脑缺血/缺氧通常导致中风，是发达国家第三大死亡原因，也是最常见的长期残疾原因。数十年来，针对脑缺血/缺血性中风的神经保护药物的深入研究取得了许多临床前但尚未临床成功的结果(1–8). 目前治疗缺血性卒中的唯一选择是溶栓治疗（如重组组织纤溶酶原激活剂），必须在发病后3小时内进行，以实现早期动脉再通。有几个因素最有可能导致翻译失败。主要针对缺血/缺氧诱导的病理级联反应（阻止病理途径），如细胞外兴奋性氨基酸和细胞内钙的积聚2+当在缺血事件发生时或发生前立即给予阻滞剂时，升高是最有效的。此外，靶向神经递质Ca2+，许多参与缺血/缺氧反应的酶对神经元功能也至关重要，因此，如果不产生严重的不良反应或毒性，就无法维持其有效阻断。此外，大多数临床前研究中确定的阻止病理途径的药物的短期疗效不能保证治愈，因为这些候选药物可能延迟但不能阻止病理影响(9).
我们最近发现，脑缺血后（24小时后）bryostatin-1不是仅仅阻止脑缺血的病理级联反应，而是一种相对同种型的选择性蛋白激酶C（PKC）激活剂，具有抗凋亡和促突触发生的特性(10–13)，挽救大鼠空间学习记忆的缺血/缺氧损伤(14)，在5周治疗结束后约2周进行评估。
结果
在此，我们从两个方面研究了缺血后苔藓抑制素-1的治疗效果：一个涉及长期顺行，另一个涉及逆行。采用四组大鼠：缺血组、缺血+苔藓抑制素-1组、仅使用苔藓他汀-1组和假手术对照组。
Bryostatin-1对全球脑缺血损伤的空间学习和记忆产生持久的拯救作用。
首先，我们确定了缺血后苔藓抑制素-1是否会对神经回路和突触产生持续（例如，数月）的功能恢复。给予Bryostatin-1（15μg/m）2静脉注射，每周两次，持续5周），在大鼠脑缺血/缺氧事件结束后24小时给予第一次剂量(14). 在最后一次注射苔藓抑制素-1后4个月测试空间学习和记忆能力。四组之间的学习差异显著(). 缺血组表现出严重的学习障碍（试验期间的逃避潜伏期：F类7,63= 0.393,P（P）>0.05）和与对照组相比学习障碍(F类1,127= 52.613,P（P）< 0.001). 其他三组都学习了这项任务(P（P）试验结果<0.001）。苔藓抑制素-1治疗显著改善了学习能力（缺血组与缺血大鼠对比：F类1,127= 66.106,P（P）<0.001），达到对照水平（用bryostatin-1缺血与对照：F类1,127=0.434，P（P）> 0.05). 对照组和仅使用bryostatin-1的组之间没有显著差异（bryostatin-1与对照组：F类1,127= 0.952,P（P）> 0.05).
脑缺血后苔藓抑制素-1对脑缺血/低氧诱导的空间学习记忆障碍的持续作用。(一个)训练试验期间大鼠的空间水迷宫表现（平均值±SEM；2次试验/天，持续4天；组间差异：F类3,255= 29.888,P（P）< 0.001). (B–E类)训练试验后的探针测试结果。象限4是在训练试验期间放置隐藏平台的目标象限。(F类)目标象限比（用探针测试期间的目标象限距离除以平均非目标象限值；组间差异：F类3,31= 4.096,P（P）< 0.05). 8只大鼠/组；Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血。*，P（P）< 0.05. NS公司：P（P）>0.05之间。
缺血组大鼠在记忆回忆测试中没有表现出目标偏好(F类3,31= 0.169,P（P）>0.05），而其他三组均表现出目标象限偏好（全部P（P）< 0.05; 看见). 各组之间的目标象限比率存在显著差异(). 对照组和缺血组之间存在显著差异(F类1,15= 7.446,P（P）<0.05）以及用苔藓抑制素-1在缺血和缺血之间(F类1,15= 7.300,P（P）< 0.05). 用苔藓抑制素-1治疗的对照组和缺血组之间没有发现显著差异(F类1,15= 0.140,P（P）>0.05），并且仅在对照组和苔藓抑制素-1之间(F类1,15= 0.212,P（P）> 0.05). 重要的是，探针测试后的可见平台测试显示，4组之间没有显著差异(F类3,31= 0.172,P（P）>0.05），表明在感觉运动能力和逃避动机方面没有显著的群体差异。
Bryostatin-1从全脑缺血诱导的细胞死亡中拯救海马神经元。
需要注意的是，梗死体积通常在涉及局部缺血/中风的研究中测量，而不是在本研究中使用的全脑缺血模型中测量。在目前的研究中，大多数大脑既没有海马萎缩也没有侧脑室扩大。缺血+苔藓抑制素-1组、对照组和苔藓他汀-1组均未观察到宏观变化。
