染色质结构对基因组分析中DNA处理的影响

序列读入偏差HMR公司,HML公司和亚砾岩区域

300块最小覆盖碎片(表S1)包括HML公司和HMR公司沉默的交配盒，证实了我们检测由于沉默而不能很好剪切的区域的能力。在300个区域中，159个（53%）位于亚粒区（端粒50千碱基对内），沉默蛋白也在那里形成抑制性染色质[12]–[14]作为酿酒酵母亚群基因组占13.4%，亚群区域的未覆盖DNA比例显著增加（p<10⁻¹⁶按χ²-统计数据）。在整个基因组中，只有亚聚集体区域异常地富含未被覆盖的片段(图1).

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图1

输入Seq覆盖下区域在染色体上的分布。

输入序列覆盖率低的区域的百分比，作为与端粒距离的函数，间隔为20KB。χ²每个图中显示了每个20KB区间的p值，将该区间中未被覆盖区域的分数与全基因组未被覆盖分数进行比较。蓝线表示全基因组覆盖下区域的平均百分比（7.6%）。

端粒重复序列阅读的过度表达

由于沉默染色质与输入读取的欠采样有关，我们询问其他染色质状态是否会扭曲相反方向的覆盖，从而导致读取密度增加。覆盖率最高的300个地区(表S2)，138（46%）位于端粒内，尽管端粒DNA仅占基因组的1.17%酵母菌属基因组数据库[15]端粒的覆盖范围显著增加。端粒内的中位输入覆盖率为128倍，而全基因组为16倍。基因组读取几乎没有观察到端粒增加，其中端粒覆盖率中值为11倍，而全基因组为8倍。端粒DNA的标准化覆盖率几乎与基因组的其余部分完全不重叠（Wilcoxon-Mann-Whitney p<10⁻¹⁶) (图2).

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图2

端粒中的高输入情商覆盖率。

端粒和非端粒区域的输入-Seq读取覆盖的箱线图，归一化为非交联基因组读取。端粒箱线图中显示了Wilcoxon-Mann-Whitney p值，它比较了端粒和全基因组DNA的输入覆盖率分布。箱线图中每个方框的顶部表示75%的百分位，底部表示25%的百分位数，方框内的粗条表示中间值。胡须延伸至最极端的数据点，该数据点最多为方框四分位范围的1.5倍。

转录因子结合位点和DNase I足迹的高覆盖率

通过分析超覆盖位置，我们注意到许多最富集的非端粒基因座位于基因间区域内。因为基因上游区域往往具有高组蛋白周转率，并且可能是核小体耗竭[16]–[18]，我们假设基因间DNA覆盖率的增加可能是由于DNA结合蛋白的存在及其对核小体定位和周转的影响。我们分析了4900个推测转录因子结合位点的读取密度，这些位点在密切相关的酵母物种中保守，并且有来自ChIP-ChIP实验的支持证据[19]。这些结合位点中的大多数可能代表真正的监管位点。结合位点的覆盖率远高于其余基因间区域(图3，上部面板）。通过相应的转录因子分离结合位点，几乎所有因子的输入读数都很高。在数据集中具有40个或更多结合位点的37个转录因子中，只有Ste12和Dig1两个转录因子的input-Seq覆盖率没有增加(表1).

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图3

蛋白质-DNA相互作用位点的高输入Seq覆盖率。

输入-Seq读取覆盖的箱线图，归一化为基因组读取。上面的面板显示了转录因子结合位点和全基因组输入覆盖率的箱线图。下部面板显示了DNase I抗性足迹的箱线图和输入序列覆盖的全基因组分布。蓝色是基因间区域的箱线图，黄色是编码区域的箱线上。箱线图中显示了Wilcoxon-Mann-Whitney p值，用于比较结合位点或DNA酶I足迹位点与全基因组DNA的输入覆盖率分布。

作为另一种测试，我们询问在蛋白-DNA相互作用的位点中输入覆盖率是否通常更高。作为这些区域的代理，我们使用假定的相互作用区域，基于全基因组体内DNA酶I足迹研究[20]事实上，在编码区和基因间区域内，覆盖率明显高于足迹(图3，下部面板）。

基因和启动子序列覆盖率的转录依赖性变异

在酵母和果蝇属，启动子组蛋白周转率与相邻基因的转录水平相关[17],[18]这种快速转换，再加上我们对结合位点和DNaseI足迹的高序列覆盖率的观察，促使我们询问基因或启动子的输入覆盖率是否与表达水平相关。

