小鼠肝染色质中SREBP-1结合的全基因组分析揭示了启动子近端结合新基序的偏好

摘要

所有生物体都进化出了战略调节系统，以协调代谢通量进入潜在的竞争性生物化学途径，从而管理代谢产物和最终产物库，以实现最佳的细胞适应性。这在哺乳动物脂质体内平衡中尤其重要，因为胆固醇和脂肪酸是哺乳动物脂质的两大类，是所有细胞结构和功能的关键，而进入这些途径的不平衡流量可能会导致能量效率低下和有毒。在脊椎动物中，脂质稳态部分由固醇调节元件结合蛋白（SREBP）转录因子维持，这些转录因子合成为≈125-kDa前体，含有2个跨膜结构域，将未成熟蛋白质定位于内质网膜(1).

来自1个基因的重叠转录物编码SREBP-1a和SREBP-2c亚型，单一的SREBP-2由一个不同的未连锁基因编码(2). 有一个复杂的营养感应系统，它将胆固醇和其他关键脂质成分的细胞水平与表达和多步骤膜转运/蛋白酶途径联系起来，将膜结合的SREBP转化为更小的核靶向转录因子。

SREBP激活编码胆固醇和脂肪酸代谢中大多数关键酶的基因(三); 因此，将SREBP处理与通路流量耦合，可以在调节因子的活性和代谢需求之间提供直接联系。在小鼠中的过度表达和靶向消除研究产生了有关SREBPs在脂质调节中作用的关键信息(三). 现有证据表明，SREBP-1和SREBP-2分别主要参与脂肪酸和胆固醇代谢(三). 然而，关于这3种哺乳动物SREBP的个体作用和生理靶点，还有很多需要了解的地方。此外，SREBP激活与脂质生物合成核心反应无关的基因(4,5); 因此，需要进行更多的研究，以更全面地了解SREBP在生理和代谢中的功能。

我们使用染色质免疫沉淀-高通量DNA测序（ChIP-seq）对肝脏中SREBP-1结合进行了全基因组分析(6). 我们在小鼠肝脏基因组中鉴定出426个SREBP-1结合位点，有趣的是，52%位于已定位基因5′端的1kb内（零期望值为1%）。我们还对受禁食/再喂养转换调节的基因进行了表达微阵列分析，其中SREBP-1c表达显著增加。当我们将禁食/再喂养差异表达基因与位于SREBP-1结合峰附近的基因进行比较时，存在高度相关性，表明我们的ChIP-seq数据集包含SREBP-1c结合靶基因的功能集合。

数据还揭示了SREBP-1的一个先前未被识别的DNA结合基序，该基序与一个孤儿基序相匹配，该孤儿基序在几个哺乳动物物种的启动子中高度保守，但相应的转录因子尚不清楚(7). 我们使用电泳迁移率转移和转染分析表明，这个先前未描述的基序是一个功能性SREBP-1靶点，进一步支持SREBP-2作为先前未识别的转录因子的身份。

结果

我们制备了一种小鼠SREBP-1片段的抗体，该片段与SREBP-2没有同源性，并用它检测来自对照组小鼠、禁食组或禁食后再喂高碳水化合物饮食组的肝染色质中的SREBP-1。禁食后成熟的SREBP-1显著降低，并在参考样品中增加到几倍以上的水平(图S1)与对照组相比。由于该抗体具有高度的特异性和鲁棒性，我们使用ChIP从参考染色质中富集含有SREBP-1的DNA片段。基因特异性ChIP分析(图S1)证实了SREBP-1与3个已知SREBP靶基因的关联；因此，我们被鼓励进行SREBP-1结合的全基因组分析。来自SREBP-1或IgG富集样品的染色质被用作高通量测序分析的起始样品(6).

图1A类显示了测序分析的摘要，以及图S2显示了1个峰值的数据，序列读取映射到UCSC基因组浏览器数据库的窗口中。为了定义SREBP-1结合峰，我们将最小序列读数设置为8，将SREBP-1与IgG比较的最小读数比率设置为5。使用这个严格的截止值，我们共鉴定出426个SREBP-1结合位点。当样品颠倒时，只检测到4个峰。因此，本底较低，特异性较高。我们搜索了峰值近端基因（两侧），确定了753个总基因。有关峰值位置的更多信息，请参见表S1，中提供了最近的基因列表表S2.

