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公共科学图书馆一号。2009; 4（8）：e6722。
2009年8月24日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0006722
预防性维修识别码：PMC2726947型
PMID：19701462

人和猴胚胎干细胞衍生脊髓运动神经元的高效分化和富集

田木和田,1,* 本田牧本,1 伊苏纳里·米纳米,1 诺里·图伊,1 Amagai宇治,1 Norio Nakatsuji（中津治）,2,三和Kazuhiro Aiba先生1,*
约瑟夫·纳伊鲍尔，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

背景

对于严重的运动神经元疾病，目前还没有治愈或有效的治疗方法。由于技术和伦理原因，从人体组织中获得幼稚的脊髓运动神经元（sMN）进行研究是极其困难的。人类胚胎干细胞（hESCs）是替代来源。已经报道了几种MN分化方法。然而，大多数方法都没有考虑到幼稚sMN的高效生产和培养成本。

方法/主要发现

我们旨在建立高效生产和富集来自多能干细胞的sMN的方案。Nestin+神经干细胞（NSC）簇由Noggin或BMP信号的小分子抑制剂诱导。神经干细胞簇分离后，在含有FGF2的漂浮培养物中形成神经球。神经球中神经干细胞的数量可以通过多次传代扩大到30倍以上。在单层培养中，用全反式维甲酸（ATRA）和Shh激动剂将分离的神经球分化一周后，观察到超过33%的HB9+sMN祖细胞。HB9+sMN祖细胞通过梯度离心浓缩至80%纯度。在ATRA/SAG治疗后的几周内，这些HB9+细胞分化为电生理功能细胞，并与肌管形成突触。

结论和意义

我们在这里建立的一系列程序，即神经诱导、NSC扩增、sMN分化和sMN纯化，可以提供大量来源于人和猴多能干细胞的原始sMN。使用小分子试剂可以降低培养成本。

介绍

脊髓运动神经元（sMN）是中枢神经系统（CNS）中的细胞，将轴突投射到CNS外，并通过神经肌肉接头直接或间接控制肌肉。众所周知，sMN的分化在小鼠胚胎脑发育过程中受时空控制[1]–[9]全反式维甲酸（ATRA）和声波刺猬（Shh）的联合应用对于适时从神经干细胞（NSC）诱导sMN至关重要。体外小鼠胚胎干细胞的sMN分化[10],[11]和人类胚胎干细胞[12],[13]最近有几个团体报道了这一情况。小鼠ES细胞/hESC衍生的sMNs也可能是研究CNS神经元发育中基因调控途径和蛋白质组学的有用模型。

运动神经元疾病（MND），如肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓性肌萎缩（SMA）是进行性神经疾病，在许多情况下表现出严重症状。目前尚无治愈或有效治疗MND的方法。hESC衍生sMNs的移植是一种临床应用的治疗方法，但仍有许多具有挑战性的安全问题需要克服。相比之下，MND模型的生成在再生医学和药物应用的基础研究中可能有用，因为ESC具有优势属性，例如统一的遗传背景和高质量地分化为所有类型的细胞的能力[14].

药物研发需要大规模低成本的培养系统。神经圈培养是提高脑源性神经干细胞数量的典型方法[15]尽管神经球被认为是由多能干细胞和神经祖细胞组成的异质群体[16],[17]一些生长因子，如成纤维细胞生长因子2型（FGF2）和表皮生长因子（EGF），对神经干细胞的增殖或维持至关重要[18]–[20]虽然小鼠和人类ESC衍生的神经干细胞都可以形成神经球样细胞聚集体[21],[22]目前尚不清楚大规模培养神经球对于扩张ESC衍生的神经干细胞和维持其分化能力是否可行。

小分子化合物可用于构建稳定且低成本的培养系统。一些化合物被报道为细胞内信号分子（如Shh）的拮抗剂或激动剂[23]、FGF2[24]或Wnt蛋白[25]虽然这些化合物的特异性一直存在争议，但如果这些化合物在ESCs分化中发挥适当的作用，则可以降低运行成本。

由于细胞群的纯度在许多生物检测中都很重要，因此需要从异质性群体中分离感兴趣的细胞的技术。不幸的是，尚未为sMN排序确定适当的特定表面标记。尽管鼠标[7],[26]和人类[27]sMNs可以使用由sMN特异性启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白进行纯化，由于异位转基因表达，纯化的sMN还不是原始细胞。梯度离心法已用于从雏鸡中分离sMN[28]和胚胎小鼠脊髓[29],[30]，但还没有使用这种方法分离人类胎儿或人胚胎干细胞衍生sMN的报告。

