人和黑猩猩氧化应激与心血管疾病生物标志物的比较(黑猩猩)

摘要

老龄化的特点是承受日常生活压力的能力逐渐下降，死亡率相应增加。根据老化的氧化应激假说，老化过程的大部分可以解释为活性氧（ROS）产生的累积损伤的结果。^{6,21,28,41,97}内源性氧自由基（即ROS）是机体正常代谢反应的副产物，随后会对蛋白质、脂质和DNA造成广泛损害。^6,41各种促氧化剂元素，特别是自由过渡金属，可以催化这些破坏性反应。⁶ROS造成的损伤可以通过抗氧化防御系统抵消，但随着时间的推移，ROS生成和抗氧化防御之间的不平衡会导致氧化应激，并可能导致衰老速度。^28,97

氧化应激与一些与年龄相关的疾病有关，包括神经退行性疾病、眼科疾病、癌症和心血管疾病。^21,28,97其中，心血管疾病仍是美国和欧洲成年人死亡的主要原因。⁷¹就心血管疾病而言，氧化应激与人类动脉粥样硬化、高血压、心肌病和慢性心力衰竭有关。^55,78,84氧化剂催化剂（促氧化剂）（如铜、铁和镉）的增加与高血压、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和心脏性猝死有关。^98,102,106最后，内源性和外源性抗氧化剂都与降低心血管疾病风险有关，尽管这种关系背后的机制尚不清楚。^11,52,53然而，衰老的氧化应激假说不仅旨在解释人类衰老和年龄相关疾病（如心血管疾病）的机制，而且还旨在解释衰老率和不同物种年龄相关疾病表现之间的差异。

动物和人类抗氧化剂和活性氧水平的差异为我们加深对人类衰老的理解提供了希望。支持衰老的氧化应激假说的其他证据来自比较研究，这些研究将不同分类群的衰老率差异与抗氧化剂和活性氧水平联系起来。^{4,17-21,58,71,86,105}在哺乳动物中，最大寿命潜能与血清和组织抗氧化水平呈正相关。^{17,18,21,71,105}研究一直表明，不同物种的氧化损伤率不同，与最大寿命潜力呈负相关。^{4,19,20,58,71,86}然而，很少有研究涉及人类和动物之间衰老和氧化应激的假设生化指标的详细比较。⁶这种种间比较对于直接检验衰老的氧化应激假说具有很大的潜力。

许多进化和遗传证据支持人类和黑猩猩之间的显著相似性。^95,100尽管如此，人类的寿命几乎是黑猩猩的两倍。^三,16,47大多数灵长类动物衰老的比较研究都集中在猕猴模型的使用上，^62,81,88在人类和猕猴身上都发现了一些与年龄相关疾病的生化标记物。^{9,22,28,81,93,97}其他几种猴子也被用于研究氧化应激、抗氧化防御和最大寿命潜能。^18,21,58,105然而，迄今为止，还没有研究对黑猩猩和人类氧化应激和衰老的生化指标进行检测，以验证氧化应激衰老假说。这项研究的目的是直接比较雄性黑猩猩和人类之间心血管疾病、氧化应激和衰老的生化标记物。鉴于氧化应激对衰老的假设以及氧化应激在心血管疾病中的已知作用，我们预测黑猩猩将比人类表现出更高的心血管风险和氧化应激水平。

材料和方法

受试者包括10只健康的年轻男性（平均年龄24岁；年龄范围22至30岁）和10只健康的年轻雄性黑猩猩(黑猩猩; 平均年龄12岁；范围，11至16年）。选择所述的平均年龄是为了尽可能减少所测生化参数中可能发生的年龄依赖性变化。本研究中黑猩猩的平均年龄为骨骼中位年龄后1至2年，^32,39牙科，^1,59,96体重，^32,65和生殖^74,119圈养黑猩猩的成熟度。此外，年龄范围被选定为低于黑猩猩生理衰老的起始年龄。^46,108人类受试者的年龄范围是黑猩猩受试者年龄范围的两倍，因为人类的寿命是黑猩猩的两倍。^三,16,47只选择男性受试者，以尽量减少可能改变所测生化参数的激素变化（即女性月经周期）。