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图1。

肝染色质中SREBP-1–DNA结合的ChIPSeq分析。(A类)峰值分析总结。(B类)峰值验证。通过基因特异性ChIP选择十个随机选择的峰进行验证。折叠变化（FC）是来自SREBP-1抗体富集染色质的信号相对于对照IgG的折叠增加。如图所示，还比较了从禁食小鼠和对照小鼠制备的肝染色质中SREBP-1与这10个峰以及LDL受体和FAS启动子的结合。阴性对照L32未显示富集(31). *P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05

为了验证全基因组结合数据的准确性，我们随机选取了10个区域，并使用峰值特异性引物进行了ChIP分析。SREBP-1与所有10个区域的结合在SREBP-1染色质中相对于IgG富集1.6至23倍(图1B类). 在refed和禁食的肝染色质中，SREBP-1与大多数受试启动子的结合也显著增加(图1B类).

为了找到SREBP-1靶基因之间的任何共性，我们搜索了注释、可视化和集成发现（DAVID）基因本体（GO）数据库(8)在脂质中富集和发现基因簇(P（P）=7e-4）和碳水化合物代谢(P（P）=5.6e-3）如预期(表S3). 这些类别中的许多基因是已知的SREBP靶基因，而其他的则是以前未知的。此外，其他GO类别中与细胞内蛋白质运动和靶向性相关的基因(P（P）=3.8e-7），细胞增殖和分化(P（P）=5.3e-4）和凋亡(P（P）=3.6e-5）显示显著富集。这很有趣，也可能很重要，因为SREBP在其生命周期中经历了多胞膜行程(9)并参与细胞增殖(10)和凋亡(11–13).

有趣的是，峰值分布分析显示，52%定位于基因转录起始位点（TSS）的1 kb 5′以内，11.4%定位于5′UTR区域。总之，这占总SREBP-1结合事件的63%以上，表明SREBP-对启动子近端结合的强烈偏好。其余位点主要分布在基因间区和内含子内，很少位于3′UTR和外显子(图2A类). 总的来说，95%的峰值位于已知TSS的20 kb范围内(图2B类; 零预期为15%）。

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图2。

ChIP-seq峰的全基因组分布。(A类)SREBP-1结合峰相对于已知基因的位置。启动子和下游区域定义为5′或3′侧翼DNA的2kb。(B类)与最近基因TSS的峰值距离。虚线表示与平均峰值大小相同的随机DNA序列的分布。(C类)使用MEME分析426个峰区的过度表达基序(14). 上面显示了得分最高的图案。

然后用MEME分析峰周围的序列以寻找丰富的序列基序(14). 从MEME主题衍生出的网络徽标得分最高，如所示图2C类该基序存在于325个峰中（对于位置特异性频率矩阵模型为76%z（z）> 4.5; 每个峰值的图案数量见图S3). 该基序被分成两半，其中一个基序与我们基于一小组启动子的功能比较和序列比对提出的SREBP基序相似(15). 然而，总的来说，这代表了先前未描述的SREBP-1的假定识别位点。有趣的是，该基序优先位于峰值中心附近，与SREBP-1的识别位点一致(z（z）= 4.8,P（P）=1e-6；图S4). 这是因为ChIP-seq提供的高分辨率(6).

SREBP本身是非常低效的转录因子，只有在接近协同调节蛋白（如Sp1、NF-Y/CBF和CREB）的结合位点时，它们才能强烈刺激基因表达(16). 对可能在SREBP峰值附近富集的其他基序的搜索显示，在215个SREBP-1结合峰的150 bp（50%）范围内，与Sp1共有位点相匹配。该分析未发现其他显著富集的元素。

为了确定这一先前未描述的主题是否真的具有功能，我们寻求了其他证据。我们注意到，该基序（5′-ACTACAnnTCCC-3′）被分成两半，其中1个类似于我们之前基于一小组启动子的功能比较和序列比对提出的SREBP基序(15). 尽管该基序与Transfac数据库中保存的任何已知基序都不匹配，但它几乎与计算确定的基序[M4基序(7)：5′-ACTAYRnnnCC-3′]基于检测在多个哺乳动物基因组中表现出强大进化保守性的序列元素(7). 事实上，M4被列为具有未鉴定的DNA结合蛋白的最高度保守的基序。然后，为了从实验上分析这个之前未描述的基序是否是SREBP-1结合和激活的真正位点，我们制备了一个包含EMSA独特基序的寡核苷酸探针，并且我们还制备了在荧光素酶报告载体中Sp1位点旁边包含3个串联拷贝的合成启动子，用于功能研究。EMSA显示，先前未描述的基序探针与重组SREBP-1特异结合(图3A类)竞争研究表明，低密度脂蛋白受体SREBP反应元件（SRE）对SREBP-1结合具有较高的相对亲和力。瞬时转染分析表明，合成报告子被共转染的SREBP-1c激活，而先前未描述基序中6个碱基发生突变的相同结构没有被共转导的SREBP-1c激活(图3B类). 此外，我们发现SREBP-1激活了我们研究中确定的一个天然启动子（GSK-3a）的表达，当删除一个之前未描述的基序拷贝时，刺激减弱(图3C类). 这与其他天然SREBP应答启动子相似，其中一个元件突变，另一个结合位点保持完整，导致SREBP反应性丧失(2,15,17).