因此，在本研究中，我们研究了从人胚胎干细胞衍生的sMNs的高效生产和富集。在单层培养系统中，通过骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂Noggin或小分子化合物Dorsomorphin诱导人类ESC分化为NSC。这些人胚胎干细胞衍生的神经干细胞默认具有吻侧特征。NSC在含有ATRA和Shh或SAG（Shh的激动剂）的培养基中分化为sMNs。在FGF2存在下，通过可通过的神经圈悬浮培养也可以实现sMN的高效扩增。此外，通过梯度离心对sMN进行了高度纯化，尽管需要进一步优化才能获得更高的效率。利用上述技术的组合，我们从人类胚胎干细胞中建立了高效的sMN生产。与以前的报告相比，这些技术在成本和时间上都有所改进。

材料和方法

人胚胎干细胞诱导脊髓运动神经元

人类胚胎干细胞（hESCs；KhES-1、KhES-2和KhES-3，传代数约为30–70）和食蟹猴ESCs（CMK-6）分别来自京都大学边境医学研究所和三菱Tanabe制药公司。根据日本教育、文化、体育、科学和技术部制定的人类胚胎干细胞利用指南对待人类胚胎干系统。人胚胎干细胞和猴胚胎干细胞的维护程序与前面描述的基本相同[31]简而言之，在灵长类ES培养基（ReproCELL，日本东京）中，用丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞培养hESCs或猴ESCs，补充5 ng/ml FGF2（日本和谷）。为了获得两种ESC衍生的神经干细胞或神经祖细胞，我们修改了杰拉德的方法等.[32]为了进行神经诱导，使用细胞过滤器（BD-Falcon，Franklin Lakes，NJ）选择直径为40–70µm的分离ES菌落，并将其镀上聚赖氨酸/层粘连蛋白（PLL/LM；均来自密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）-N2B27神经分化培养基中的涂布培养皿（补充N2的DMEM/F12和补充B27的神经基底培养基的1∶1混合物[均来自纽约州格兰岛吉布科市]，补充100 ng/ml小鼠或人类重组诺金（研发系统）或200 nM多索吗啡（宾夕法尼亚州普利茅斯会议，BIOMOL）在前10天作为BMP信号的抑制剂。每两天更换一次培养基（P1 in图1A). 用200 U/ml胶原酶和1 mM CaCl将初级菌落分裂成小团块2将其放入新的PLL/LM涂层培养皿中，并用补充有BMP抑制剂的N2B27培养7天（P2图1A). Noggin处理的细胞形成放射状簇，即P2期的神经花结(图1).

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诺金处理诱导灵长类胚胎干细胞的神经分化。

（A） 图中显示了灵长类胚胎干细胞高效运动神经元分化系统的示意程序。红色文本显示中等成分，蓝色框中的白色文本显示文化日。（B–G）KhES-1人或CMK6食蟹猴ESC在重组小鼠Noggin存在下培养10天（第1段；P1、B和F）和7天以上（第2段；P2、C和G）。用4%PFA固定细胞，并用针对特定标记物的抗体进行染色：Nestin(NES：神经外胚层)，Desmin公司(DES：中胚层)，α-胎蛋白(AFP：内胚层)，和10月4日(OCT：未分化ESC)在P1和P2。BF图像中的黑色条和NES图像中的白色条表示25µm（B）。多索啡肽诱导的神经分化如D和E所示。

为了进行sMN分化，P2细胞被Accutase（Innovative Cell Technologies，Inc.，San Diego，CA）分离，并在PLL/LM加上人类血浆纤维结合蛋白（Chemicon，Billerica，MA）涂层培养皿（PL/LM/FN）上以1000个细胞/cm的速度培养2在补充有ATRA（Sigma）和人类重组Shh（R&D系统）或SAG（Alexis，San Diego，CA）的N2B27中培养7天，然后在含有10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF；R&D Systems）、10 ng/ml胶质细胞源性神经生长因子（GDNF；R&D Systems再坚持2周或更长时间。

神经圈培养

神经干细胞在P2末端分离并在10时培养6在10 ng/ml FGF2和50 ng/ml肝素（西格玛）存在下使用N2B27细胞/ml，持续2周或更长时间。通过温和离心收集神经球，并与Accutase在37°C下孵育10分钟。用1ml微量移液管分离细胞，并用N2B27培养基清洗以去除残余酶。神经球在含有FGF2和表皮生长因子（EGF；R&D Systems）的N2B27中传代数次。

免疫细胞化学

细胞在室温（RT）下固定在新鲜制备的4%多聚甲醛（PFA）中10分钟，并在室温下用0.5%Triton-X（和谷化学，日本东京）渗透5分钟。本研究中使用的主要抗体包括针对Nestin（1∶200；Chemicon）、Sox1（1∶20；Sigma）、，胆碱乙酰转移酶（ChAT）（1∶100；Chemicon）、突触素（1∶200；Chemicocon，Nestin（1∶200；Chemicon）、Olig2（1∶200:IBL，日本高崎）、MNR2（HB9，1∶5）、Isl1（1∶5；DSHB，爱荷华州爱荷华市）、BF-1（1∶400；亲和生物试剂，Golden，CO）和AFP（1∶200m；Sigma）。