这些黑猩猩被安置在亚利桑那州灵长类基金会，这是一个AAALAC认证的机构，该机构的动物护理和使用委员会批准了该方案。没有动物接触到丙型肝炎或艾滋病毒，也没有甲型肝炎或乙型肝炎抗原。同样，在血液取样时，没有动物进行感染性研究。黑猩猩被安置在由4至7只动物组成的兼容社会群体中，其居住环境超过了美国农业部和实验动物护理和使用指南.⁵¹除了维生素补充剂（Bronson Chewable Multivatium、Bronson Vitamins、Lindon、UT）和日常环境强化和饲料材料外，还向黑猩猩提供了随意饮用的水，以及各种时令水果、蔬菜和颗粒猴面包饼干（印第安纳州里士满PMI营养国际实验室饮食5045）。黑猩猩的水源是现场的一口水井，所有测试都表明水符合亚利桑那州的饮用水标准。黑猩猩很健康，在研究时没有任何疾病迹象，体重在51.0至73.6公斤之间。

所有黑猩猩都在麻醉状态下接受了一年两次的常规健康检查。禁食12小时后，每只黑猩猩通过肌肉注射氯胺酮HCl（5.0至7.5 mg/kg；Ketaset，Fort Dodge，IA）或盐酸替利他明-盐酸唑拉西泮（3.0至4.0 mg/kg；Telazol，Fort道奇，IA）进行麻醉。通过飞镖（Telinject USA，Agua Dulce，CA）或通过注射器和皮下注射针手动注射。工作人员在与黑猩猩互动时使用了所有适当的个人防护装备，并采取了标准的预防措施。采集血液和尿液样本进行生化分析，包括心血管危险因素分析和氧化应激状态分析(表1至表4​4​​).). 血液从股静脉收集到真空采血管中（Vacutainer，Becton Dickinson，Rutherford，NJ）。使用导管收集尿液（Kendall–Sovereign，Mansfield，MA）。

这些人是付费志愿者，通过直接邮件（来自之前参与研究的受试者数据库）和口碑从大凤凰城社区招募。研究方案得到亚利桑那州立大学机构审查委员会的批准，受试者书面同意参与。参与者被要求填写健康史问卷以确定健康状况。入选研究的受试者没有重大医疗问题或疾病迹象，体重指数得分低于30。人类受试者在科洛诺斯科学实验室接受了检查。按照黑猩猩的描述，采集血液和尿液样本进行生化分析。禁食12小时后，通过静脉穿刺抽取血样。尿液样本是第一天早上排出的尿液，并在抽血的同一天采集。

所有生化分析均在Kronos科学实验室进行。使用标准临床方法在自动化蛋白质化学分析仪（Beckman Array，Beckman Coulter，Fullerton，CA）、临床化学系统（Synchron LX20，Beckman-Coulter）和免疫分析仪（Immulite 2000，Diagnostic Products Corporation，Los Angeles，CA）上进行心血管危险因素分析。高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白亚组分通过使用脂肪酶分析仪手动测定（亚利桑那州凤凰城Kronos科学实验室）。²⁶在气相色谱仪上使用自定义（Kronos科学实验室）方法进行脂肪酸分析。²⁶使用标准临床方法测定尿肌酐（Synchron LX20，Beckman Coulter）。使用定制的液相色谱-串联质谱法（Kronos Science Laboratories）方法测定尿液氧化损伤标记物。^42,67采用稳定同位素稀释气相色谱-负离子化学电离质谱法测定异前列腺素水平。⁸⁷使用自定义（Kronos科学实验室）电感耦合等离子体质谱法测量促氧化剂金属。抗氧化剂使用定制（Kronos Science Laboratories）HPLC方法测定，其他氧化应激保护因子使用标准临床方法测定（Synchron LX20，Beckman Coulter）。

使用方差分析比较了黑猩猩和人类之间所有心血管危险因素、氧化应激标记物和氧化应激保护因子的结果。显著性设为0.05水平，所有统计均采用JMP 6.0（北卡罗来纳州卡里SAS研究所）进行。