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图3。

先前未描述的SREBP-1结合基序的功能分析。(A类)³²-用缓冲液（通道1和10）或重组SREBP-1[BP-1（2ng），通道2-10和12-20]培养P标记探针，代表来自人类LDL受体启动子（通道1-10）或先前未描述的SREBP-1基序（通道11-20）的特征良好的SREBP位点，并用EMSA进行分析。如图所示，结合反应中包括LDL受体（LDL，泳道3-5和13-15）或先前未描述的基序（ACT，泳道6-8和16-18）的未标记探针浓度增加（30倍、100倍或300倍摩尔过量）。在通道9和19，或通道10和20中，结合反应中包含300倍摩尔过量的非特异性（NS）DNA片段或之前未描述的基序探针（ACTm）的突变版本。探针和竞争对手的DNA序列见表S1. (B类)含有Sp1位点（ACT）上游先前未描述基序的3个拷贝的报告质粒_三或含有3个突变版本（ACTm）拷贝的类似质粒_三融合到荧光素酶编码序列，并通过瞬时转染293T细胞进行分析。报告者与pcDNA3.1空载体（灰色条）或SREBP-1c表达载体（黑色条）共转染。(C类)还制备了WT和GSK3a启动子缺失版本的荧光素酶载体，并对SREBP-1反应性进行了上述分析。如图所示，3个启动子结构包含1.5kb、0.5kb或0.4kb的5′侧翼序列。启动子图上的椭圆表示5′-ACTACANNTCC-3′的2个拷贝的位置，矩形表示Sp1共有位点的位置。

因为禁食会抑制SREBP-1c的水平，禁食后再喂高碳水化合物饮食会使其高于控制水平(图S1)，肝脏中受SREBP-1c调节的基因应通过该方案进行差异表达。因此，我们比较了禁食和禁食/参考小鼠肝脏RNA的基因表达谱(数据集S1). 该分析表明，1063和803基因的表达分别随着再喂养而增加或减少。GO分析显示，正如预期的那样，脂肪生成和生物合成代谢的基因增加，脂肪酸氧化和分解代谢的基因减少。我们根据再喂养差异调节的显著性对基因列表进行排序，然后使用Kolmogorov–Smirnov（KS）测试询问含有SREBP-1c结合位点的基因如何分布在表达列表上(18). 分析表明，SREBP-1c靶基因高度富集，具有差异表达的基因(图4;P（P）=1.5e-14）。高度相关性表明，ChIP-seq分析确定的大多数SREBP-1结合位点在功能上很重要。

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图4。

基因集富集分析。分析了ChIP-seq峰在参考肝和空腹肝的表达阵列数据集中的表现，如文中所述(18). 微阵列中所有基因的表达值根据折叠调节（从禁食到参考）在x个轴。该图在横坐标上的完整差异表达数据集的纵坐标上绘制了一个连续富集（KS）分数。排名差异表达列表中ChIP-seq数据集中每个基因的位置在图表顶部显示的水平轴上以细长的垂直线表示。在这里，ChIP-seq基因在差异排列的基因顶部的聚类是显而易见的(P（P）=1.5 e-14）。

我们还对通过禁食/再喂养差异表达的基因的5′-侧翼区域进行了无偏搜索，以寻找可能出现的保守基序。有趣的是，前面描述的SREBP-1c基序再次成为使用该无偏数据集的顶部基序，进一步支持SREBP-1c在调节禁食/再喂养期间系统基因表达变化中的关键作用。

讨论

我们在接受禁食/高碳水化合物喂养方案的小鼠肝脏染色质中发现了426个SREBP-1结合位点，已知该方案可显著增加肝脏中主要SREBP-1c亚型核SREBP-2c的肝脏水平。有趣的是，52%的结合位点位于定位基因的TSS附近(图2). 这是不寻常的，因为大多数关于转录因子结合位点的全基因组报告都没有显示出与已知基因位置相关的特定聚集或关联(19–22).

