帕金森氏病（PD）是第二大神经退行性疾病，但其病因仍然缺乏了解(1,2). PD患者患有僵硬、运动迟缓、颤抖和平衡障碍(1,2). PD的特征是多巴胺含量的逐渐减少黑质致密部神经元(三,4)和路易小体堆积，胞质内蛋白质泛素染色的嗜酸性物质积聚(5).PD发病机制的分子机制新见解来自与罕见形式相关的基因的鉴定家族性PD(6). α-突触核蛋白（A53T和A30P）的突变是与常染色体显性PD相关(7,8). 这导致发现α-突触核蛋白是路易小体的主要成分，表明α-突触核蛋白的紊乱可能是导致散发性PD的发病机制(9,10). 与这个概念一致观察到α-synuclein在转基因中过度表达果蝇和小鼠引起帕金森病表型和复制PD的许多病理特征(11–13).
其他与PD相关的常染色体显性基因或位点也已被描述并且包括泛素中的突变（I93M）羧基末端水解酶-L1(14)，泛素的成员水解小的C末端加合物的C末端水解酶家族泛素生成泛素单体并参与通过26促进蛋白质的降解和加工S蛋白酶体。因此，泛素处理的紊乱可能是相关的与2P和4P染色体的连锁描述，以及尚未确定的基因座，但基因仍在等待识别(15–17).
Parkin基因突变与常染色体隐性PD有关(18). 一些帕金相关的血统被描述为两种缺失和点突变以及复合杂合性导致常染色体隐性PD(19–21). 最近的研究表明Parkin基因突变是常染色体隐性遗传家族性PD公司(19); 因此，了解Parkin的功能和突变干扰Parkin的功能可能会提供新的见解帕金蛋白的功能仍然存在未知。然而，Parkin在N末端，包含两个环形图案和一个中间图案C末端的环指（IBR）结构域(22). 最近，一些具有类似Parkin的环状基序的蛋白质被证明是参与E2-依赖性泛素化(23–26). 泛滥成灾需要ATP依赖性激活泛素泛素激活酶E1。泛素转移到E2泛素结合酶，与E3协同工作泛素-蛋白质连接酶与泛素底物蛋白(23,24).两个环填充基序的存在及其N端同源性泛素提示Parkin可能参与泛素化途径。有趣的是，在Parkin属于两个环形域，而大多数非病理多态性位于环形填充物外结构域，因此暗示了环形图案在驻车功能(21). 这些最新发现促使我们进行调查Parkin的两个无名指基序和IBR结构域是否可以提供E2-绑定接口以及Parkin是否可以用作E3泛素-蛋白质连接酶。我们在这里展示了Parkin与E2泛素结合酶，UbcH8，具有E3泛素蛋白连接酶活性。Parkin是自我泛化的自我泛化促进了自身的退化。试图确定Parkin的潜在底物，我们进行了酵母双杂交筛选并鉴定了一种突触蛋白CDCrel-1。Parkin互动与和泛素化CDCrel-1并促进其降解，而家族连锁Parkin突变体在降解CDCrel-1。
材料和方法
质粒的产生。
全长Parkin cDNA克隆到pRK5-myc载体和pDBleu向量介于萨尔我和不是I站点。cDNA编码氨基酸220–465、220–403、32–465和220–318的序列，将Parkin的304–404和395–465克隆到pRK5-myc载体之间萨尔我和不是I要生成的站点pRK5-myc-R1-IBR-R2、pRK5-myc-R1-IBR、pRK-5-myc-IBR-R2、pRK5-myc-R2、，分别为pRK5-myc-IBR和pRK5-myc-R2。变种人pRK5-myc-ParkinThr240Arg、pRK5-myc-ParkinThr415Asn、，pRK5-myc-ParkinCys421Ala，pRK5-myc-ParkinCys431Ala，生成pRK5-myc-ParkinGln311stop和pRK5-myc-ParkinTrp453Stop通过PCR介导的定点突变(28). 全长鼠标将CDCrel-1 cDNA克隆到pRK5-myc和pRK5血凝素中（HA）产生pRK5-myc-CDCrel-1和pRK5-HA-CDCrel-1的载体，分别。克隆了UbcH5、UbcH7和UbcH8的全长cDNApRK5-HA之间萨尔我和不是I站点到生成pRK5-HA-UbcH5、pRK5-HA-UbcH7和pRK5-HA-UbcH 8。完整性测序证实了所有结构。