结果

就心血管风险而言，黑猩猩的纤维蛋白原（F₁₉= 4.55,P（P）=0.046）、胰岛素样生长因子1（IGF1；F₁₉= 54.99,P（P）<0.001），胰岛素（F₁₉= 5.20,P（P）=0.035），脂蛋白a（F₁₉= 77.30,P（P）<0.001）和WBC（F₁₉= 9.85,P（P）= 0.006;表1). 所有黑猩猩的脂蛋白a和IGF1水平都大大高于人类参考最高值(表1). 男性的同型半胱氨酸（F₁₉= 33.43,P（P）<0.001）和更低水平的叶酸（F₁₉= 8.60,P（P）=0.009）和维生素B12（F₁₉= 291.85,P（P）< 0.001;表1). 脂肪酸概况(图1)研究表明，男性的饱和脂肪酸（棕榈酸，C16:0，F₁₉= 18.49,P（P）<0.001）和单不饱和脂肪（C18:1，F₁₉= 32.57,P（P）< 0.001). 男性的不饱和脂肪酸水平也明显较低，包括亚油酸和α-亚油酸（C18:2，C18:3）酸（F₁₉= 5.36,P（P）=0.035）和二十二碳六烯酸（C22:6）（F₁₉= 4.60,P（P）= 0.049).

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图1。

雄性黑猩猩（n=10）和男性（n=10.）饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸平均值（±SE）的比较。星号表示显著(P（P）<0.05）黑猩猩和人类价值观之间的差异。

黑猩猩和男性在总HDL胆固醇（F₁₉= 4.20,P（P）=0.055）或总LDL胆固醇（F₁₉= 0.02,P（P）= 0.896); 然而，黑猩猩的低密度脂蛋白平均粒径明显较小（F₁₉= 77.30,P（P）< 0.001;表1). 就脂质亚组分而言，黑猩猩的两种高密度脂蛋白水平都明显较高_{国际投资协会}（F）₁₉= 28.09,P（P）<0.001）和高密度脂蛋白_IIb公司（F）₁₉= 11.17,P（P）=0.004）和显著降低的HDL水平_三（F）₁₉= 12.15,P（P）= 0.003;图2). 男性IDL水平明显较高_三（F）₁₉= 15.76,P（P）= 0.001;图3). 黑猩猩的低密度脂蛋白水平显著降低₁（F）₁₉= 7.11,P（P）=0.016），LDL水平显著升高₂（F）₁₉= 17.25,P（P）<0.001）和低密度脂蛋白_三（F）₁₉= 9.18,P（P）= 0.007;图4).