作为二级抗体，使用了山羊抗鼠免疫球蛋白G Alexa Fluor 488和568，以及山羊抗兔Alexa Fluor 488-568（均为1∶1000；Molecular Probes Inc.，Eugene，OR）。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma）对细胞进行复染，以显示所有细胞核。使用带有适当滤光片组（日本东京奥林巴斯）的倒置奥林巴斯IX71外荧光显微镜，使用带有DP软件版本2.1、1.83（奥林巴斯公司）的奥林巴斯DP70 CCD相机上的单通道采集进行图像采集。

逆转录聚合酶链反应

使用RNeasy试剂盒提取总RNA（日本东京齐根）。使用2微克总RNA，通过高容量cDNA逆转录试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在20微升反应规模下合成cDNA。在7500实时PCR系统（Applied Biosystems）上使用适当的反应体积（0.5µl）对SYBR Green Master Mix进行定量PCR（qtPCR）。相对基因表达水平用比较CT型方法进行三次实验。本研究中使用的引物列于表S1.

梯度离心法纯化运动神经元

为了纯化ESC衍生的sMN，我们应用了Gingras程序等.[29]稍作修改。sMN用Accutase酶解并用N2B27离心洗涤一次，然后再悬浮在3 ml含有0.004%DNaseI（Sigma-Aldrich）的DMEM/F12中。梯度试剂Biocoll（德国Biochrom AG）用L15培养基（Gibco）稀释至1∶1.76，并将4ml放入15ml锥形管（BD-Falcon）中。将细胞悬液轻轻置于梯度试剂上。覆盖层示意图如所示图S7A在4°C下500×g离心20 min后，收集梯度界面处的细胞并溶解在N2B27培养基中，然后在适当的细胞密度下用生长因子培养。过夜培养后，固定细胞以测量sMN的富集。

ENStem-A文化

H9-hESC衍生的神经祖细胞（ENStem-A™）从Millipore（Billerica，MA）获得。ENStem-A细胞根据制造商的方案进行扩增。为了形成神经球，将ENStem-A细胞在含有10 ng/ml FGF2的N2B27培养基中以10000个细胞/ml的速度培养7天。神经球用Accutase解离，然后在含有10µM ATRA和10 nM SAG的N2B2培养基中用PLL/LM涂层培养皿培养。每3天更换一次培养基。2周后，固定细胞进行免疫细胞化学分析。

补丁卡记录

在ATRA/SAG治疗后培养14天的人ESC衍生sMN用于电生理分析。HEKA EPC10放大器用于记录全细胞膜片钳配置中的数据（HEKA Instruments Inc，Bellmore，NY）。外部溶液（140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM CaCl2，1 mM氯化镁2和10 mM葡萄糖）用NaOH调节至pH 7.2。用CsOH将移液管溶液（147mM CsCl、5mM EGTA、2mM ATP Mg和10mM HEPES）调节至pH 7.2。在全细胞电流灯记录中，通过记录吸管进行细胞内电流注射。电流脉冲的持续时间为1秒，振幅为50 pA。在谷氨酸应用实验的全细胞电压灯记录中，用含有100µM谷氨酸的外部溶液灌注sMN 20秒。通过将膜电位保持在−60 mV，然后以10-mV的增量（从−60 m V到40 m V）逐步传递去极化脉冲500 ms，从而获得电流-电压关系。

骨骼肌细胞共培养实验

未分化的小鼠成肌细胞C2C12细胞保存在含有20%FBS的DMEM中。根据之前的报告，我们进行了共培养程序[33]C2C12细胞在含有2%马血清（Sigma）的DMEM中分化4天。C2C12衍生肌管与hESC衍生sMNs在N2B27培养基中共培养4至10天。用抗突触素抗体和Alexa Fluor 594结合的α-银环蛇毒素（分子探针）进行免疫细胞化学。

结果

人胚胎干细胞高效神经诱导

sMN与人胚胎干细胞的分化程序如图所示图1A作为第一阶段，神经干细胞由KhES-1（K1）hESCs和Noggin诱导，如材料和方法10天后，神经外胚层标记物Nestin阳性细胞集落出现频率较高(图1B). 相反，K1衍生细胞集落中未检测到Desmin+中胚层细胞或AFP+内胚层细胞(图1B)但在K2-和K3-衍生菌落中观察到一些阳性细胞(图S2A和C). 用胶原酶分离神经外胚层细胞集落，并将其重新放置在PLL/LM涂层培养皿上7天（神经诱导后共17天）。巢蛋白+神经花环（NRs）在移植后7天内出现(图1C). 在P2期，一些K2和K3菌落中仍观察到AFP的强表达，但只有少数K1菌落中检测到AFP表达非常弱(图1C,图S2B和D). 在三个人胚胎干细胞系的培养物中，没有观察到Desmin+或Oct4+菌落或只有很少的菌落(图1C,图S2B和D). K1-hESCs中的NR菌落比其他两个品系更紧密(图1C,图S2B和D). Noggin也从猴ESCs中诱导Nestin+神经外胚层细胞(图1F和G). 此外，我们检查了巢蛋白的免疫染色对神经干细胞是特异性的，因为巢蛋白在一些非神经细胞中表达，如卫星细胞[34]P2的Nestin+细胞不表达其他分化标志物，如Oct4、Desmin和AFP，而另一种神经上皮标志物Sox1在Nestin+细胞中表达(图S1). 这些结果表明，Nestin的免疫染色对神经外胚层细胞具有特异性。