免疫共沉淀分析。
将每个质粒转染2μg HEK 293细胞，使用脂质内酰胺（GIBCO）。36小时后，用冷PBS并在IP缓冲液中采集（1%Triton X-100/2μg/ml抑肽酶/100μg/ml PBS中的PMSF）。然后在4°C持续1小时，然后在16000×克将上清液与50μl蛋白G结合15分钟Sepharose（Amersham Pharmacia）与抗HA（罗氏）预孵育分子生物化学）或抗myc抗体（罗氏分子生物化学），然后在4°C下旋转2小时然后旋转Sepharose并使用IP彻底清洗三次缓冲区或IP缓冲区，外加500 mM NaCl和三个额外清洗。沉淀物在SDS/PAGE凝胶上分解进行Western blot分析。
体外试验泛素分析。
Parkin是在体外由TnT使用在里面体外制造商提供的翻译工具包说明（Promega）。Parkin（5μl）的翻译反应为评估泛素化反应缓冲液中的泛素化含有50 mM Tris●HCl，pH 7.4/5 mM氯化镁2/2 mM ATP/2 mM DTT/100 ng E1（钙生物化学）/5μl大肠杆菌过度表达UbcH5、UbcH7或UbcH8/10μg Ub（Sigma）。反应在30°C下进行1.5小时。反应是通过加入SDS样品缓冲液并煮沸5分钟终止然后在10%SDS/PAGE凝胶中分解反应，并进行用抗泛素抗体进行蛋白质印迹。
在体内泛素分析。
为了确定Parkin的自泛素化，HEK 293细胞被转染2μg pRK5-myc-Parkin或Parkin突变体和2μgpMT123-HA-泛素质粒使用脂质体。三十六小时随后，用抗myc抗体进行免疫沉淀。这个沉淀用抗HA抗体进行Western blot分析。收件人测定CDCrel-1、Myc-tagged CDCrel-1和HA-taged的泛素化泛素与pCMV-Parkin或对照质粒共转染。36小时后，用特异性蛋白酶体处理细胞抑制剂clasto-Lactacystinβ-内酯在1μM和2μM下用于指示时间段。用抗myc进行免疫沉淀抗体。沉淀物通过Western blot和抗HA分析抗体。
酵母双杂交筛选。
酿酒酵母Mav203转化为PDBleu-Parkin和3×106稳定的用15μg pPC86成人进一步转化转化体小鼠脑文库cDNA（CLONTECH）。选择了转化子根据制造商的说明进行确认。
[35S] 蛋氨酸脉冲-大通实验。
HEK 293细胞转染了相应的质粒，如图所示在人物图例中使用了Lipofectamine。20小时后转染后，对细胞进行清洗，并用无蛋氨酸培养培养基1 h。然后用100μCi的[35S] 蛋氨酸3小时，然后清洗并在正常培养基中培养16小时。30分钟，1.5小时，采集3小时、6小时和16小时的细胞抗myc抗体免疫沉淀。免疫沉淀物是在10%SDS/PAGE凝胶上进行解析，并用磷化成像仪进行可视化。对每种蛋白质的放射性量进行了定量使用图像分析软件（Parkin或CDCrel-1）分子动力学磷成像仪，并绘制与时间的关系图。
结果
Parkin通过其R2环指结构域与UbcH8结合，并且家族连锁和环指帕金突变体E2缺陷结合。
包含无名指和IBR域的一系列结构生成Parkin以映射UbcH8、E2-结合域（图。B类). 共免疫沉淀实验表明，C端环填充（R2）域Parkin是UbcH8结合所需的最小区域不绑定到N端环形光纤（R1）域（图。B类). R2和IBR域结合UbcH8比R2域强（图。B类).