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图2。

雄性黑猩猩（n=10）和男性（n=10.）平均（±SE）高密度脂质亚组分的比较。星号表示显著(P（P）<0.05）黑猩猩和人类价值观之间的差异。

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图3。

雄性黑猩猩（n=10）和男性（n=10.）中间密度脂质亚组分平均值（±SE）的比较。星号表示显著(P（P）<0.05）黑猩猩和人类价值观之间的差异。

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图4。

雄性黑猩猩（n=10）和男性（n=10.）平均（±SE）低密度脂质亚组分的比较。星号表示显著(P（P）<0.05）黑猩猩和人类价值观之间的差异。

在氧化应激方面，黑猩猩的5-羟甲基-2-脱氧尿苷（5OHmU；F₁₉= 27.76,P（P）<0.001）和8-异前列腺素F_2α（8isoPGF_2α; F类₁₉= 13.09,P（P）=0.003），但2,3-二硝基-8-异前列腺素F2水平显著降低_α（F）₁₉= 9.81,P（P）= 0.009;表2). 8isoPGF的量_2α黑猩猩是人类的13倍多(表2). 黑猩猩的铜蓝蛋白（F₁₉= 23.93,P（P）<0.001）和铜（Cu，F₁₉= 31.43,P（P）<0.001）和较高的过氧化物指数（F₁₉= 23.21,P（P）< 0.001) (表2到​至3）。三). 在氧化保护方面，黑猩猩的白蛋白水平明显较低（F₁₉= 98.98,P（P）<0.001），尿酸（F₁₉= 173.53,P（P）<0.001），并且两者都是直接的（F₁₉= 8.10,P（P）=0.011）和总胆红素（F₁₉= 24.44,P（P）< 0.001) (表4). 在一半的黑猩猩中，总胆红素和尿酸的含量低于人类参考最低值，几乎所有黑猩猩的白蛋白水平都低于人类参考最小值(表4). 黑猩猩的α-（F）水平也明显较低₁₉= 14.25,P（P）=0.001）和β-胡萝卜素（F₁₉= 16.33,P（P）<0.001），β-隐黄素（F₁₉= 34.64,P（P）<0.001），番茄红素（F₁₉= 124.84,P（P）<0.001）和生育酚δ（F₁₉= 15.06,P（P）<0.001）和γ（F₁₉= 71.22,P（P）< 0.001;表4). 在所有黑猩猩中，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，番茄红素和生育酚的水平都低于人类的参考最低水平(表4). 然而，男性的叶黄素（F₁₉= 5.01,P（P）=0.038），视黄醇（F₁₉= 41.59,P（P）<0.001）和棕榈酸视黄酯（F₁₉= 69.69,P（P）< 0.001;表4).

讨论

人类的心血管疾病有多种形式，包括冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、冠心病、心肌病和慢性心力衰竭。这项研究中的黑猩猩表现出脂蛋白a、纤维蛋白原和IGF1水平升高，这表明早发性心血管疾病的风险很高，尤其是冠心病和心肌病。^27,43,118特别是，脂蛋白a水平高于30 mg/dL与心血管疾病风险增加200%有关。^35,118据记载，在黑猩猩中存在与心肌病相关的充血性心力衰竭，是圈养黑猩猩死亡的主要原因。^{40,50,61,62,64}脂蛋白a、纤维蛋白原和IGF1水平升高均与人类心肌病密切相关。^7,8,13,14,72这里的数据支持了黑猩猩似乎易患心血管疾病，尤其是心肌病的观察。我们假设，在被诊断患有早期心肌病的黑猩猩中，脂蛋白a、纤维蛋白原和IGF1的水平将显著高于其他健康黑猩猩。此外，这种水平的增加可能存在于其他类人猿物种中，因为（如黑猩猩）心血管疾病是圈养大猩猩、倭黑猩猩和猩猩死亡的主要原因。^12,81,92,112与人类相比，黑猩猩和其他可能的类人猿物种的寿命较短，可能是心血管疾病的易感因素之一。相比之下，我们研究中的男性由于同型半胱氨酸水平的升高，动脉粥样硬化的风险稍高。¹¹⁸黑猩猩体内同型半胱氨酸水平较低可能是由于叶酸和维生素B含量极高₁₂这两种药物均能降低同型半胱氨酸水平。⁶⁸最近的研究^25,54已经表明，同型半胱氨酸增加作为心血管疾病的一个致病风险因素可能被高估了。鉴于男性同型半胱氨酸水平低于建议的最高水平（13.4μmol/L），我们认为这一结果与黑猩猩患心血管疾病风险更高的其他证据并不矛盾。

乍一看，脂肪酸谱似乎呈现出矛盾的结果，表明人类患心血管疾病的风险更高，这是由于饱和脂肪酸水平增加和不饱和脂肪酸含量降低所致。先前的人类研究表明，低水平的饱和脂肪（即棕榈酸）和高水平的多不饱和脂肪（如亚油酸）可导致纤维蛋白原水平下降，并降低冠心病风险。^89,118然而，这些结果并不一致，补充n3和n6多不饱和脂肪酸并不能持续降低心血管风险。^89,91,113黑猩猩的心血管风险状况没有反映出同样的影响，这进一步证明了脂肪酸状况与心血管风险之间的关系尚不清楚。为了解决这个问题，需要对黑猩猩和其他类人猿的脂肪酸特征和心血管风险因素进行更多研究。