我们还表明，位于SREBP-1结合峰最近的基因的身份与禁食/禁食小鼠肝脏RNA分离的差异表达基因之间存在高度相关性。由于核SREBP-1c水平在禁食期间非常低，并且由高碳水化合物喂养显著诱导，因此此处确定的结合位点可能在功能上很重要。

SREBP是基本螺旋环-螺旋（bHLHL）亮氨酸拉链类转录因子的成员，大多数bHLH蛋白二聚并结合到反向重复的“E-box”元件(23). 核心电子框显示5′-CANNTG-3′，各个家族成员对中心和侧翼残基的特定碱基表现出独特的偏好。所有3种SREBP在体外与电子盒5′-CACGTG-3′亲和结合(24); 然而，在迄今为止仔细分析的所有启动子中，没有一个被证明依赖于电子盒被SREBP激活(2). 第一个特征良好的功能性SRE来自人类LDL受体启动子(25)，用于亲和纯化和随后克隆SREBP cDNA(26–28). 这个SRE元件，5′-ATCACCCCAC-3′，是一个直接重复，而不是一个反向重复E盒。允许SREBP在体外识别E-box和直接重复元件的DNA结合灵活性归因于SREBP特有的特征性酪氨酸残基(24). 所有其他与E-box结合的bHLH蛋白在这个位置都含有精氨酸，这使得DNA接触对于E-box元件的特异识别至关重要(29).

关键的酪氨酸允许SREBP DNA结合域采用改变的构象与直接重复的SRE元件特异性相互作用(29). 我们发现酪氨酸残基对含SRE启动子的营养调节反应至关重要(30). 由于这种酪氨酸对SRE元件结合和固醇依赖性调节至关重要，体内调节的SRE可能不包含E-box基序，而是类似于LDL受体启动子元件的某种形式的直接重复SRE。与这一预测一致，我们的ChIP-seq结果在76%的SREBP-1结合峰中确定了直接重复SRE 5′-AACTACANNTCCC-3′的功能变体作为体内识别位点。

在启动子激活研究中，SREBP本身是弱转录激活子，需要邻近的协同调节位点才能有效激活和调节营养(16). 转录因子Sp1、NF-Y/CBF和CREB在不同的SREBP-应答启动子中均起协同调节作用(2,17). 与这些早期研究一致，我们的全基因组分析确定了一个Sp1位点，位于426个SREBP-1结合峰中的215个峰附近。然而，在全基因组范围内进行分析时，预测的NF-Y和CREB结合位点并没有显著丰富。

当使用GO软件分析最接近SREBP-1峰值的基因时，脂质和碳水化合物代谢的簇如预期般丰富。此外，与细胞膜靶向和运动、凋亡、细胞增殖和蛋白水解相关的GO类别显著增加(表S3). 这些类别很有趣，因为众所周知，SREBP经历了从内质网到高尔基体的调节行程，然后是蛋白水解成熟(9)和SREBP也与细胞增殖和凋亡信号相关(11–13).

我们的分析可能代表了SREBP-1c的结合模式，因为它是主要的肝脏亚型，并且是由这里使用的高碳水化合物再喂养方案特异性诱导的（参考文献。31;图S1然而，由于SREBP作为二聚体发挥作用，1c单体可以与SREBP-1a和SREBP-2自由二聚(32)，我们不能排除此处确定的一些结合位点来自不同单体组合的可能性。将这些结果与未来在仅表达单个SREBP亚型的条件下进行的实验进行比较将非常有趣。

我们的研究确定的SREBP-1c结合基序对应于500多个人类启动子中确定的基序，并且在不同哺乳动物物种的317个启动子中保守(7). 虽然早期的报告揭示了图案的保存(7)，相应的转录因子未知。我们的研究表明，未识别的转录因子是SREBP-1c。

利用ChIP芯片上杂交技术对培养的人肝癌HepG2细胞SREBP-1结合进行全基因组分析，确定E-box为SREBP-结合的首选位点(33). 与我们研究的差异可能是使用了培养细胞系，并且在所有检测的培养细胞系中，包括HepG2，SREBP-1a比SREBP-1 c更丰富(34). 需要进行更多研究来进一步评估这一点。

材料和方法

补充材料

致谢。

脚注

工具书类