α-半乳甘露聚糖Davanat在不同于传统半乳糖苷结合域的位置结合半乳糖蛋白-1

摘要

介绍

半乳糖凝集素属于结合β-半乳糖苷的凝集素亚家族，作为一个群体，在其碳水化合物识别域（CRD）中具有重要的氨基酸序列保守性（Barondes等人。1994). 虽然半乳糖凝集素一般与细胞内功能相关（例如调节增殖、凋亡、前mRNA剪接），它们最著名的是通过与细胞表面糖蛋白和/或糖脂的各种聚糖基团相互作用，在介导细胞-细胞和细胞-基质粘附和迁移中的细胞外活性（Liu和Rabinovich2005)其聚糖组成甚至可以在细胞的生命周期中发生变化（Balcan等人。2008). 半乳糖凝集素-1（gal-1）与细胞外基质的各种糖共轭配体（例如，层粘连蛋白、纤维连接蛋白、整合素β1亚单位、神经节苷脂GM1和溶酶体膜相关蛋白lamps 1和2）以及内皮细胞（Neri和Bicknell2005)（例如整合素α_v（v）β_三和α_v（v）β₅ROBO4、CD36和CD13）和T淋巴细胞（例如，CD7、CD43和CD45）上已知可诱导细胞凋亡（Perillo等人。1995,1997). 它们与细胞表面糖蛋白的结合也可以触发细胞内活动。例如，gal-1与α相互作用₅β₁纤维连接蛋白受体通过诱导p21和p27限制癌细胞生长（Ras-MEK-ERK途径）（Fischer等人。2005).

β（1→4）-半乳糖苷乳糖（Gal-β。1994). 一般来说，我们对糖-半乳糖凝集素相互作用的结构知识仅限于半乳糖结合的半乳糖凝蛋白（Nesmelova，Dings，et al。2008),N个-乙酰乳糖胺（Walser等人。2004; Nagae等人。2006)，三糖（Nagae等人。2006)、和N个-乙酰乳糖八糖（Bourne等人。1994). 在所有这些情况下，含有β-半乳糖苷的二糖部分在经典CRD中以类似的方式结合半乳糖凝集素，甚至最大的CRD，N个-乙酰乳糖胺八糖具有剩余的六个糖单元从半乳糖凝集素CRD喷射到溶液中，由此推断另一个半乳糖凝集素CRD-可以结合八聚体的自由端，诱导半乳糖-八糖聚合。

然而，来自各种细胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖远比迄今为止用于研究gal-1碳水化合物结合的任何简单模型多糖更复杂。天然细胞表面聚糖较大，在大小和组成上不均一，并且堆积紧密，因此具有自结合性。因此，gal-1可能在一定程度上与天然聚糖中除β-半乳糖苷外的糖单元相互作用。Werz等人（2007）报告称，尽管β-d日-半乳糖占哺乳动物细胞表面聚糖中所有末端单糖的23%，α-d日-半乳糖和d日-甘露糖（在各种异聚状态下）分别占它们的2.3%和18.9%。

在本研究中，我们使用NMR光谱来研究gal-1与相对较大的半乳甘露聚糖Davanat（重均分子量为59kDa）的结合（Miller，Klyosov等人。2009). Davanat由（1→4）连接的β组成-d日-甘露吡喃糖骨架，单个α-d日-吡喃半乳糖残基通过（1→6）-键连接，其重量平均分子量为59 kDa（Platt等人。2006). Davanat重复单元的一段如图所示​图1。1.α-半乳甘露聚糖的平均重复单位为17β-d日-Man残基和10α-d日-Gal残基，平均聚合物分子包含大约12个这样的重复单元（Platt等人。2006). Davanat目前正在II期临床试验中用于治疗转移性结直肠癌（参见http://clinicaltrials.gov/ct2/show/{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT00110721”，“term_id”：“ncT00110722”}}NCT00110721号).