整体缺血/缺氧诱导的空间学习和记忆损伤是由于突触逐渐丧失、凋亡细胞死亡以及背海马CA1区突触修复/神经营养活性不足所致(14). 苔藓抑制素-1治疗有效地挽救了所有这些后果。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）(15)在单个细胞水平检测凋亡中的DNA链断裂（程序性细胞死亡）。全脑缺血/缺氧5周后，在海马CA1区锥体层和放射层发现TUNEL阳性染色( 一个和B类)，反映了TUNEL标记的DNA链从细胞核断裂到锥体神经元的树突状突起的移位。定量分析(C类)各组之间存在显著差异(F类3,116= 10.974,P（P）< 0.001). 缺血/缺氧增加背海马CA1区细胞凋亡(P（P）< 0.001; 误差系数或C.E.=1.53），缺血后苔藓抑制素-1治疗阻断的反应(P（P）< 0.001; C.E.=1.08）。Bryostatin-1单独使用并没有显著改变TUNEL染色。
Bryostatin可防止缺血/缺氧诱导的凋亡细胞死亡。低(一个)和高(B类)通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测CA1海马区凋亡细胞死亡的放大，并通过共焦显微镜观察（双盲研究）。(C类)放射状地层TUNEL染色的定量研究(n个=3只动物；n个=30个共焦图像）。控制；Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血；***，P（P）< 0.001.
Bryostatin-1诱导突触发生并预防全脑缺血诱导的突触丢失。
使用免疫组织化学、共焦显微镜和电子显微镜，我们先前证明了海马整体缺血/中风诱导的总树突状棘数量减少，有无宏观变化。Bryostatin-1预防了全脑缺血/中风诱导的树突状棘的丢失(12). 长时记忆通过蘑菇状树突棘的形成储存在大脑中，树突棘中含有穿孔的突触后密度（PSD）(一个) (16). 由于突触前神经束的数量没有被记忆改变，记忆增强的蘑菇棘与已经与其他树突棘突触的轴突神经束形成多个突触(10,17). 多突触泡数量的增加导致突触前小泡浓度的增加(10).
Bryostatin可恢复轴突隆突中蘑菇状树突棘和突触前小泡的减少。(一个)蘑菇棘（M）的电子显微照片显示黄斑(上部)和穿孔(下部)突触后密度（PSD；白色箭头）和突触前小泡（红色箭头）。(B–C类)包含黄斑和穿孔PSD的蘑菇棘的总数。(D–F型)突触前小泡高浓度的轴突泡数量。控制；Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
我们目前的EM数据表明，苔藓抑制素-1治疗可以防止长期联想记忆中原有超结构的缺血性丢失，即穿孔的PSD蘑菇棘与含有大量突触前小泡的轴突突触形成突触(10). 采用双盲电子显微镜研究缺血/缺氧和/或苔藓抑制素-1对蘑菇棘数量和高浓度突触前小泡轴突泡数量的影响(n个=48–62电子显微照片；看见). 黄斑PSD蘑菇棘的数量在各组之间存在显著差异(F类3,232= 4.577,P（P）< 0.01; 看见 一个和B类)和穿孔PSD蘑菇刺(F类3,232= 4.988,P（P）< 0.01; 看见 一个和C类). 全脑缺血/缺氧减少黄斑数量(P（P）< 0.01; C.E.=0.97）和穿孔(P（P）< 0.05; C.E.=1.02）PSD蘑菇棘。缺血后苔藓抑制素-1治疗可防止两个黄斑蘑菇棘突触的丢失(P（P）< 0.001; C.E.=0.44）和穿孔(P（P）< 0.001; C.E.=0.54）屏蔽门。仅Bryostatin-1不影响蘑菇棘的数量。 一个和D类结果表明，各组之间具有致密突触前小泡的轴突泡的数量存在显著差异，这些小泡与黄斑部PSD形成突触(F类3,232= 7.769,P（P）<0.001）。 一个和E类对与穿孔PSD形成突触的致密突触前小泡的数量也有类似的影响(F类3,232= 8.095,P（P）< 0.001). 全脑缺血/缺氧减少了含有致密突触前小泡的轴突泡的数量，并与黄斑形成突触(P（P）< 0.01; C.E.=1.02）和穿孔(P（P）< 0.001; C.E.=0.97）PSD蘑菇刺。与黄斑对照组相比，Bryostatin-1不仅可以缓解缺血/缺氧引起的突触前小泡减少，还可以增加突触前囊泡(P（P）< 0.01; C.E.=0.36）和穿孔(P（P）< 0.001; C.E.=0.50）PSD蘑菇棘。仅Bryostatin-1对突触前小泡的密度没有影响。EM结果与我们之前使用共焦显微镜观察突触素（突触前囊泡膜蛋白）免疫组化的观察结果一致(14).