最近，BMP信号的化学抑制剂多索吗啡（DSM）代替诺金用于诱导小鼠ESC的心肌分化[35]因此，我们检查了DSM在神经诱导人胚胎干细胞方面是否有效。K1-hESCs以与Noggin处理相同的方式在含有200 nM DSM的N2B27中培养。DSM处理的K1-hESCs在神经诱导方面与Noggin处理的培养物中观察到的结果相似(图1D和E). 这些数据表明，BMP抑制剂DSM可以取代诺金作为神经诱导剂。

人胚胎干细胞源性神经干细胞向脊髓运动神经元的分化

因此，我们选择K1-hESC系进行sMN分化，因为在三种hESC系中，Noggin的神经诱导效果最好(图1和图S2). 在含有ATRA和Shh的N2B27培养基中，将来自hESCs或猴ESCs的分离NR菌落用纤维结合蛋白（PLL/LM/FN）涂布在PLL/LM上。1µM ATRA和500 ng/ml Shh的培养条件比对照培养更能促进细胞增殖(图2A-H). 第7天，在ATRA/Shh处理的培养物中观察到大量HB9+或Isl1+sMN(图2B、D、F、H、I和J). 相反，在对照培养物中观察到很少有HB9+和Isl1+细胞(图2A、C、E、G、I和J). 较高浓度的ATRA（5µM）对提高hESC或猴ESC衍生NSC中HB9+或Isl1+细胞数量没有影响(图2I和J).

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ATRA/Shh促进脊髓运动神经元的分化。

分离的NRs来源于hESCs或猴ESCs，在ATRA和Shh存在下培养7天。当在分化培养物（B、D、F和H）中添加1µM ATRA和500 ng/ml Shh时，观察到大量的βIII-tubulin+/HB9+（B和F）和βIII-tubulin+/Isl1+细胞（D和H）。A–H中的插图显示高放大倍数。（I和J）根据人胚胎干细胞分化培养物（I）和猴胚胎干细胞培养物（J）计算HB9或Isl1阳性细胞的比率。A中的比例尺表示100µm。插入的比例尺指示10µm*p<0.05（n=5）。

接下来，我们研究了ATRA/Shh治疗后是否改变了区域特征。BF1是头侧脑标记物。在对照培养物中观察到大量BF1+细胞，但没有HB9+sMNs(图3A、C和E). 相反，在ATRA/Shh处理的培养物中观察到许多HB9+细胞，但没有观察到BF+细胞(图3B、D和E). 在猴ESC分化培养中也观察到类似的结果(图S3C). 这些发现表明，来自NRs的神经元具有吻侧脑的特征，是一种默认状态，ATRA/Shh治疗强烈改变了从吻侧脑到尾侧脊髓的神经元特性。

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ATRA/Shh强烈改变Rostrally至Caudaly的特征。

（A–D）对照组（A和C）或1µM ATRA和500 ng/ml Shh培养条件（B和D）中的脊髓运动神经元标记物HB9和吻侧神经标记物BF1。（E） ATRA/Shh处理强烈诱导HB9表达，而BF1表达受到强烈抑制*p<0.05（n=3）。

通过ATRA/Shh处理，sMN标记物如HB9、Isl1和Olig2的基因表达水平分别上调了1.3倍、8.5倍和5.2倍(图4A-C)此外，尾侧脑标记物HoxB4也显著上调(图4D). 猴子ESCs也获得了类似的结果(图S4). 另一方面，ATRA/Shh处理降低了BF1的表达水平(图4E). 这些qtPCR结果表明，ATRA/Shh强烈诱导包括脊髓标记物在内的sMN标记物，但抑制了头侧脑标记物。βIII-管蛋白表达水平无显著差异，表明ATRA/Shh未改变神经发生本身(图4F).

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ATRA/Shh诱导脊髓特异性和运动神经元特异性基因的表达。

（A–C）1µM ATRA和500 ng/ml Shh处理上调sMN特异性基因的表达，如HB9、Isl1和Olig2。（D） 与没有ATRA/Shh的对照组相比，ATRA/SAG处理的细胞中脊髓特异性基因HoxB4也上调。相反，与对照培养物（E）相比，ATRA/Shh处理培养物中的头侧脑标记物BF1表达下调。（F） ATRA/Shh培养物与对照组之间的神经元标记物βIII-管蛋白的表达水平无统计学差异。对照培养物中的基因表达水平定义为1.0.*p<0.05，**p<0.005（n=3）。

