+/+和Lmna公司−/−利用γ-微管蛋白抗体进行免疫荧光。我们的结果表明出现中心体扩增的细胞数量增加(图4E). 因此，A型层粘连蛋白的缺失导致非整倍体，至少部分是由于中心体复制周期的放松。总的来说，这些结果表明A型核纤层蛋白丢失后基因组不稳定性增加。

A型层粘连蛋白参与NHEJ对功能失调端粒的处理

令人惊讶的是，尽管端粒缩短，无信号末端的频率增加，但我们发现染色体端到端融合的中期百分比在Lmna公司−/−MEF公司(补充图5C). 我们假设，A型层粘连蛋白的丢失可能会阻碍NHEJ DNA修复途径对功能失调端粒的识别和/或处理。为了验证这个假设，我们进行了逆转录病毒转导Lmna公司+/+和Lmna公司−/−端粒结合蛋白TRF2（TRF2）显性负突变的MEFΔBΔM)在NHEJ修复通路完整的情况下，导致端粒功能障碍和染色体端到端融合(斯莫戈泽夫斯卡等, 2002;里哈等, 2006和图5A). TRF2表达导致端粒完整性缺失ΔBΔM导致端粒处形成DNA损伤灶，称为TIF（端粒功能障碍诱导灶）(高井等, 2003;德兰格，2005年b). The ability ofLmna公司−/−MEF在表达TRF2后形成TIFΔBΔM通过使用γ-H2AX抗体和端粒探针进行免疫-FISH评估。TRF2的表达ΔBΔM导致γ-H2AX标记TIF的形成Lmna公司+/+中小企业和Lmna公司−/−MEF公司(图5B和补充图7)这表明检测功能异常端粒的初始步骤在A型核纤层蛋白缺失时是完整的。相反，我们发现NHEJ对功能失调端粒的处理受到A型层粘连蛋白丢失的阻碍。在Lmna公司+/+MEFs，TRF2的表达ΔBΔM导致大约50%的中期染色体融合，与以前的报道一致(斯莫戈泽夫斯卡等, 2002和图5C). 相反，我们发现Lmna公司−/−MEF表示TRF2的等效水平ΔBΔM(图5A和C). 这些结果表明，端粒功能异常的NHEJ依赖于A型层粘连蛋白的表达。

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A型层粘连蛋白的缺失通过非同源末端连接阻碍了功能失调端粒的处理。(A类)带有TRF2和肌动蛋白抗体的蛋白质印迹显示TRF2的表达水平相似ΔBΔM蛋白质Lmna公司+/+和Lmna公司−/−MEF公司。GFP逆转录病毒转导为阴性对照。(B类)使用端粒PNA探针（红色）和γ-H2AX特异性抗体（绿色）的免疫-FISH。图像显示了Lmna公司+/+和Lmna公司−/−MEF根据TRF2的表达形成TIFΔBΔM. (C类)染色体端到端融合中期百分比的量化Lmna公司+/+和Lmna公司−/−TRF2逆转录病毒转导前后的MEFsΔBΔM图中显示Lmna公司−/−TRF2表达的MEFΔBΔM与…相比Lmna公司+/+MEF公司。该图表示TRF2的示例ΔBΔM-诱导染色体端到端融合Lmna公司+/+MEF公司。逆转录病毒转导三次，FISH分析四次。横线表示标准误差。*代表P（P）-统计显著性值。