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图1

达瓦那重复单元的化学结构。Davanat是一种半乳甘露聚糖，其骨架由（1→4）连接的β-d日-单个α对应的甘露糖基单位-d日-吡喃半乳糖残基通过（1→6）-键周期性连接，平均重复单元为17β-d日-Man残基和10α-d日-Gal残基，以及包含大约12个此类重复单元的平均聚合物分子。

结果

Gal-1与Davanat结合

图​图22A类显示了¹H（H）-¹⁵N均匀HSQC光谱¹⁵富含N的gal-1（2 mg/mL），交叉峰标记为先前指定的（Nesmelova，Pang等。2008). 在这种浓度下，半乳糖凝集素-1是一种二聚体（Barondes等人。1994). 当Davanat被添加到溶液中时，gal-1共振的强度会不同程度地降低（变宽），如下所示¹⁵在gal-1:Davanat摩尔比为30:1和15:1时获得的富氮gal-1 HSQC光谱（图​（图22B类和C类）。图中每个完整的HSQC光谱下面所示的HSQC谱扩展中，可以更好地理解强度变化​图2。2。由于所有三个光谱都是以相同的方式收集、处理和绘制的，因此很明显，一些交叉峰已经消失，一些强度大大降低，而另一些则相对平静。这些数据的初步结论是gal-1与α-半乳甘露聚糖Davanat相互作用。观察到的gal-1共振的差异强度变化或展宽主要是gal-1和Davanat上结合位点之间交换的结果，这种交换发生在中间化学位移时间标度上（Keeler2005). 这些HSQC数据还表明，gal-1 CRD的整体折叠结构不会因与Davanat的结合而受到显著干扰，因为即使¹H（H）-¹⁵在滴定过程中，N共振被不同程度地展宽，滴定过程中剩余共振的化学位移基本不变。尽管同样的推理表明gal-1二聚体在与Davanat结合后保持完整，但我们无法得出结论。

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图2

¹H（H）-¹⁵含和不含Davanat的gal-1的N HSQC光谱。HSQC光谱显示¹⁵仅富含N的gal-1（1 mg/mL）(A类)gal-1:Davanat摩尔比为30:1(B类)和15:1(C类). 每个图下方都提供了光谱展开图，以便更好地可视化观察到的共振展宽，因为Davanat被添加到gal-1溶液中。展开图中的共振标记为Nesmelova，Pang等人（2008）.

gal-1上的Davanat结合域

通过使用这些HSQC数据，我们可以确定受Davanat结合影响最大的gal-1残基。我们以类似于HSQC化学位移图的方式进行这项工作（Rajagopal等人。1997)在化学位移时间尺度上，当快速或慢速交换区发生结合相互作用时进行。在这些情况下，在用配体滴定的过程中，共振发生了化学位移，几乎没有展宽。在我们的例子中，gal-1共振最初可能会因与Davanat的相互作用而有所改变，但主要是由于在NMR化学位移时间尺度（Keeler）上处于中间交换区的交换过程而展宽2005). 有许多因素可能导致系统落入特定的核磁共振交换体系。然而，一般来说，随着系统从快速交换到中间交换再到缓慢交换，复杂的生命周期会增加，即绑定变得相对更强。

因为在中间交换时间尺度上发生的相互作用可能不会显示出离散共振，所以我们呈现所观察到的展宽效应的方式与我们呈现的方式不同¹H和¹⁵在快速或慢速交换状态下，系统的N加权平均化学位移变化。在中间交换区，我们在摩尔比处显示出微分展宽，此时仍然可以观察到大多数共振，但由于展宽，其强度较低。我们将其称为HSQC共振展宽映射，以区别于HSQC化学位移映射。解释基本上与HSQC化学位移映射相同，即最初拓宽最多的共振与gal-1上与Davanat相互作用的位点有关。一般来说，分数变化是通过将给定HSQC交叉峰的强度除以相同蛋白质浓度下纯gal-1中的交叉峰强度来计算的。值为1表示共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。我们通过在低Davanat:gal-1摩尔比（大多数gal-1共振仍然明显）下观察到的gal-1 HSQC共振强度的分数变化，并通过绘制它们与gal-1氨基酸序列的关系，创建HSQC共振展宽图。如图所示​图3。三显然，一些gal-1残基受到的影响比其他残基更大。