小分子药物SAG比Shh产生更多的脊髓神经元

如DSM结果所述，化学试剂对于构建稳定的培养体系非常有用。以与DSM相同的方式，我们尝试使用Shh激动剂SAG代替重组Shh蛋白。据报道，SAG可直接抑制被另一Shh受体Patched组成性抑制的Smoothened受体，并激活下游信号(图S3A)[36]将SAG（10至1000 nM）添加到带有1µM ATRA的游离NRs培养物中，以评估sMN分化诱导活性。SAG处理的和Shh处理的培养物之间HB9+或Isl1+细胞的比率没有显著差异(图5A). 使用抗Isl1和βIII-管蛋白抗体的代表性染色如所示图5B和图S3B在ATRA/SAG培养基中sMN特异性基因（HB9和Isl1）的基因表达水平与ATRA/Shh培养基中的相似或更高(图5C和D). ATRA/SAG培养物中的罗斯特拉尾侧基因（HoxB4和BF1）的表达方式与ATRA/Shh培养物中类似(图5E和F). 即使存在ATRA，SAG的最高浓度（1000 nM）也不会抑制BF1的表达(图5F)可能是因为SAG的作用以剂量依赖的方式改变[37]SAG未显著改变βIII-管蛋白的表达水平(图5G)表明SAG不影响神经发生。这些结果强烈表明，SAG分子可能是sMN分化中Shh的替代物。在猴子ESCs中也获得了类似的结果(图S3C)也存在于ENStem-A、H9-衍生神经祖细胞中(图S5). 这些结果表明，我们的sMN分化方案可以应用于其他物种的ESCs，甚至可以应用于不同方法诱导的人胚胎干细胞衍生的神经干细胞，尽管如上所述，在一些人胚胎干系统系之间的反应略有不同。

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Shh激动剂是一种相当于Shh蛋白的运动神经元分化因子。

（A） ATRA（1µM）和SAG（10至1000 nM）处理以及1µM-ATRA和500 ng/µl Shh处理都大大增加了HB9+和Is11+细胞。（B） 在ATRA/SAG培养中观察到Isl1/βIII-管蛋白双阳性细胞。白色条表示20µm。（C–G）ATRA/SAG处理培养物中基因表达水平的定量。ATRA/SAG治疗上调了两个sMN特异性标记物HB9和Isl1（C，D）。脊髓标记物HoxB4也上调（E），而前脑标记物BF1通过添加ATRA/SAG（10和100 nM）下调（F）。神经细胞标志物βIII微管蛋白的表达变化没有统计学意义（G）*p<0.05，**p<0.005（n=4）。

成熟运动神经元具有电生理功能并与肌管形成突触

ATRA/SAG处理的hESC衍生sMN在补充BDNF、NT-3和GDNF的N2B27培养基中再维持2周或更长时间。在这个培养期内，hESC衍生的神经元变成sMN，表达HB9和胆碱乙酰转移酶（ChAT），这是合成乙酰胆碱所需的关键酶(图6A)表明这些双阳性细胞是成熟的sMN。通过电生理分析进一步检测成熟sMN的这些功能。通过电压钳观察到动作电位的重复放电响应1秒电流脉冲（50 pA）的注入(图6B). 当电压保持在−60 mV时，通过电压钳观察到对100µM谷氨酸的应用产生的内向电流(图6C). 电压箝位记录和电流密度-电压关系显示，随着去极化电压阶跃从−60 mV到40 mV，内向电流发生变化(图6C). 这些数据表明，通过我们的分化方案，人胚胎干细胞可以产生成熟的功能性sMNs。

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成熟的运动神经元具有电生理功能，并与肌管形成突触。

（A） 在长期培养的人胚胎干细胞衍生神经元中检测到成熟的sMN标记物胆碱乙酰转移酶（ChAT）。采用小鼠E14.5脊髓原代培养物（小鼠SC）作为阳性对照。白色条表示20µm。（B） 电流钳记录显示，在注入1秒电流脉冲（50 pA）后，动作电位重复放电。（C） 电压钳记录显示，在添加100µM谷氨酸（V举办 = −60毫伏）。红线表示谷氨酸应用（D和E）。电压钳记录（D）和电流密度-电压关系（E）显示了对从−60 mV到40 mV的去极化电压阶跃的内向电流。（F和F’）βIII-管蛋白+神经元（绿色）的末端与C2C12衍生肌管（箭头）上乙酰胆碱受体标记物α-银杏毒素（红色）的信号共定位高倍照片（F’）显示F（G和G’）中开放的白色方形区域。在神经突触标记Synapsin（绿色）附近检测到α-银环蛇毒素信号（红色，箭头）。G中的插图显示高倍图片。F'和G'中的条表示20µm。

此外，我们检测了人胚胎干细胞衍生的sMN是否可以形成神经肌肉接头。hESC衍生的sMN与小鼠C2C12衍生的肌管共培养4至10天。抗βIII微管蛋白或突触肽的抗体和荧光偶联的α-银环蛇毒素用于检测神经肌肉接头。α-银环蛇毒素信号与神经元轴突终末共定位(图6F和箭头图6F'），并在神经突触标记Synapsin信号附近的肌管中检测到（图6G和G'). 这些数据表明，来源于人胚胎干细胞的sMN具有形成神经肌肉接头的能力在体外.