A型层粘连蛋白稳定53BP1蛋白水平

与双链断裂类似，功能失调的端粒激活DDR途径(高井等, 2003). 据报道，A型核纤层蛋白的缺失会影响核因子的稳定性，如Rb家族成员和ING1(约翰逊等, 2004;尼塔牌手表等, 2006;汉族等, 2008). 为了深入了解DDR过程中可能受到A型层粘连蛋白丢失影响的具体步骤，我们测试了DDR通路关键成分的细胞水平是否可以在Lmna公司−/−MEF公司。首先，我们监测了H2AX、γH2AX和53BP1的水平，它们在感知功能失调的端粒中具有作用(高井等, 2003). 尽管我们发现A型层粘连蛋白丢失后H2AX水平没有差异，但我们证实Lmna公司−/−MEF，表明A型核蛋白丢失后基础DNA损伤增加。此外，我们观察到53BP1在Lmna公司−/−MEF与Lmna公司+/+单元格(图6A). 免疫荧光证实53BP1水平降低。如所示图6B，53BP1抗体的标记强度在Lmna公司−/−关于以下方面的MEFLmna公司+/+在相同的暴露条件下。然后，我们测试了参与DDR和DNA修复的其他因素的稳定性是否也受到A型层粘连丢失的影响。比较两组间MDC1、ATM、DNA-PK、Mre11、Nbs1、Ku70和ERCC1的细胞水平Lmna公司+/+和Lmna公司−/−MEF公司(图6C). 我们发现两种基因型之间所有这些因素的水平没有明显差异。此外，在端粒具有关键结构功能的蛋白TRF1、TRF2和POT1的全球水平没有发现变化(图6D). 这些结果表明，A型层粘连蛋白的丢失优先影响53BP1。有趣的是，shLmna对A型层粘连蛋白的急性消耗也显著降低了53BP1水平(图6E). 最重要的是，将层粘连蛋白A、层粘连蛋白质C或两种层粘连物质A/C重新引入A型层粘连缺失细胞后，53BP1的水平得以恢复，这表明层粘连蛋白酶A和C能够稳定53BP1细胞的水平。

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A型层粘连蛋白稳定53BP1蛋白。(A类)蛋白质印迹显示细胞水平的因子参与最初的DNA损伤感测。H2AX水平没有变化，但在Lmna公司−/−中小微企业。请注意，在一个代表性印迹中，A型层粘连蛋白损失导致53BP1水平显著下降。(B类)53BP1抗体的免疫荧光证实53BP1水平下降Lmna公司−/−MEF公司。在相同的曝光时间下采集图像。(C类)Westerns blot显示，MDC1、ATM、DNA-PK、Mre11、Nbs1、Ku70和ERCC1的水平在A型纤层蛋白丢失时保持不变。用β-微管蛋白和Stat3进行免疫印迹，作为负荷的对照。(D类)庇护蛋白复合体成员的蛋白质，如TRF1、TRF2和POT1也保持不变。(E类)用shLucif和shLmna慢病毒转导野生型MEF后，Westerns印迹以耗尽A型层粘连蛋白（左两条通道），随后逆转录病毒转导以重建A型层黏连蛋白（右三条通道）。请注意，A型层粘连蛋白的急性耗竭如何降低53BP1水平（顶部）。重新引入层压板A和/或C（中间）后，53BP1水平恢复（顶部）。(F类)53BP1转录物丰度标准化为GAPDH转录物水平。显示了四个不同实验的平均值。(G公司)与载体（EtOH）、CHX或CHX和MG-132孵育的细胞进行免疫印迹以监测53BP1水平。请注意，蛋白酶体抑制剂拯救了53BP1水平。*表示蛋白质印迹中的非特异性条带。

为了确定这种DNA损伤传感器蛋白水平的降低是否是转录水平降低的结果，用定量PCR（Q-PCR）监测53BP1转录水平。如所示图6F在两种基因型之间，53BP1转录物的水平没有检测到差异，这表明A型层粘连蛋白的缺失会影响53BP1蛋白的稳定性。有趣的是Lmna公司+/+和Lmna公司−/−含蛋白酶体抑制剂MG132的MEF可挽救53BP1的水平，这与蛋白酶体途径在53BP1降解中的作用有关(图6G). 我们假设与Rb家族成员的报道类似(约翰逊等, 2004)，A型层粘连蛋白可能通过阻止蛋白酶体降解来稳定53BP1蛋白水平。最近，53BP1功能的丧失与NHEJ修复途径对功能失调端粒的缺陷处理有关。根据我们的研究结果，我们推测53BP1水平的下降可能是（至少在一定程度上）Lmna公司−/−MEF处理功能失调的端粒。