我们根据公布的酿酒酵母 [21]与全基因组编码覆盖率相比，低表达基因的读取次数明显较少（Wilcoxon-Mann-Whitney p=2×10⁻¹⁶). 覆盖率逐渐增加，跟踪表达水平，对于最高表达的基因，读取密度要高得多（Wilcoxon-Mann-Whitney p=10⁻¹⁶) (图4，上部面板）。在基因本身的上游，基因间区域显示出与下游基因高表达相关的增加覆盖率的类似模式(图4，下部面板）。

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图4

作为基因表达的函数，输入-Seq覆盖率。

作为基因表达水平的函数，输入-Seq读取覆盖率的箱线图归一化为非交联基因组读取。基于全基因组转录谱的RNA-Seq读取密度，输入-Seq覆盖率按表达水平进行分类（Nagalakshmi U.，2008）。上部面板显示基因的箱线图，下部面板显示基因间区域。Wilcoxon-Mann-Whitney p值比较了每个表达水平的输入覆盖率分布和全基因组DNA，显示在每个箱线图中。蓝线表示全基因组的中位输入-Seq读取覆盖率（编码为1.9，基因间区域为2.0）。

在不同输入Seq实验中，覆盖率的变化是可重复的

为了测试输入Seq覆盖模式的再现性，我们分析了来自四个额外样本的输入Seq读数。这四种输入来自于酿酒酵母/巴亚努斯酵母杂交二倍体（仅在两个标记位点上不同）。这些样品是在与上述分析所用实验室（耶鲁大学医学中心）不同的实验室（加州大学伯克利分校文森特·科茨基因组测序实验室）中制备和测序的。在四个样本的所有配对中，整个基因组的读取密度紧密相关，皮尔逊相关系数在0.94到0.99之间(图5A,图S1). 考虑到所有四个样本的相似性，我们对映射到酿酒酵母四个杂交菌株的基因组，并将其覆盖率与酿酒酵母从上面输入Seq(数据集S1); 相关性也很高，为0.82(图5B). 这种一致性水平特定于输入-Seq样本，因为输入和基因组样本之间的覆盖率相关性为0.1和0.12(图5C).

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图5

不同菌株和实验的输入-方程覆盖模式的再现性。

散点图，比较基因组中各个位置的不同实验之间的序列读取密度。A.两个不同但接近同质的输入-等式读取计数的比较酿酒酵母/巴亚努斯酵母杂交二倍体菌株。样品在同一实验室平行制备，如材料和方法.B来自酿酒酵母和酿酒酵母/巴亚努斯酵母杂交，在不同实验室制备。C.基因组序列读取计数与输入Seq读取计数的比较(巴亚努斯酵母菌左侧面板中的混合比较，以及酿酒酵母右侧面板中的input-Seq比较）。

我们用酿酒酵母/巴亚努斯酵母混合输入-Seq，得出相同的结论(图S2,第3章). 我们还担心S288C和W303菌株之间端粒重复序列的大小和数量的差异酿酒酵母可能在端粒输入-Seq富集中发挥作用。为了解决这个问题，我们比较了全基因组和端粒输入-Seq覆盖率巴亚努斯链球菌，归一化为从相同的基因组序列读取巴亚努斯链球菌应变。端粒输入-Seq覆盖率很高，与酿酒酵母结果(图S4). 本节中的分析表明，染色质相关的序列覆盖偏差在不同的实验室和菌株中是稳健的和可重复的。

一些输入Seq高覆盖和低覆盖区域的正常染色质剪切

因为我们之前发现沉默的染色质在HMR公司我们根据输入序列方程分析测试了候选区域，以确定序列覆盖率的变化是否是由于染色质剪切差异造成的。我们选择了三个不同区域的探针：V染色体上的一个覆盖不足的亚团区，一个覆盖过度的启动子上游RPL26A型基因，以及TRA1公司基因(表2).