脂质谱表明黑猩猩体内含有较高水平的低密度大HDL亚组分（HDL）_{国际投资协会}和HDL_IIb类)与人类相比。大HDL亚组分水平的增加与冠状动脉疾病风险的降低相关。^107,118然而，黑猩猩的小LDL亚组分（LDL）水平明显较高_三和低密度脂蛋白₄)以及较低水平的较大LDL亚组分（LDL₁和低密度脂蛋白₂)表明冠心病和心肌病的风险增加。^{2,56,57,101,107,115}总的来说，这些数据表明黑猩猩患心肌病的风险增加，这一模式与圈养黑猩猩心肌病相关心力衰竭增加的观察结果相吻合。^{40,50,61,62,64}我们假设，在被诊断患有早期心肌病的黑猩猩中，小LDL亚组分的水平显著高于其他黑猩猩。此外，鉴于心血管疾病也是圈养大猩猩、倭黑猩猩和猩猩死亡的主要原因，其他类人猿物种也可能存在这种升高的水平。^12,81,92,112最后，黑猩猩的低密度脂蛋白平均粒径小于人类受试者。在人类中，表现出极端长寿的家庭成员（即百岁老人的后代）的平均低密度脂蛋白颗粒大小大于年龄匹配的对照组。^44,104这一发现进一步支持了以下假设：与人类相比，黑猩猩体内的低密度脂蛋白平均粒径较小，与高疾病风险和早期死亡相关。所有这些结果都支持我们的假设，即与人类相比，黑猩猩天生患心血管疾病的风险更高。

在这项研究中，黑猩猩的DNA氧化损伤水平显著增加，表现为5OHmU和8isoPGF_2α事实上，一半的黑猩猩体内的5OHmU水平超过了推荐的最大值（19.6 mg/g）。DNA氧化损伤与心肌病和心力衰竭有关，但在评估心血管疾病风险时通常测量的生物标志物是8-羟基-2-脱氧鸟苷。^54,82此外，异前列腺素（如8isoPGF_2α)与心脏瓣膜的氧化损伤以及冠心病和心肌病的风险密切相关。^42,78,84,116最近的研究表明，5OHmU和8isoPGF_2α是比8-羟基-2-脱氧鸟苷更好的氧化损伤指标。^42,87我们假设，其他类人猿物种的DNA氧化损伤水平增加，这也表明寿命缩短，心血管风险增加。^12,80,92,112黑猩猩体内氧化应激的增加进一步体现在其较高的过氧化物指数上。由于多不饱和脂肪酸对氧化损伤最为敏感，因此过氧化物指数的增加表明氧化应激增加，寿命可能缩短。^19,85在这方面，值得注意的是，人类和黑猩猩之间的比较基因表达研究表明，人类体内的过氧化物酶原（PRDX2、PRDX5、PRDX6）水平非常高。具体来说，过氧化物酶原6在人类中的过度表达是黑猩猩的10倍或更多（数据未显示）。过氧化物酶原在黑猩猩中的低表达可能是导致其过氧化指数较高的原因，但还需要进一步的研究来证实这种可能性。黑猩猩体内氧化原铜蓝蛋白和铜的水平也明显较高，这表明患心血管疾病和心脏病死亡的风险增加。^{29,34,90,94,106}5OHmU和8isoPGF水平升高_2α再加上黑猩猩体内铜蓝蛋白和铜水平的升高以及高过氧化指数，为我们的假设提供了额外的支持，即黑猩猩的氧化应激水平高于人类，患心血管疾病的风险也高于人类。