讨论

了解A型层粘连蛋白的细胞功能是一个非常热门的话题，因为它们在许多疾病状态中都有影响，包括层粘连病、衰老和癌症。尤其是，A型层粘连蛋白的表达减少正在成为导致肿瘤发生的一个因素(布勒斯等, 1993;阿格列罗等, 2005;普罗科西默等, 2006). 我们的结果表明，A型层粘连蛋白在维持端粒和基因组稳定性方面起着基本作用。我们发现，A型层粘连蛋白的丢失导致端粒生物学的多种改变：（i）端粒的核分解；（ii）端粒长度均一性的维持受损；（iii）端粒染色质结构的缺陷；以及（iv）NHEJ处理功能失调端粒的能力受到阻碍。此外，我们的结果揭示了DDR途径中a型层粘连蛋白的功能，即稳定53BP1蛋白水平。鉴于端粒生物学和DDR途径的改变是癌症和衰老的标志，我们设想，在这些过程中观察到的变化，在A型层粘连蛋白丢失后，有助于层粘连相关疾病的发病机制，特别是早衰综合征，如HGPS，以及以沉默LMNA公司基因。

各种证据表明，细胞核被分隔开，染色质空间组织的变化影响核功能(高盛等, 2002;格林鲍姆等, 2005;Misteli，2007年). 端粒分区对端粒功能的重要性已在酵母中清楚地显示出来(Akhtar和Gasser，2007年). 迄今为止，哺乳动物端粒核分布的机制尚待确定。此外，哺乳动物端粒的核定位如何影响端粒生物学尚不清楚。酵母中不存在的层蛋白可以直接与DNA和核心组蛋白结合，这使它们在将染色质连接到特定的亚核区中发挥重要作用(玻璃等, 1993;施蒂尔勒等, 2003). 我们的结果表明，A型层粘连蛋白与端粒相关，并有助于端粒的正确核定位。A型层粘连蛋白的丢失对端粒生物学的不同方面产生了深远的影响，这表明端粒的核分区可能是端粒代谢的基础。我们的结果并不表明端粒酶活性的变化、TRF1和TRF2的结合或异常重组是端粒缩短的原因Lmna公司−/−细胞。端粒酶和/或参与端粒代谢的活动的可及性可能因A型层粘连蛋白提供的核组织支架的破坏而降低。旨在阐明A型层粘连蛋白丢失对端粒复制的影响，以及其他庇护蛋白复合物成分或DNA修复因子与端粒结合的研究，将是理解端粒生物学变化背后机制的基础。

随着A型核纤层蛋白的丢失，端粒从核中心向周围定位的变化是令人感兴趣的。A型核纤层蛋白在核外周高度富集，在核质中也有发现(谢尔米勒等, 2008). 我们推断，A型层粘连蛋白的缺失可能导致端粒从细胞核外围脱离。相反，我们发现在没有A型层粘连蛋白的情况下，端粒的定位向核外周转移，这增加了核外周可能是端粒定位的默认途径的可能性。在这个模型中，A型层粘连蛋白在小鼠细胞的整个核质的端粒定位中起着积极的作用。最近的一项研究表明，衰老过程中核纤层的改变与核外周端粒聚集增加有关，这支持了这一模型(拉兹等, 2008). 肿瘤细胞是否沉默尚待研究LMNA公司该基因还表现出端粒划分和端粒结构、长度和功能的改变。这些类型的研究将提供对A型层粘连丢失后改变的机制的见解，这可能有助于肿瘤发生。

除了对端粒生物学的影响外，A型层粘连蛋白的缺失还会影响其他分子机制，如Rb和ING肿瘤抑制剂的稳定(约翰逊等, 2004;尼塔牌手表等, 2006;汉族等, 2008)和DNA损伤传感器53BP1（本研究）。这些机制可能有助于端粒表型Lmna公司−/−MEF和导致癌症和衰老的基因组不稳定性。我们的结果表明，Rb家族功能的降低可能是导致组蛋白修饰缺陷的原因Lmna公司−/−细胞。然而，我们发现端粒缩短表型和TERRA密度的降低与Rb无关。虽然TERRA在端粒生物学中的功能尚不明确，但观察到Rb家族缺陷导致这些新的端粒成分水平增加具有重要意义。TERRA密度的改变可能导致之前描述的Rb家族成员丢失后端粒代谢的改变。未来的研究需要解决TERRA和其他非编码RNA的调控是否是Rb家族肿瘤抑制功能的一部分。