Bryostatin-1拯救从全球脑缺血损伤中获得的空间经验。
在第二个范式中，我们研究了苔藓抑制素-1是否可以拯救之前学习到的经验。在水迷宫中对各组大鼠进行集中训练。探针试验后第1天，将大鼠随机分为四组：假手术对照组、缺血缺氧组、缺血-缺氧联合苔藓抑制素-1治疗组和仅用苔藓他汀-1治疗组。在缺血/治疗之前，所有这些大鼠都学习了空间任务()各组间学习成绩无显著差异。在记忆探测测试中，所有组都表现出对目标象限的偏好（全部P（P）< 0.005; 看见). 在评估学习经验记忆的探针测试中获得了两组数据：目标象限比率和第一次穿过移除平台的正方形位置的潜伏期（如果大鼠在60秒内没有到达该位置，则对60秒的相同1分钟试验进行评分）。各组之间的目标象限比率没有显著差异(F类3,31= 0.009,P（P）>0.05）和第一次穿越拆除平台位置的延迟(F类3,31= 0.939,P（P）>0.05）。
缺血后苔藓抑制素-1的抢救经验。(一个)大鼠在缺血/治疗前的训练试验（2次试验/天，持续6天）中的空间水迷宫表现（平均值±SEM；试验：F类11,383= 40.483,P（P）< 0.001; 组：F类3,383= 0.315,P（P）> 0.05). (B–E类)缺血和/或治疗前训练试验后的探针测试结果。象限4是目标象限。(F类)缺血和/或治疗前（缺血前）和缺血后（缺血后）的目标象限比值。(G公司)缺血和/或治疗前（缺血前）和缺血后（缺血后）第一次穿越目标位置的潜伏期。8只大鼠/组；Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血。*，P（P）< 0.05. NS公司：P（P）> 0.05.
然后如前所述诱发脑缺血(14)，探针测试后24小时。术后恢复后出现短暂缺氧。bryostatin-1治疗（静脉注射，15μg/m2然后开始给药，每周两次，持续5周），在缺血/缺氧发作结束后24小时给药。在最后一次注射苔藓抑制素-1 2周后进行第二次探针测试。缺血组大鼠在第二次记忆探针测试中没有表现出目标偏好(F类3,31= 0.213,P（P）>0.05），表明先前形成的记忆受损，而其他三组表现出目标象限偏好（全部P（P）< 0.005). 各组之间的目标象限比率存在显著差异(F类3,31= 3.222,P（P）< 0.05; 看见F类)，在对照组和缺血大鼠之间(F类1,15= 7.329,P（P）<0.05）以及用苔藓抑制素-1在缺血和缺血之间(F类1,15= 7.297,P（P）<0.05），但在使用bryostatin-1的对照组和缺血大鼠之间没有显著差异(F类1,15= 0.060,P（P）>0.05），并且仅在对照组和苔藓抑制素-1之间(F类1,15= 0.032,P（P）> 0.05). 在第二次探针测试中，第一次穿越移除平台位置的潜伏期也存在组间差异(F类3,31= 107.113,P（P）< 0.001; 看见G公司). 除缺血组外，其余三组之间的潜伏期没有显著差异(F类2,23= 0.247,P（P）> 0.05). 探针测试后，可见平台测试显示各组之间没有显著差异(F类3,31= 0.218,P（P）>0.05），表明各组在感觉运动能力和逃避动机方面没有显著差异。
讨论
本文的结果表明，缺血后苔藓抑制素-1治疗不仅可以挽救大鼠学习和记忆空间迷宫的能力，还可以挽救/保护先前学习的空间经验。这一结果表明，bryostatin-1等药物在缺血后治疗中具有抗凋亡和突触重塑/修复增强特性，具有巨大的治疗潜力。低浓度的Bryostatin-1选择性激活PKCε，同时下调PKCδ(18). 这些数据也与特定PKC同工酶（如PKCε）在空间学习、记忆和突触重塑中的关键作用相一致(19,20). 另一方面，PKCδ可能参与缺血/再灌注损伤(21). 因此，与突触前和突触后神经营养蛋白及其他蛋白质的生化变化相一致(14)苔藓抑制素-1包括嗜棘蛋白、突触素和BDNF，如我们之前的研究所示，它可以防止突触丢失，诱导突触发生，产生抗凋亡作用，并增加背海马CA1区的细胞存活率和脑源性神经营养因子（BDNF）的活性(14).