通过神经圈培养高效生产sMN

神经圈培养通常用于评估脑源性神经干细胞的多潜能以及神经干细胞增殖[15],[38]此外，神经球培养可用于扩展ESC衍生的NSCs[33],[39]因此，我们下一步的目标是通过在含有生长因子的培养基中进行神经圈培养来扩大ESC衍生神经干细胞的数量。将来自NRs的初级神经球培养在含有20 ng/ml FGF2（NS-FGF）或EGF和FGF2两者（NS-EGF/FGF）的N2B27培养基中，培养温度为100个细胞/µl(图7A). 10至14天后，在不含生长因子的对照N2B27培养基中只观察到少数神经球(图7A)仅在含有EGF的培养基中很少有神经球形成（数据未显示），而在NS-FGF和NS-EGF/FGF中形成了许多神经球，并且NS-GGF和NS-EGF/FCF的形成率没有显著差异(图7A). 当将一种FGF2信号特异性抑制剂SU5402添加到含有FGF2的培养基的神经球培养物中时，神经球的形成被完全抑制（数据未显示）。因此，FGF2是NR衍生神经球形成所必需的。此外，随着NS-FGF和NS-EGF/FGF连续传代次数的增加，神经球的形成率逐渐降低(图7A). NS-FGF和NS-EGF/FGF之间没有形态学差异(图7B)但我们发现sMN分化效率存在差异。NS-FGF和NS-EGF/FGF中的细胞都能分化为HB9+sMNs，尽管神经球介导的HB9+s MNs在每一代逐渐减少(图7C). 然而，NS-EGF/FGF的HB9+细胞在间隔传代后显著减少(图7C和D)和吻侧脑标记物（BF1）阳性细胞根据传代次数增加(图7D). 这些结果表明，含FGF2培养基中的神经球可以通过ATRA/Shh处理维持向HB9+sMNs分化的能力，但FGF2条件下的EGF不能。通过NS-FGF培养，sMN可还原神经球可以被扩增。简单计算表明，HB9+分化潜能超过20%的细胞通过三代NS-FGF扩增30倍以上(图7C). 猴子ES-衍生神经球也获得了类似的结果(图S6). 因此，NS-FGF培养方法可以稳定地扩大sMN群体。此外，NS-FGF的冷冻库存可以保持增殖和分化为sMN的能力（数据未显示）。

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FGF2处理的神经球比EGF/FGF2处理的神经元球产生更多sMN。

（A） FGF2和EGF/FGF2处理的神经球均经过传代，但随着传代次数的增加，球数逐渐减少。（B） 两种不同培养条件下的神经球在形态上没有差异。黑色条表示100µm。（C） EGF/FGF2处理的神经球中HB9+sMN分化率的下降速度快于FGF2处理的神经细胞。（D） 来源于EGF/FGF2处理的神经球的分化细胞的免疫细胞化学。白色条表示20µm*p<0.05，**p<0.005（n=4）。

梯度离心法纯化脊髓运动神经元

尽管我们的分化方案能够高效分化sMNs，但分化效率并不是100%，而且非MNs在培养物中共存。因此，我们试图从来源于人胚胎干细胞的分化细胞混合群中分离sMNs。目前，还没有确定的sMNs的细胞表面标记物，但一些报道描述了从鸡胚脊髓中纯化原代MNs[20],[28],[30]，老鼠[30],[40],[41]、和鼠标[29],[42],[43]采用梯度离心法。为了在初始条件下纯化人胚胎干细胞衍生的sMN，将两种不同密度的Biocoll重叠，制备不连续梯度，然后将细胞置于梯度上(图S7A). 离心后，仔细收集两个界面，并进行免疫化学。结果表明，界面2中78%的细胞为HB9阳性(表1)表明梯度离心法富集HB9+sMNs超过2.5倍。几乎一半的细胞群在界面2中恢复(表1). 此外，尽管结果显示回收率较低，但猴ESC衍生sMN也通过相同的方法富集(图S7B,表S2). 这些数据表明，在没有任何细胞表面标记物或报告基因的情况下，可以从人胚胎干细胞/猴胚胎干细胞衍生分化细胞的混合物中获得原始sMN。

表1

梯度离心法富集HB9+运动神经元。
%HB9的+%的恢复
总计29.5(100)*
接口143.614
接口278.348
弹丸25.638

用抗HB9和βIII-管蛋白抗体对分离的细胞进行免疫染色。

*总馏分回收率为100%。回收率根据βIII-管蛋白阳性细胞的数量计算。HB9+细胞的比率按以下公式计算：（HB9+的细胞数/总细胞数）×100。

讨论

hESCs高效生成sMN需要四个步骤：1）通过Noggin或DSM诱导神经细胞，2）培养hESC衍生NSC的神经球，3）通过ATRA/Sh或ATRA/SAG分化sMN，4）通过梯度离心纯化sMN。我们的方案不仅适用于KhES1 hESCs，也适用于H9 hESCs。虽然之前已经报道过每一步的方法，但我们修改了程序以提高分化的效率，并且我们表明，这些技术的结合导致了大量幼稚的sMN，特别是通过大规模NSC神经圈培养和梯度离心分离sMN群体后可以获得。富含人胚胎干细胞衍生的幼稚sMN不仅可用于药物筛选工具，还可用于移植临床应用[44]在本研究中，我们使用ESC衍生sMN的组合技术可能适用于存在适当外源性因子的其他类型的神经细胞[9].