先前的研究表明，突变的层粘连蛋白A亚型的表达会导致DDR的改变和修复缺陷，这意味着对DNA损伤剂的敏感性增加(线路接口单元等, 2005;Scaffidi和Misteli，2006年;迪马西等, 2008). 迄今为止，A型核纤层蛋白的完全缺失对DNA修复机制的影响尚不清楚。我们的结果表明，TRF2表达异常端粒导致的融合ΔBΔM需要A型层粘连蛋白，这是A型层黏连蛋白缺失和NHEJ修复缺陷之间的第一个环节。事实上LMNA公司该基因以前与NHEJ增加有关(线路接口单元等, 2005)这表明了A型核纤层蛋白突变和丢失之间的另一个功能差异。基因组不稳定性增加Lmna公司−/−MEF支持a型层粘连蛋白在DNA修复中的作用。鉴于最近的一项研究表明，53BP1的缺失抑制了NHEJ对功能失调端粒的处理(季米特洛娃等, 2008)，我们假设在A型层粘连蛋白丢失时发生的该蛋白失稳是观察到的表型的部分原因。与其他核因子类似，53BP1直接或通过层粘连相关蛋白与A型层粘连蛋白结合可能有助于其稳定性。53BP1的缺失限制了功能失调端粒在细胞核内的流动性，这一发现导致了53BP1在染色质动力学中发挥积极作用，促进了可能远离细胞核的功能失调端粒体的结合和融合(季米特洛娃等, 2008). 我们推测，A型层粘连蛋白可能为53BP1与功能失调端粒的关联提供了一个平台，并有助于功能失调端粒酶的流动性到达特定的亚细胞，在那里它们相互接触并与NHEJ修复因子接触。

材料和方法

细胞培养

Lmna公司+/+和Lmna公司−/−根据以下描述，在Colin L Stewart实验室中生成MEF和成人成纤维细胞沙利文等(1999)在Julien Sage（加利福尼亚州斯坦福大学）的实验室中生成了Rb家族缺陷的MEF。所有品系均在DMEM-Glutamax（Invitrogen）中保存，并添加10%的牛生长血清、抗生素和抗真菌药物。对于环己酰亚胺和蛋白酶体抑制剂处理，0.5×106细胞在含有10μg/ml环己酰亚胺、30μM MG-132（EMD生化制剂）或EtOH作为对照的培养基中培养6h。

ChIP分析

ChIP分析完全按照加西亚-考等(2004)使用以下抗体免疫沉淀染色质：抗H3K9me3（#07-442，Upstate）；抗H4K20me3（#07-463，上游）；抗TRF1（T1948，Sigma）；反TRF2（#05-521，上游）；或抗层粘连A/C（SC-6215，圣克鲁斯）。免疫沉淀DNA在Hybond N上进行slot-blot+并与端粒探针（美国纽约州洛克菲勒大学T de Lange赠送）或主要卫星探针杂交。使用ImageQuant软件（分子动力学）对信号进行量化。对于输入样品，对非抗体对照的未结合部分进行连续稀释。我们计算了相对于相应输入信号的端粒或中心周围DNA免疫沉淀量。在所有情况下，我们将ChIP值表示为总输入端粒DNA的百分比，从而校正端粒重复数的差异。

免疫沉淀、免疫印迹和免疫荧光

Rb家庭成员。细胞在RIPA缓冲液中溶解（0.15 M NaCl，0.05 M Tris–HCl pH 7.2，1%Triton-X100，1%脱氧胆酸钠和0.1%SDS），经声波处理并用与圣克鲁斯蛋白A-琼脂糖珠结合的抗体免疫沉淀1 mg总蛋白：Rb（IF18），p107（C-18）和p130（C-20）。使用针对Rb（BD Pharmingen）、p107和p130（Santa Cruz）的抗体进行蛋白质检测。