我们对这些数据的解释表明，苔藓抑制素-1诱导的抢救效果最有可能代表一种真正的“治愈”，因为它们在治疗结束后会持续很长时间，并包括学到的经验。该观察结果与最近的一份报告一致，即BDNF，而非神经生长因子，对阿尔茨海默病啮齿动物和灵长类动物模型中的突触丢失具有保护和恢复作用(22). 因此，研究结果有力地表明，苔藓ostatin样化合物可能被开发为治疗缺血性/缺氧性神经系统疾病和缺血性中风的有效疗法(23,24).
材料和方法
动物、脑缺血/缺氧和药物治疗。
实验前，将成年Wistar大鼠（雄性，225–250 g）放置在温度控制（20–24°C）的房间中至少1周，允许自由获取食物和水，并保持12小时的光/暗循环。他们被随机分配到不同的组。通过双动脉闭塞（2-VO）方法在体内诱导全脑缺血，并结合控制缺氧时间。在适当的戊巴比妥麻醉水平下（60 mg/kg，静脉注射，必要时额外补充剂量），用丝线将双侧颈总动脉（从颈部腹侧）绑住。2-VO闭塞导致这些年轻大鼠的脑血流量慢性减少至原始流量的70%。在整个手术过程中监测直肠温度，并使用加热灯将其保持在37.5°C。手术结束后，在适当的麻醉下，大鼠接受酮洛芬（5 mg/kg，皮下注射）用于术后镇痛，并接受5 ml生理盐水以补偿水分和矿物质的损失。在低氧暴露期之前，允许手术恢复7天（在罐子中约14分钟，吹入约5%的低氧）。联合脑缺血/缺氧导致翻正反射丧失约10分钟。除了动脉未闭塞和同一罐中的氧气水平未降低外，对照大鼠接受了相同的程序。
Bryostatin-1（15μg/m2)从缺血/缺氧事件结束后24小时开始，通过尾静脉给药（每周两次，共10次）。
所有程序均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会指南进行，并得到该研究所伦理委员会的批准。
空间学习和记忆。
评估大鼠的空间学习能力（2次试验/天，持续4天或6天）和记忆能力（最后一次学习试验后1分钟、24小时的探针测试）作为功能终点，在最后一次服用bryostatin-1后9天开始首次训练。最后一次服用苔藓抑制素-1和第一次空间迷宫训练试验之间的延迟似乎适合于将苔藓他汀-1的急性记忆作用与其对脑缺血后神经修复的影响分离开来。
本研究使用水迷宫采集，因为它与海马背侧CA1锥体细胞的功能关系最为密切。每天试验前至少1小时，将大鼠转移到家中笼子中的试验室。迷宫水池直径152厘米，高60厘米，高40厘米2O（22±1°C）。迷宫被分成四个象限。训练大鼠4天（两次试验/天），以找到一个隐藏平台（直径9厘米），该平台位于其中一个象限的中心，并淹没在水面以下约2厘米处。在所有试验开始时，将大鼠分别放置在面对迷宫墙的水中，每次试验使用不同的起始位置，并允许它们游泳，直到找到平台，在平台上停留20秒，然后再回到家中的笼子。研究人员将一只在2分钟内未能找到平台的大鼠引导到那里，得分为120秒。游泳路径由视频跟踪系统记录，该系统计算到平台的延迟、游泳距离和在象限中花费的时间百分比。训练试验结束后，进行了一项探针试验（象限试验或记忆保留试验），移除平台，以评估大鼠在象限内移动距离对其位置的记忆保留。视频跟踪系统在1分钟内跟踪动物在每个象限的运动。
可见平台测试。
完成空间记忆程序后，对所有大鼠进行可见平台任务测试（平台上有一根伸出水面9英寸但位于新位置的杆），以评估它们的感觉运动能力和逃避动机差异。
凋亡细胞死亡染色。