UbcH8优先与C端R2环形光纤相互作用Parkin领域(A类)的示意图映射实验中使用的Parkin的推定功能结构域。(B类)转染HEK 293细胞制备的裂解物pRK5-HA-UbcH8和各种Myc标记的Parkin结构域构建体用抗myc抗体进行免疫沉淀（IP）通过抗HA免疫印迹(上部). 污渍被剥去了并用抗myc抗体进行复制(下部)至说明Parkin构造的等效级别在提取物中。这个实验被重复了三次类似的结果。(C类)从HEK 293细胞制备的裂解物转染pRK5-HA-UbcH8和各种Myc-tagg Parkin突变体构建物（详见正文）接受免疫沉淀（IP）抗myc抗体，然后进行抗HA免疫印迹(上部). 去除污渍并用抗Myc抗体(下部)来说明这个等价物提取物中存在Parkin结构的水平。这个实验重复了三次，结果相似。
因为其他含环纤维的E3泛素蛋白连接酶功能性环状结构域需要活性半胱氨酸(26)以及无名指中几种错义突变的鉴定帕金引起PD的结构域，我们评估了半胱氨酸的需求多种家族性帕金的残留及其影响Parkin与UbcH8结合能力的突变（图。C类). 我们选择将注意力集中在R2环枪上Parkin用第二无名指结合UbcH8的结构域。首字母实验表明Parkin和Parkin突变体与与UbcH8的亲和力相对较高，因为我们只能识别当共免疫沉淀物用500 mM NaCl清洗（图。C类). 在此分析中R2环框内家族连锁错义突变Thr415Asn域，家族连锁突变Gln311Stop导致完全不含IBR和R2环状结构域的截短蛋白质消除了Parkin与UbcH8的交互能力（图。C类). 相反，家族相关突变Trp453Stop这会导致截短的蛋白质没有最后12个氨基酸削弱但并不能消除Parkin和UbcH8.家族连锁R1环状突变体Thr240Arg部分减少UbcH8结合，表明完整的R1环填充域可能需要全长Parkin与UbcH8互动。我们进一步探讨无名指在调节UbcH8和Parkin之间的相互作用通过半胱氨酸突变第二无名指（图。C类). 第一个的突变或R2环状结构域的第二半胱氨酸（Cys421Ala和Cys431Ala）分别减少Parkin和UbcH8（图。C类). 这些结果综合起来表明填充环R2域对两者之间的相互作用至关重要Parkin和UbcH8，并建议这种相互作用可能是对帕金介导的泛素化很重要。
Parkin具有E3泛素-蛋白连接酶活性E3泛素蛋白家族连锁Parkin突变缺陷连接酶活性。
为了确定Parkin是否在泛素化中起作用，我们确定帕金是否具有E2依赖性E3泛素蛋白连接酶活性在体外（图。A类). 游离泛素和泛素激活酶（E1）与细菌裂解物孵育在有无在体外翻译了Parkin泛素化反应缓冲液（参见材料和方法).通过Western blot分析和抗泛素抗体。更普遍的现象发生在UbcH8和Parkin的存在，在较小程度上存在Parkin和密切相关的E2、UbcH7。这个在没有帕金的情况下观察到的泛素化可能是由内含的固有E3泛素-蛋白质连接酶活性网织红细胞裂解物内。无关的UbcH5也似乎部分支持Parkin依赖性泛素化，这可能与细菌中E2s的高浓度裂解物。因此，Parkin似乎是一种E2依赖的泛素连接酶（图。A类)，UbcH8和UbcH7都可以支持Parkin介导的泛素化，而UbcH8更有效。