与人类同类相比，本研究中的黑猩猩的抗氧化水平（即α-和β-胡萝卜素、β-隐黄素、番茄红素和生育酚）显著降低。这种状况可能不是由于饮食不足，因为黑猩猩每天通过饮食和补充摄入15000 IU以上的维生素A（1000 IU作为β-胡萝卜素）和30 IU以上维生素E（作为α-生育酚）。因此，抗氧化剂水平显著降低可能并不反映饮食不足，而是反映了某些抗氧化剂吸收能力下降或降解加剧。这种情况对氧化应激和心血管风险都有深远影响。生育酚降低氧化损伤生物标志物水平，降低冠心病风险。^11,49,53类胡萝卜素，尤其是α-和β-胡萝卜素和番茄红素，可以降低心血管疾病的死亡率。⁵²此外，β-胡萝卜素和番茄红素可改变脂肪酸结构，β-隐黄素可减少炎症，从而降低心血管疾病风险。^57,117然而，研究抗氧化剂与心血管疾病之间关系的结果并不一致。^{45,53,69,76,120}此外，我们的黑猩猩表现出视黄醇和叶黄素水平增加，一些人可能认为这降低了患心血管疾病的风险。这些抗氧化剂水平在其他圈养黑猩猩公布的范围内，但由于野生黑猩猩无法获得血清抗氧化剂水平，我们无法排除圈养黑黑猩猩公布水平因饮食而人为膨胀的可能性。^15,31对这些抗氧化剂数据的解释应记住，大多数关于抗氧化剂对发病率和死亡率影响的随机试验和荟萃分析通常不涉及综合方法（使用多种抗氧化剂），也没有检查抗氧化剂补充对氧化应激测量的影响。⁷³此外，一些研究表明，视黄醇和叶黄素水平并不能很好地预测未来的冠心病或心脏病死亡。^37,103,117我们假设黑猩猩由于生育酚和类胡萝卜素水平下降，氧化应激和心血管疾病的风险增加。然而，还需要进一步的研究。

白蛋白和胆红素都被认为具有抗氧化性能，可以防止产生破坏性自由基，保护自由脂肪酸免受过氧化。^38,99血清白蛋白和胆红素水平降低与冠心病和心力衰竭风险增加有关。^23,33,60,75因此，我们的黑猩猩体内白蛋白和胆红素水平的下降进一步支持了黑猩猩面临氧化应激和心血管疾病的高风险，我们假设，被诊断为早期心肌病的黑猩猩的白蛋白和胆红素水平低于其他黑猩猩。

黑猩猩体内尿酸水平较低可能被解释为降低了患心血管疾病的风险。一些研究报告称尿酸水平升高是心血管疾病的危险因素。^10,30,111然而，其他作者得出结论，尿酸和心血管疾病风险之间没有独立的关联。^{79,109,110,114}此外，一些研究表明尿酸具有强大的抗氧化性能和潜在的延长寿命益处，^{5,18,24,36,48,83}而其他人没有发现尿酸水平和最长寿命潜力之间的关系。^71,77此外，尿酸水平受营养和环境影响很大¹⁰⁹氧化应激可能会减少这种情况。因此，我们还不清楚黑猩猩尿酸下降的意义。我们假设人类尿酸水平升高可能与心血管风险无关，因为在尿酸水平预测心血管疾病的研究中，尿酸水平超过8 mg/dL，^10,66远高于当前研究的水平。然而，还需要进行更多的研究，目前还不能得出关于尿酸的确切结论。

衰老的氧化应激假说预测，密切相关物种之间衰老速度的差异是氧化应激（即ROS）和抗氧化剂水平差异的结果。^{4,17-21,84,96}如果黑猩猩的衰老速度是人类的两倍，人们会预测黑猩猩会相应地表现出更高的氧化应激水平和心血管风险，而抗氧化能力则更低。目前的研究结果支持了这一假设，黑猩猩的心血管风险和氧化应激水平是人类的两倍。这项研究的数据普遍支持这样的观点，即人类寿命的延长至少在一定程度上是遗传变化的影响，遗传变化导致抗氧化能力增强，心血管风险和氧化应激降低。此外，我们的研究表明，与人类相比，黑猩猩在其整个生命周期中可能会有更高水平的氧化应激，从而加速其衰老过程。纤维蛋白原、IGF1、脂蛋白a、5OHmU、8isoPGF_2α和铜蓝蛋白都是类人（即类人猿和人类）衰老生物标志物的良好候选物。需要更多的研究来检验这些假设。显然，需要更多的研究来探索本研究中观察到的差异的遗传基础，以及这些物种在氧化应激和心血管疾病方面的纵向差异。

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