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图3

HSQC共振展宽图中的Gal-1/Davanat结合。在gal-1:Davanat摩尔比（20:1）下观察到gal-1共振强度的分数变化，其中大多数gal-1共振态相对于gal-1的氨基酸序列仍然明显。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。gal-1中的11条β-链被鉴定为低于残基数。插图显示了gal-1 HSQC共振强度相对于Davanat浓度（mg/mL）的平均分数变化（±SE）。实线表示每个点上这些值的平均值的S形拟合。

Gal-1具有β-夹层结构，由图中确定的11条β-链组成​图3。三gal-1的乳糖结合面具有β-链1、10、3、4、5和6，在二聚体界面上按链1的顺序排列。乳糖结合域本身主要涉及β链4、5、6、9和互连环。gal-1的另一面从二聚体界面的β-链11开始（穿过β-三明治中的β-链1），然后是β-链2、7、8和9。从图中​图3，三注意，乳糖结合域内的残基通常受Davanat的影响最小，而对面的残基平均受影响最大。这可能在图中得到更好的理解​图44A类，这突出了gal-1二聚体结构上受影响最大的残基。Davanat与之相互作用的区域位于gal-1表面，与乳糖结合的位置相反（图​（图44A类（右），包括一条相当宽的横穿gal-1二聚体界面的线束。

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图4

gal-1上的Davanat结合域。(A类)如文中所述，gal-1折叠结构上受Davanat结合影响最大的残留物以红色和橙色突出显示。图中使用了乳糖结合的人半乳糖凝集素-1的x射线结构（pdb访问代码：1gzw，Lopez-Lucendo等人）(2004)左边的方向显示Davanat结合的二聚体的表面。还显示了gal-1二聚体界面。右边的方向显示了二聚体的另一侧，乳糖在那里结合。(B类)Davanat结合域中gal-1残基的图示。极性残基、带正电残基和疏水残基分别呈橙色、蓝色和绿色。作为参考，其结合位点中的乳糖分子显示为紫色。

受影响最大的残留物为L9、N10、G14、R18、R20、G21、V23、K28、N33、L34、K36、N46、I58、G69、Q80、G82、A85、C88、I89、F91、D92、L96、L100、D102、Y104、R111、N118、K129、C130、A132和F133。这些残基的侧链如图中的gal-1二聚体所示​图44B类总的来说，氨基酸残基的组成与乳糖结合位点的组成非常相似，其中关键残基主要是极性（N46、N61、H44、R48、H52、E71）或疏水性（W68）。因为中间交易的扩大使其难以执行¹⁵N-或¹³C-编辑NOESY以确定蛋白质和聚糖基团之间的NOE，我们只能建议可能存在类似类型的蛋白质-聚糖相互作用，即氢键和疏水相互作用。

我们的HSQC数据还可以通过绘制gal-1 HSQC共振强度的平均分数变化作为Davanat浓度的函数来估算gal-1/Davanat表观结合亲和力，如图的插图所示​图3，三，实线表示数据的拟合度。一个明显的K（K）_d日该值是在该曲线上50%的gal-1分子与Davanat结合的点处估算的。Davanat浓度为0.5 mg/mL时，平均分数强度变化为0.5（50%结合），这对应于K（K）_d日值约为10×10⁻⁶M使用达瓦那59 kDa的重量平均分子量（Miller，Klyosov等。2009). 该值代表聚糖上所有结合位点的加权平均值，与观察到的共振展宽相一致，共振展宽将系统置于化学位移时间标度上的中间交换状态（Keeler2005).

Gal-1也与甘露聚糖结合

为了评估Davanat中的半乳糖单位对gal-1结合是否必要，我们进行了¹H（H）-¹⁵N HSQC实验¹⁵在浓度为4、8、16和32 mg/mL的甘露聚糖（重量平均分子量为50 kDa）存在下富含N的gal-1。我们观察到甘露聚糖以与Davanat类似的方式拓宽了gal-1共振。图​图55显示了HSQC共振展宽映射，该映射绘制了gal-1 HSQC交叉峰强度与氨基酸序列的关系。如图所示​图3三对于Davanat，值为1表示与该特定残基相关的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。尽管甘露聚糖结合主要影响gal-1上的β链2和11（图5)，数字比较​图3三和​和55表明甘露聚糖和Davanat通常在gal-1的同一区域结合。