Parkin参与E2依赖性的自我泛化在里面体外和体内. (A类)在体外翻译后的Parkin（5μl）与100 ngE1，10μg泛素（Ub），5μl细菌表达UbcH8、UbcH7、UbH5或泛素化中的对照菌裂解物30°C下反应缓冲液1.5小时。反应产物为用抗泛素抗体进行免疫印迹。分子量标记显示。这个实验重复了三次结果。(B类)体外翻译的Parkin（5μl）或Parkin突变体与100 ng E1、10μg泛素化中带有5μl细菌表达UbcH8的Ub30°C下反应缓冲液1.5小时。反应产物为用抗泛素抗体免疫印迹。分子量标记显示。这个实验重复了三次结果。(C类)从HEK 293细胞制备的裂解物转染pRK5-myc-Parkin或myc-tagged突变体Parkin构建物和pMT123-HA-泛素进行免疫沉淀（IP）抗myc抗体和抗HA免疫印迹(上部). 去除污渍并用抗myc抗体(下部)来说明这个等价物提取物中存在Parkin结构的水平。这个实验重复了三次，结果相似。(D类)家族相关Parkin突变体损害Parkin退化。用pRK5-myc-Parkin转染HEK 293细胞，pRK5-myc-Parkin-Thr240Arg、pRK5-myc-Parkin-Thr415Asn和pRK5-myc-ParkinThr240Arg/Thr415Asn质粒（使用脂质体）。转染后24小时，洗涤细胞并与无蛋氨酸培养基培养1h。用100μCi[35S] 蛋氨酸，在用抗myc抗体进行免疫沉淀的指示时间。这个免疫沉淀物在10%SDS/PAGE凝胶上溶解用磷成像仪进行可视化和量化。这个实验是以类似的结果进行了复制。
为了确定Parkin的突变是否阻止或改变与UbcH8相互作用影响Parkin介导的能力泛素化，我们监控在体外泛素化突变Parkin在UbcH8、E1和泛素存在下的活性（图。B类). 家族连锁突变Thr415Asn发生在第二个无名指和Gln311Stop突变截断Parkin的IBR和R2环形域，防止Parkin介导的泛素化（图。B类). 这个家族连锁Thr240Arg突变，发生于环指结构域，降低了E3泛素-蛋白连接酶活动。这些结果综合起来表明，Parkin的功能是一种E2依赖的E3泛素蛋白连接酶帕金的无名指（R2）是必不可少的，无名指的第一指（R1）可能需要帕金的E3泛素-蛋白连接酶活性。
Parkin泛素化导致自身退化，以及家族连锁和环指Parkin突变损害Parkin缺陷自我泛化导致的退化。
考虑到Mdm2的优先级，它是一种带有E3的环状蛋白泛素-蛋白质连接酶活性，泛素化其靶点p53，以及也包括它本身(32)，我们测试了Parkin是否也具有自我泛素性在完整的细胞中。在该试验中，HEK 293细胞被转染使用脂多糖胺的pRK5-myc-Parkin和pMT123-HA-泛素质粒。36小时后，用抗myc进行免疫沉淀抗体。沉淀物经过严格而广泛的清洗然后用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。这个免疫沉淀Parkin显示出显著的抗HA免疫反应，与Parkin自泛化一致（图。C类).
然后我们测试了家族相关Parkin突变是否影响使用相同的分析方法，帕金的自泛素化（图。C类). 家族连锁R2环状突变Thr415Asn显著降低Parkin的自我泛化。家族关联截断突变体Gln311Stop，消除IBR和R2环形域，没有可检测的自泛素化。在相反，家族连锁突变Trp453Stop导致不含最后12个氨基酸的截短蛋白质会损害，但不会消除，帕金自我泛化，这与它是一致的与E2、UbcH8部分结合。家族关联R1填充环突变体Thr240Arg也降低了自我泛素化使用在体外泛素化和E2结合分析。我们进一步测试是否破坏了第二个环形域通过检测R2影响Parkin的自我泛化环指半胱氨酸突变体。Cys421Ala和Cys431Ala突变显著降低Parkin的自泛素化（图。C类).