层蛋白A/C、肌动蛋白、γ-微管蛋白、TRF2和DDR因子。为了进行免疫印迹，细胞在RIPA缓冲液中溶解。使用Lamin A/C（SC-6215，Santa Cruz）、肌动蛋白（克隆C4，MPB）、β-微管蛋白（Sigma）、TRF1（Maria A Blasco赠送）、TRF2（#05-521，Upstate赠送）、POT1（Qin Yang赠送）、53BP1（Bethyl Laboratories，A300-272A）、MDC1（Junran Zhang赠送）、ATM（GTX7107，GeneTex）、DNA-PKcs（MS-423-P，NeoMarkers）进行蛋白质检测，Mre11（Novus，MB100-142）、Nbs1（Cell Signaling，3002B）、Ku70（SC-1486，Santa Cruz）、H2AX（Upstate，07-164）、γH2AX（Supstate，07-164）和ERCC1（SC-17809，Santa Cruz）抗体。对于免疫荧光，使用4%多聚甲醛和0.1%Triton-X100在RT下固定细胞10分钟。使用层粘连蛋白A/C、γ-微管蛋白（Sigma）和Alexa或Cy3标记的二级抗体孵育1小时。在PBS和20 mM甘氨酸中进行清洗。在Vectashield（Vector）中使用DAPI对载玻片进行复染。使用尼康90i立式显微镜或蔡司L510共焦显微镜拍摄荧光图像。

组蛋白。组蛋白通过酸提取进行纯化，如前所述谢赫特等(2007)使用抗H3K9me3和抗H4K20me3（Upstate）免疫印迹法检测组蛋白修饰。

TERRA的隔离

使用TRI试剂（Sigma）并按照制造商的说明从相同样品中分离出总RNA和基因组DNA。对于RNA，在1.2%琼脂糖-甲醛凝胶中分离每个孔5μg分离样品，并在Hybond N上进行印迹+并与端粒和28S探针杂交。当需要时，用核糖核酸酶A（ABgene）处理样品，产生阴性对照。对于DNA，将0.1–0.5μg DNA点印在尼龙膜上，并与端粒或中心周围探针杂交。

端粒酶活性

使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA测定端粒酶活性*Kit（Roche）遵循制造商的说明。

端粒长度测量

TRF分析。我们在琼脂糖塞中制备细胞并进行TRF分析，如下所述布拉斯科等(1997).

中期Q-FISH。我们为Q-FISH准备了中期染色体扩展，并按照以下描述进行杂交埃雷拉等(1999)使用尼康90i立式显微镜拍摄荧光图像，并使用TFL-Telo程序分析端粒荧光强度（来自加拿大温哥华P Lansdorp的礼物）(Zijlmans公司等, 1997). 所有病例均从50多个中期获得图像和端粒荧光值。

用显性负TRF2、层粘连蛋白A、层粘着蛋白C和shRNAs（shLmna和shLucif）进行病毒转导

一个显性负TRF2突变体（TRF2ΔBΔM)克隆到pLPC载体（来自洛克菲勒大学Titia de Lange的礼物）以及包装和包膜质粒pUMVC和pCMV-VSV-G（由华盛顿大学Sheila Stewart提供），使用Fugene在293T包装细胞中转染。转染48小时后，使用含病毒的培养基进行感染Lmna公司+/+或Lmna公司−/−中小微企业。24小时后再次感染。同样的程序用于将层粘连蛋白A/C引入A型层粘连缺失细胞。用于表达层粘连蛋白A/C的逆转录病毒载体是Brian Kennedy（华盛顿大学，西雅图）赠送的礼物。GFP用于监测293T转染效率和MEF感染。在嘌呤霉素（1μg/ml）中筛选36–48小时后，制备细胞进行FISH和western blot，以检测TRF2的表达ΔBΔM使用包装质粒pHR’8.2ΔR和包膜质粒pCMV-VSV-G，以相同的方式对克隆到pLKO中的shLmna和shLucif进行慢病毒转导。选择后对感染的细胞进行免疫印迹。shLmna和shLucif都是Didier Hodzic（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）赠送的礼物。