在Sir+和Sir−菌株中，我们探测了交联和剪切DNAHMR公司a1，染色体V的粒下区，和行动1作为控件(图6A). 正如所料，DNA在行动1在有沉默和没有沉默的菌株中，基因座剪切相似，而HMR公司正如其他地方重复的那样，a1在野生型菌株中的剪切效果不如Sir−菌株（Özaydın B.，提交）。喜欢HMR公司与Sir−菌株中的较短片段相比，野生型菌株中覆盖下的亚砾岩区域分布显示出向较长片段的轻微转变(图6B). 在具有完整沉默的野生型菌株中行动1是752个碱基对，而HMR公司球下位点为a1和858bp。这些数据表明，与HMR公司盒中，团下区域的Sir依赖异染色质导致剪切阻力，可能导致这些区域在深度测序中的平均值不足。

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图6

候选区域中剪切的比较。

A.用野生型和sir1Δ，sir2Δ菌株和杂交斑点行动1,HMR公司一1和输入Seq下覆盖的端粒亚区。B.通过分析每个片段的信号强度来量化杂交数据，并绘制为计数（y轴）和片段大小（x轴）。该图比较了每个探针的Sir+和Sir−电池的尺寸分布。C.仅从野生型菌株制备的样品的凝胶图像和杂交的斑点行动1（平均投入-均衡覆盖率），TRA1型（覆盖不足）和覆盖过度的发起人。D.图，如B所示，比较行动1作为控件TRA1公司和启动子分布。

接下来，我们检查了TRA1公司基因（未覆盖）和RPL26A型发起人（超额覆盖）。这两个位点不受Sir蛋白的结合，因此预计Sir−细胞的剪切大小不会发生变化。然而，由于其他原因，它们仍有可能具有不同的剪切特性，从而导致其序列覆盖范围发生变化。因此，我们探讨了这两个候选区域，以及行动1，来自野生型菌株的DNA(图6C). 启动子和TRA1型表现出类似的剪切倾向行动1(图6D). 如果剪切阻力导致TRA1公司在input-Seq中，在我们的blot中预期会出现更长的片段，类似于HMR公司和染色体V的粒下区。然而TRA1公司相对于行动1，这与基于input-Seq覆盖范围的预期相反(图6D，左侧面板). 剪切RPL26A型实际上，启动子与剪切行动1(图6D，右侧面板). 这些结果表明，这些位点的输入覆盖率差异是由染色质效应引起的，而不是剪切效应。

候选区域的输入-Seq覆盖率变化是由于染色质引起的

考虑到动作1，TRA1和RPL26A型如上所述，我们询问染色质结构是否会影响输入样品制备中特定位点的分子浓度。我们对输入样本和基因组样本使用定量PCR（Q-PCR）来比较感兴趣区域的DNA相对数量。对于五个地区中的每一个(表2)，我们测量了输入样本和基因组样本中的DNA分子数量，然后根据基因组结果对输入水平进行了归一化。Q-PCR结果与输入-Seq覆盖变化密切匹配：三个输入-Seq-覆盖下区域(HMR公司a1，亚砾岩区，TRA1公司)Q-PCR水平低于行动1和输入Seq覆盖过度RPL26A型启动子的Q-PCR水平高于行动1(图7). 这些定量测量与任何技术性的深度测序偏差无关，这意味着DNA含量存在位置特异性差异，即使剪切是正常的。

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图7

候选区域DNA水平的比较。

Q-PCR DNA水平图（黑色）酿酒酵母/巴亚努斯酵母输入样本和从input-Seq数据集读取的相应序列中值（蓝色）。将输入的Q-PCR测量值归一化为每个区域的基因组Q-PCR结果，相对于行动1输入/基因组Q-PCR结果。输入Seq读取计数也归一化为行动1输入服务质量覆盖率为127（全基因组中位覆盖率酿酒酵母/巴亚努斯酵母输入Seq为126×）。

输入/基因组标准化

基因组的每个碱基都被分配了与之重叠的序列读取总数，分别用于输入和基因组序列读取。除转录停止位点覆盖率分析外，后续的归一化和分析是在100 bp窗口的中值读取覆盖率上进行的，以50 bp的步长沿着每条染色体滑动。每个100 bp区间的中位输入覆盖率除以同一窗口的中位基因组覆盖率。除3′转录末端外，所有序列覆盖分析均在100 bp的窗口上进行。

全基因组覆盖不足和覆盖过度分析

对于端粒序列的指定，我们使用了来自酵母菌属基因组数据库[15]亚端粒区域被定义为位于着丝粒-近端端粒边缘50KB范围内的序列。染色体III上沉默的交配位点坐标（基于侧翼基因）为11082–15798HML公司和289255–297046HMR公司在距离端粒越来越远的情况下，以20 KB的间隔计算100 bp窗口中输入/基因组比率中位数<0.8的百分比。亚端粒区不包括端粒序列。