接下来我们测试了Parkin的自我泛素是否调节其自身降解和家族连锁突变体是否有差异降解动力学。我们新陈代谢地将Parkin标记为[35S] 蛋氨酸，追了它18小时在不同时间点采集细胞并测量[35S] 蛋氨酸标记免疫沉淀驻车（图。D类). 脉冲追踪实验表明家族连锁突变体Thr240Arg、Thr415Asn和一个合成突变体同时携带这两种突变，降解速度明显较慢比率高于野生型Parkin（图。D类). 因此，帕金泛素化自身，从而促进自身降解，以及家族连锁突变破坏了这一过程。
Parkin与泛素互动并促进营业额CDCrel-1。
Parkin与UbcH8相互作用并泛素化自身的能力表明Parkin可能针对一种或多种蛋白质泛素通过26S蛋白酶体介导的降解。要识别Parkin可能针对泛素依赖性的一种潜在蛋白质降解，我们进行了酵母双杂交筛选（数据未显示）。我们用全长Parkin筛选了成年小鼠大脑cDNA文库作为诱饵，鉴定并确认了一个正相互作用的克隆，CDCrel-1，一种富含44kDa突触小泡的septin GTPase通过相互作用抑制胞吐含合成蛋白(33). 为了确认酵母双杂交结果，我们用myc标记的Parkin和HA-标记CDCrel-1，然后进行联合免疫沉淀。CDCrel-1型与Parkin共免疫沉淀（图。A类). 我们接下来评估Parkin通过其环形域与CDCrel-1相互作用共转染myc-tagged Parkin域构造和HA-tagedCDCrel-1后联合免疫沉淀。我们的结果表明Parkin通过整个环形域与CDCrel-1相互作用优先结合到R2环形域（图。B类). 家族相关Parkin突变体不会破坏与CDCrel-1的相互作用（未显示数据）。
Parkin与泛素相互作用并促进CDCrel-1。(A类)从HEK 293细胞制备的裂解物用pRK5-HA-CDCrel-1和pRK5-myc-Parkin构建物转染用抗myc抗体进行免疫沉淀（IP）抗HA免疫印迹法。这个实验重复了三次结果类似。(B类)的无名指域Parkin与CDCrel-1相互作用。从HEK 293细胞制备的裂解物转染pRK5-HA-CDCrel-1和myc-tagged Parkin结构域对构建物进行抗myc免疫沉淀（IP）抗体后进行抗HA免疫印迹。这个实验是重复了三次，结果相似。(C类)帕金泛素化CDCrel-1。HEK 293细胞转染pRK5-Myc-CDRel-1、pMT123-HA-泛素和pCMV-Parkin或对照质粒。然后用1或2μM clasto-Lactacystin处理细胞β-内酯用于指定时间。裂解液是由这些细胞制备的并用抗myc抗体进行免疫沉淀（IP）然后进行抗HA免疫印迹。这个实验是用类似的结果。(D类)Parkin促进了CDCrel-1。将HEK 293细胞转染pRK5-myc-DCrel-1pRK5-myc-Parkin或空向量。转染后24小时，细胞清洗并用无蛋氨酸培养基培养1小时用100μCi的[35S] 蛋氨酸和在指定时间收获用抗myc抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物在10%SDS/PAGE凝胶上进行解析，并进行可视化和定量用磷成像仪。这个实验是用类似的结果。(E类)家族相关Parkin突变体未能降解CDCrel-1。与图中描述的实验范式相同。D类与家族相关的Parkin突变体一起进行pRK5-myc-Parkin-Thr415Asn或pRK5-myc-Parkin-Gln311，并与野生型Parkin。这个实验是用类似的结果。
接下来，我们通过在里面活泼地特异性泛素化检测蛋白酶体抑制剂clasto-Lactacystinβ-内酯。泛化在帕金存在的情况下，CDCrel-1显著增加（图。C类).