分化过程中的小分子化合物

我们发现DSM或SAG等小化合物可以取代重组蛋白作为神经诱导或sMN分化所需的因子(图5和图S3). DSM或SAG的作用等于或大于重组蛋白的作用。然而，我们发现免疫染色和基因表达模式之间存在一些差异(图5A、C和D). 尤其是在1000 nM SAG/1µM ATRA时，HB9 mRNA水平下降(图5C)，而HB9+细胞数量没有改变(图5A). 此外，Isl1的基因表达水平以SAG剂量依赖性的方式上调(图5D)，尽管Isl1+细胞没有增加(图5A). 这些差异有几个原因。首先，SAG在高浓度下可以作为Shh抑制剂[37],[45]因此，高浓度SAG可能下调HB9 mRNA水平(图5C). 其次，我们推测，10 nM SAG足以从几乎所有Shh-反应性NSC中产生HB9和Isl1阳性细胞，高剂量SAG（>100 nM）可能通过未知的SAG效应上调sMN（HB9-和Isl1-阳性细胞）中HB9或Isl1的基因表达。尽管SAG有一些未知的机制，但使用小分子有几个好处：与使用重组蛋白相比，它可以（1）降低培养成本和（2）提高培养稳定性。因此，小分子对于药物应用非常重要，例如高通量系统中的药物筛选或安全测试。

神经球培养扩大ESC衍生神经干细胞

在本文中，我们发现NS-FGF比NS-EGF/FGF产生更多HB9+sMNs(图7). 两种培养条件产生不同影响的原因尚不清楚。使用ESC衍生的神经干细胞形成神经球需要FGF2(图7). 先前的研究表明，FGF2本身起到尾化因子的作用[46]因此，FGF2的尾化效应可能有助于维持NS-FGF的sMN分化潜能，而EGF可能会取消FGF2尾化效应，但不会取消神经球形成效应，或者只是需要高剂量的ATRA和Shh才能从NS-EGF/FGF中分化sMN。从五个NS-EGF/FGF中检测到BF1+细胞(图7D)，但具体原因尚不明确。因此，需要进一步的实验来揭示神经圈文化后期出现这种现象的原因。

我们建立的神经圈技术可以将神经干细胞的数量增加30倍以上，同时保持sMN分化的效力(图7和图S5). 使用这种神经圈培养系统，可以制备出质量合适的大量NSC或sMN。我们目前正试图确定增加或维持HB9+分化潜能的培养条件，因为大规模实验需要维持HB9+sMN分化潜能。此外，这些神经球可以冷冻保存。冷冻保存的神经球可能会导致更快、更有效的sMN生产。

从ESC衍生的天真sMN的丰富

从人胚胎干细胞衍生培养物的混合群体中纯化或富集特定细胞非常重要。我们的分化方法可以产生sMNs，HB9+细胞在总细胞群中的平均比率为30%；换句话说，在细胞培养中还有其他类型的细胞，如神经干细胞、腹侧中间神经元和星形胶质细胞。当然，可以使用由特定启动子或特定细胞表面标记驱动的荧光报告子来分离纯群体[7],[47]然而，尚未报告sMN的特定表面标记。因此，我们尝试通过梯度离心法富集hESC衍生sMNs。我们的离心-丙醇将sMNs在界面2的纯度从30%提高到80%。界面1含有中等比例的HB9阳性细胞，但回收率较低。这一结果表明，我们的协议需要进一步优化，或者这些接口中的HB9-阳性细胞可能彼此不同。此外，猴胚胎干细胞的回收率远低于人胚胎干细胞(表1和表S2)，可能是因为这些物种的离解酶之间的敏感性差异。

总之，我们结合了相对简单的方法，在分化效率、hESC衍生神经干细胞的扩增和hESC派生的幼稚sMNs的富集方面取得了改进。我们在此建立的技术将适用于在大规模培养系统中制备细胞，这是药物发现和开发研究所需的。我们还建议，分离的人胚胎干细胞衍生的sMN可以成为临床和基础医学研究的重要材料。