免疫荧光

首先对盖玻片中生长的细胞进行免疫荧光处理。RT时，细胞在3.7%多聚甲醛/0.2%Tx-100/PBS中固定10分钟，然后在PBS中清洗三次。在10%BGS/PBS中封闭1小时后，在37°C下与抗γH2AX抗体孵育1小时，清洗三次，并与二级抗体孵养。在PBS中广泛清洗后，对细胞进行FISH处理。室温下，细胞在3.7%多聚甲醛/PBS中固定10分钟，在PBS中洗涤，在乙醇（70%、90%、100%乙醇，各5分钟）中脱水，并风干。将含有cy3标记的端粒探针的杂交溶液添加到盖玻片中，盖玻片加热到80°C 10分钟，然后在室温下在黑暗中培养3小时。盖玻片在洗涤液中洗涤两次，每次15分钟，在PBS中洗涤三次。细胞用DAPI和盖玻片上安装的盖玻片进行复染。

CO-FISH公司

CO-FISH分析按照贝利等(2001)简单地说，细胞在20μM BrdU中培养22 h，最后4 h添加0.1μg/ml的秋水仙碱以富集有丝分裂细胞。为Q-FISH准备了中期染色体扩散(埃雷拉等, 1999). 用RNase A（0.5μg ml）处理载玻片−137°C下10分钟，2×SSC中Hoechst 33258染色15分钟，RT下暴露于365 nm紫外光下30分钟。RT下外显核酶III（3 U/μl）处理20分钟，用于消化BrdU标记的链。然后按照Q-FISH处理载玻片，但依次添加两个不同的探针。首先使用富G探针（标记领先链）进行杂交，然后使用富C探针（标记落后链）。

定量实时PCR

使用Taqman Universal PCR Master Mix（PE Applied Biosystems，California，USA）在MyiQ检测系统（美国加利福尼亚州BIO-RAD）上进行定量实时PCR。按照制造商的说明，使用Geneamp RNA PCR试剂盒（PE Applied Biosystems）从1μg总RNA中生成cDNA。53BP1和GAPDH的表达通过Taqman基因表达分析（分别为Mm00658689_m1和Mm99999915_g1，PE Applied Biosystems）进行测定。为了进行分析，所有反应（一式三份）都是通过在同一个平板上扩增目标基因和内源性对照来进行的。通过比较阈值周期确定目标基因的相对定量评价。

统计分析

“双尾”学生的t吨-经检验，采用两个等方差样本计算端粒长度差异的统计显著性。计算使用Microsoft Excel v.2001和Graphpad Instat v3.05。A配对t吨-当需要时，可交替使用确定统计显著性的测试。在所有情况下，当P（P）<0.05.

补充材料

补充数据

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审查流程文件

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致谢

我们感谢华盛顿大学的S Stewart、J Zhang和J Roti-Roti以及马尼托巴细胞生物学研究所的J Davie的有益讨论。我们感谢T de Lange提供TRF2ΔBΔM逆转录病毒载体，D Hodzig提供shLmna和shLucif载体，B Kennedy提供层粘连蛋白A/C表达载体。我们感谢A Searleman、L Revollo、K Chiappinelli、P Ramachandan、E Peterson和C Franz在实验室轮换期间所做的贡献。我们感谢T Whitehead在统计分析方面的帮助。马尼托巴省癌症护理基金会支持了在SM实验室进行的研究。SG实验室的研究得到了美国癌症协会的机构研究拨款、阿尔茨海默病研究中心试点拨款以及华盛顿大学放射肿瘤学系提供的启动资金的支持。

作者贡献：IGS和AR进行了大部分实验，并为撰写本文做出了贡献；SMP观察到53BP1水平下降。BV、DL和SM对端粒强度的核分布进行了三维分析，并编写了相应的补充数据DG进行了DDR因子的western blots。LM进行了CO-FISH分析。EG和BPS对ATM和DNA-PK进行了western blot分析。JS提供了所有Rb家族缺失的MEF。TS和CLS生成了Lmna公司−/−建立小鼠模型，并提供本研究中使用的不同MEF系。SG负责监督研究项目和论文的编写。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团