蛋白质-DNA相互作用位点的覆盖率

绑定位置基于[19]在本研究中预测了结合位点的转录因子中，37个转录因子具有40个或更多的结合位点酿酒酵母基因组。我们使用37个转录因子分析每个因子在所有结合位点上的中位数结合位点覆盖率。DNase I足迹位置来自http://noble.gs.washington.edu/project/footprinting/yeast.footprints.bed [20]编码区和基因间区的定义如下所述，不包括重叠结合位点或足迹的窗口。

基因表达与基因覆盖率和基因间区域的相关性

表达水平从全基因组RNA测序数据集获得[21]对于每个基因，表达水平被定义为从该片段中读取的所有映射RNA序列的中位数。基因间区域酿酒酵母被定义为所有SGD注释基因转录末端之间的序列，包括未标记、可疑和编码区域。使用RNA测序数据集的注释定义转录末端，以从基因间序列中排除5′和3′非翻译区域。聚合转录基因之间的基因间区域被排除。每个基因间区域与其下游转录物的中位数基因表达配对。对于差异转录基因之间的基因间区域，每个区域都与两个基因中表达量最高的区域配对。

输入-方程实验的比较

对于每个100 bp窗口，从酿酒酵母输入-等式，计算四个变量的中值读取计数酿酒酵母/巴亚努斯酵母混合输入-方程实验。绘制了所有混合输入Seq数据集对的散点图和相关系数。随后，对基因组的每个碱基，从所有四个杂交输入Seq映射结果中求出序列读取计数。合并后的酿酒酵母/巴亚努斯酵母然后使用读取计数计算100 bp窗口的中位数覆盖率，然后与酿酒酵母在散点图中输入Seq覆盖范围。基因组覆盖率与混合输入Seq覆盖率的比较是基于总数。

巴亚努斯链球菌端粒覆盖

识别假定巴亚努斯链球菌端粒序列，我们使用NCBI BLAST[33]无重复屏蔽（-F F），使用所有酿酒酵母针对华盛顿大学的端粒DNA注释巴亚努斯链球菌装配[34]。我们使用的e值截止值为0.1，只接受连续端5000个碱基对内的匹配。在BLAST匹配的500个侧翼碱基对内计算“端粒”覆盖率。

基因组DNA分析

如前所述，制备全细胞提取物，如同用于ChIP分析[30]首先用蛋白酶K在37°C下消化这些提取物2小时，然后用酚氯仿萃取。在异丙醇沉淀和70%乙醇洗涤后，将颗粒重新悬浮在50µl水中。在2%琼脂糖凝胶上电泳分离约10-15µg每个样品，然后转移至Hybond N膜。通过PCR制备感兴趣的探针(表3)然后使用αP进行无线电标记³²dCTP与Amersham RediPrime随机素数标记系统（GE Healthcare）。如前所述进行DNA印迹分析[35]用Typhoon扫描仪和ImageQuant软件分析印迹。使用Invitrogen 1KB+DNA大小阶梯计算凝胶上每条通道每0.1 mm处发现的片段大小。

候选区域的Q-PCR

对于五个感兴趣区域中的每一个，如上所述将相同的引物用于Q-PCR(表3). 输入样本是酿酒酵母/巴亚努斯酵母最终500 bp库–与用于input-Seq的库相同。基因组样本也来自一个基于W303的菌株（JRY3009）。定量PCR（Q-PCR）分析在基因组和输入样本的不同平板上对每个区域进行三次。使用SYBR Q-PCR混合物（NEB）在MX3000P机器（Stratagene）上进行Q-PCR。然后测量DNA水平相对于行动1标准曲线。对于每个引物对，输入的DNA水平除以基因组样本的DNA水平。最终输入/基因组测量值标准化为行动1输入/基因组结果。

基因组特征覆盖率的GC偏差

计算上述100 bp窗口中每个窗口的GC含量，以分析着丝粒。跨基因、3′转录终止位点上游、输入覆盖率、基因组覆盖率和GC含量在所有基因的10 bp窗口中进行计算。对于跨基因的覆盖率和GC含量图，每个10 bp窗口中的中值读取计数由全基因组中值读取计数标准化（16用于输入Seq，8用于基因组），GC含量除以全基因组平均值0.38。

我们感谢雅各布·梅菲尔德（Jacob Mayfield）提出的富有洞察力的意见和建议，也感谢实验室成员的投入。我们还感谢约书亚·巴比亚兹和托马斯·克莱恩对这份手稿的批判性阅读。我们感谢匿名审稿人的宝贵意见和建议。