为了研究Parkin是否调节CDCrel-1降解，我们分析了派金在场或不在场时的CDCrel-1营业额通过脉冲追踪实验发现与家族相关的Parkin突变体。CDCrel-1型在帕金在场时的追逐过程（图。D类). 这个家族连锁突变Thr415Asn和Gln311Stop不显著影响CDCrel-1营业额（图。E类). 总的来说，这些数据表明CDCrel-1是Parkin的目标，Parkin调节CDCrel-1的营业额。
讨论
我们的发现表明，帕金是一个拳击手包含E2-依赖性E3泛素-蛋白连接酶。帕金优先通过其C末端R2与E2、UbcH8相互作用环形域。Parkin在E2依赖性细胞中泛素化导致自身退化的方式。此外，Parkin会进行互动泛素化并调节突触的周转囊泡相关蛋白，CDCrel-1。家族关联和含环状半胱氨酸突变，尤其是R2内的突变环形域，扰乱Parkin与UbcH8和削弱Parkin的自我泛素能力并延缓帕金介导的自身和CDCrel-1降解。因此，帕金加入了一个不断增长的含有环纤维的蛋白质家族，起E3的作用泛素-蛋白质连接酶(23–26)以及E3的中断Parkin的泛素蛋白连接酶活性可能是其原因常染色体隐性遗传性帕金森病。
Shimura和同事报告说，在这项工作准备期间Parkin作为泛素-蛋白连接酶发挥作用与E2、UbcH7和UbcH8结合，但程度较低(34). 相反，我们发现Parkin优先结合UbcH8。这个两项研究中Parkin E2结合偏好的差异可能与方法上的差异有关。因为我们的在里面体外泛素化分析表明UbcH7可以支持Parkin介导的泛素化（见图。)很可能是Parkin与E2相互作用，细胞和方法背景可能确定Parkin对UbcH7、UbcH8或目前为止的偏好识别E2。由于UbcH8在中枢神经中大量表达系统(31)而UbcH7几乎没有检测到水平(35)，我们相信UbcH8在驻车在中枢神经系统。
CDCrel-1是septin家族的成员，包含必需的GTPases在不同生物中完成胞质分裂(36,37).septin蛋白家族的成员可能在突触中发挥作用脑中的囊泡运输、融合或再循环事件。CDCrel-1型主要在神经系统中表达，并与膜组分(33). 蛋白质的重要部分与突触小泡共沉淀。CDCrel-1直接通过SNARE相互作用域与syntaxin结合。的转染含有野生型CDCrel-1的HIT-T15细胞抑制分泌，而GTPase显性阴性突变体增强分泌；因此，CDCrel-1可能通过与syntaxin的相互作用调节突触囊泡动力学(33). CDCrel-1是否调节多巴胺释放有待进一步研究澄清，但CDCrel-1未能被降解家族连锁Parkin突变可增加稳态水平CDCrel-1，从而潜在地抑制多巴胺释放和为帕金森州做出贡献。潜在的机制突触囊泡相关蛋白的降解和转换尽管在突触后密度与突触终末(38–40). 然而，它是Parkin或其他富含神经系统的E3可能发挥突触囊泡相关蛋白的调节作用水平。还不清楚营业额是否发生变化CDCrel-1参与多巴胺神经元的退化。然而，人类败血病家族的其他三个成员，Nedd5、H5和Diff6，在神经纤维缠结、神经丝和大脑老年斑中营养不良性神经突受影响阿尔茨海默病(41). 这些发现和我们的数据表明CDCrel-1等七肽可能参与神经退行性变。
Parkin的E3泛素-蛋白连接酶功能可能发挥在维持多巴胺能功能“正常”方面的突出作用帕金基因突变导致家族性帕金森病泛素-Parkin的蛋白质连接酶功能。Parkin似乎有功能作为E2、UbcH8及其目标CDCrel-1之间的适配器。这个破坏Parkin泛素化和靶向蛋白质的能力降解会对正常的中枢神经产生深远的影响系统生理学。能否降解CDCrel-1在常染色体隐性遗传PD发病机制中的重要作用有待进一步研究研究。Parkin很可能会与其他人互动确定的底物蛋白，可能在PD的发病机制。PD的病理特征是细胞质蛋白内含物（路易体）的染色富含泛素(42). Parkin do基因突变患者没有路易尸体(43–45). 我们观察到Parkin功能泛素-蛋白酶体降解途径中尸检观察表明帕金功能可能有助于路易体的形成需要发展PD。进一步研究Parkin在帕金森病病理学的发展，尤其是帕金森病路易体内蛋白质的相互作用及Parkin在路易中的作用身体的形成，将大大增强我们对PD的病理生理学。