最近，有报道称使用hESC衍生MN的ALS模型[48]–[50]当hESC衍生的MN与表达突变超氧化物歧化酶1（SOD1）的胶质细胞共同培养时，由于星形胶质细胞效应导致细胞死亡，即非细胞自主效应，HB9阳性神经元数量减少[48],[49]另一方面，使用突变体的另一种ALS模型SOD1标准-转染的MNs显示HB9启动子驱动的突变SOD1标准hESC衍生MNs的表达导致MNs减少，提示细胞自主性神经元死亡[50]因此，疾病发病和进展的机制仍然存在争议。hESC衍生MN的丰富种群将适用于ALS建模。

由我们的协议生成的功能性sMN可能在诸如使用人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞（hiPSC）的细胞库进行个性化医疗等应用中有效。以前曾产生过特定于患者的hiPSC[51]其中，SMA患者的hiPSC表现为细胞死亡表型[52]我们的sMN分化方案将有助于生成针对患者的hiPSC，用于疾病诊断、疾病机制研究以及药物筛选。此外，已经进行了广泛的努力来开发基于干细胞的细胞治疗[14],[53]因此，通过我们的方法从hESCs或hiPSCs中产生的功能性sMNs将有助于MNDs的治疗应用。

支持信息

图S1

巢蛋白免疫染色对神经干细胞具有特异性。（A–H，M–P）Nestin免疫染色在Noggin处理的人胚胎干细胞培养物第7天的P2期从未与其他非神经标记物重叠。（I–L）另一个神经干细胞标记物Sox1免疫染色与Nestin免疫染色重叠。

（8.54 MB畅通节能法）

图S2

其他人类胚胎干细胞系通过诺金处理诱导为神经细胞。另外两个人胚胎干细胞系，KhES-2或-3，用与KhES-1相同的方法与Noggin培养。尽管在低频率下观察到非神经细胞，但两种人胚胎干细胞系都分化为Nestin阳性细胞。白条表示25µm。

（7.34 MB畅通节能法）

图S3

SAG对猴ESC衍生神经干细胞的作用与Shh相同。（A） SAG直接激活Shh受体Smoothened，而不是抑制Shh的Patched抑制。下游转录因子（如Gli）被激活，用于转录最初由Shh信号转导的靶基因。（B） 在猴ES细胞源性神经元中观察到Isl1+和βIII-管蛋白+sMNs。白色条表示10µm。（C） SAG处理的培养物中检测到HB9+和Isl1+细胞，比率与Shh处理的培养液相同。在SAG处理的培养物和Shh处理的培养物中，Rostral脑标志物BF1阳性细胞也受到抑制，而对照培养物显示出高的BF1+比率*p＜0.05，**p＜0.005（n＝4）。

（1.90 MB畅通节能法）

图S4

ATRA/Shh诱导猴ESC衍生神经干细胞中脊髓运动神经元标记物的基因表达。脊髓标志物HoxB4（A）、sMN标志物如Olig2、Isl1和HB9（B–D）的表达水平在ATRA/Shh治疗后显著上调**p<0.005（n=3）。

（1.19 MB畅通节能法）

图S5

通过ATRA/SAG治疗从H9 hESC衍生的神经干细胞分化sMN。在14天的对照组和ATRA/SAG处理的ENStem-A培养物中经常观察到βIII-管蛋白阳性细胞。在ATRA/SAG处理的培养物中观察到强HB9阳性细胞，而在对照培养物中未观察到HB9阳性。白色条表示25µm。

（3.92 MB TIF）

图S6

猴ESC衍生神经干细胞的神经圈培养。（A） 在FGF2和FGF2+EGF条件下，传代过程中神经球形成率逐渐降低。（B） 在FGF2和FGF2+EGF条件下，HB9+sMN分化率在传代过程中逐渐降低。然而，FGF2+EGF条件下的比率下降速度比FGF2条件下更快*p<0.05（n=5）。

（1.21 MB畅通节能法）

图S7

用梯度离心法纯化猴ESC衍生的脊髓运动神经元。（A） 通过叠加三种不同密度的高氯仿试剂来制备不连续梯度。ESC衍生的sMN在梯度上轻轻覆盖。离心后，仔细收集两个界面。（B） 分离后第1天，用抗HB9和抗βIII-管蛋白抗体对细胞进行免疫染色。白色条表示20µm。

（1.64 MB TIF）

表S1

本研究中使用的引物。为了消除基因组DNA扩增的可能性，使用通用探针库项目（德国罗氏，https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/index.jsp). 在qtPCR之前，生成每个引物集的熔融曲线和标准曲线，以确认仅扩增出一个与看家基因β-肌动蛋白具有相同效率的扩增子。

（0.07 MB文件）

表S2

通过梯度离心法富集来自猴ESC的原始HB9-阳性sMN。与以下步骤和计算相同表1已执行。

（0.04 MB文件）

致谢

我们感谢Hirofumi Suemori博士（京都大学）为hESC培养提供建议，并感谢Yohei Okada博士（庆应义塾大学）为C2C12共培养系统提供建议。我们也感谢井上春久博士（京都大学）的有益讨论。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

资金：这项工作得到了日本新能源和工业技术开发组织（NEDO）的支持（项目代码：，P05010号). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

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