按照描述随机选择三只动物进行修复(14). 在麻醉状态下（水合氯醛；Sigma-Aldrich；400 mg/kg体重，i.p.），在室温下用PBS（PBS）通过心脏进行重力灌注，以清洗血液，然后在室温下使用约150 mL 4%多聚甲醛在PBS中固定。取出大脑，在4°C下用4%多聚甲醛后固定15分钟，然后在4°C下保存在PBS中。随后，用400μm振捣器将右侧海马切片，并在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定1h，然后切除至35μm。
沿着海马背侧以约800μm间隔的35-μm厚的切片（三个切片/只动物）通过自由漂浮技术用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL；R&D Systems）检测凋亡细胞。根据TUNEL标记试剂盒中所述的标准程序修改染色。切片用去离子（无DNA）水清洗（室温下，三次×每次5分钟），并用蛋白酶K（1:200）在去离子水中在37°C下处理2小时。用去离子水洗涤（在室温下，三次，每次5分钟）后，将切片在室温下置于TdT标记缓冲液中5分钟。用标记反应混合物培养切片（TdT dNTP混合物，Mn2+和TdT酶；所有1:50的TdT标签缓冲液）放置在湿度室中，用摇摆台振动器在室温下轻轻摇晃一整晚。切片在室温下储存在TdT停止缓冲液中10分钟，然后用PBS（室温）清洗三次，每次5分钟。切片在室温下用Strep-Fluor溶液（1:50）在PBS中培养3小时，并在室温下使用0.1%吐温20在PBS内洗涤两次，每次5分钟。在室温下用去离子水清洗5分钟后，用含有DAPI的Vectashield安装介质安装切片，以对细胞核进行反染色（Vector Lab）。切片用蔡司510共焦扫描显微镜成像。从海马CA1区的放射层获得共聚焦图像（3-4张图像/切片；在整个CA1区随机选择），然后使用ImageJ程序进行分析(http://rsb.info.nih.gov/ij/).
电子显微镜。
如前所述，在室温下使用PBS中的400 mL固定剂（2%戊二醛和3%副甲醛）进行电子显微镜检查。此后，从随机选择的大鼠大脑中分离出右海马(n个=3只大鼠），用振动体在400μm处切割海马背侧，再切割至100μm（每只动物三个切片，相隔约800μm）。用二羧酸缓冲液（pH 7.4）清洗切片三次，在1%OsO4中固定1 h，然后用蒸馏水冲洗。切片在分级乙醇系列中脱水，然后进行树脂包埋，然后使用标准程序进行切片。从100μm厚的海马脑片上随机选取并切割的超薄切片（90 nm），用醋酸铀酰和醋酸铅染色，并在JEOL 200CX电子显微镜上在100 kV下观察。数据通过电子显微照片（10μm×10μm）的双盲定量分析（未知治疗和动物受试者）。蘑菇状树突棘、突触前轴突突起和突触的形态学根据红派散和Alkon进行了定量分析(10). 蘑菇棘的标准是（横截面可见）直径>600 nm的树状棘。轴突泡中突触前小泡的增加是由发现突触前小泡占50%以上横截面的轴突泡的频率增加决定的。从CA1区域随机采集每个90-nm分析断面。未使用相邻部分。
使用方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后使用纽曼-凯尔斯多重比较测试，或使用学生的t吨在适当的情况下测试配对和未配对数据。P（P）<0.05被认为是显著的。误差系数定义为标准偏差除以平均值。