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图5

甘露聚糖与gal-1结合的HSQC共振展宽图。甘露聚糖（16 mg/mL）存在时gal-1（4 mg/mL）HSQC共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。gal-1中的11条β-链被鉴定为低于残基数。插图显示了交叉峰与甘露聚糖浓度（mg/mL）的平均分数强度变化（±SE）。实线表示这些数据的多项式拟合。

尽管如此，gal-1与甘露聚糖的结合比与Davanat的结合要弱得多。图的插图​图55绘制了受影响最大残基的交叉峰的平均强度变化与甘露聚糖浓度的关系。当分数强度变化为0.5（50%gal-1结合）时，甘露聚糖浓度约为7 mg/mL，对应于表观K（K）_d日值约为140×10⁻⁶M使用50 kDa的重量平均分子量来制备甘露聚糖。该值是Davanat（10×10）的14倍⁻⁶M） 表明甘露聚糖与gal-1的结合比Davanat弱14倍。

乳糖可以结合gal-1/Davanat复合物

我们通过证明乳糖仍然可以在gal-1/Davanat复合物中的β-半乳糖苷结合位点结合，证实Davanat不与gal-1上的β-半乳糖苷结合位点直接相互作用。对于这个实验，我们从一个解决方案开始¹⁵N-gal-1:Davanat（摩尔比10:1），添加浓度为1、3和10 mM的乳糖，并获得¹H（H）-¹⁵N滴定中每个点的HSQC光谱。我们使用的gal-1:Davanat摩尔比为10:1，其中大部分gal-1是未结合的，因为否则，由于中间化学位移时间标度上的化学交换展宽，将很少或没有NMR信号可观测。我们确实在5:1 gal-1:Davanat摩尔比下进行了实验，乳糖仍然结合，尽管我们无法跟踪许多gal-1交叉峰的化学位移，因为它们不在光谱中（数据未显示）。

图​图66A类覆盖HSQC光谱扩展¹⁵N-gal-1:Davanat（10:1）和三种乳糖添加剂。HSQC光谱¹⁵N-gal-1：不含乳糖的Davanat（黑色交叉峰）与图中所示基本相同​图22C类，其中共振有差异地加宽（强度降低或未观察到，例如图中的N46、E74、D92​图66A类)，如上所述。尽管交叉峰强度，例如N46和D92的交叉峰强度高度衰减，但它们在光谱中的较低水平上很明显（未显示）。随着乳糖的添加（品红代表1 mM，红色代表3 mM，蓝色代表10 mM），这些共振通常倾向于强度增加，并且在该膨胀区域变化最大，如虚线框所示。

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图6

乳糖在Davanat存在下结合gal-1。(A类)两个HSQC谱的展开重叠¹⁵在Davanat（摩尔比10:1，gal-1:Davanat）（黑色交叉峰）的存在下，并添加1 mM（洋红）、3 mM（红色）和10 mM（蓝色）的乳糖，富含N的gal-1（1 mg/mL）。(B类)两个HSQC谱的展开重叠¹⁵单独添加富含N的gal-1（1 mg/mL）（黑色交叉峰），并添加1 mM（洋红）、3 mM（红色）和10 mM（蓝色）的乳糖。膨胀图中的共振A类和B类标记为先前分配的Nesmelova，Pang等人（2008）_.(C类)¹⁵N个-¹向含有Davanat的gal-1溶液中添加乳糖后，观察到gal-1共振的H加权化学位移差（Δδ），如A类与gal-1的氨基酸序列相对。(天)¹⁵N个-¹向单独的gal-1溶液中添加乳糖时观察到的gal-1共振的H加权化学位移差（Δδ），如B类与gal-1的氨基酸序列相对。(E类)Davanat存在下gal-1的20个最大位移共振的分数化学位移变化（来自A类)作为乳糖浓度的函数。(F类)仅gal-1的20个最大位移共振的分数化学位移变化（来自B类)作为乳糖浓度的函数。两者中的实线E类和F类表示每个点上这些值的平均值的乙状拟合，如文中所述。

gal-1/Davanat复合物中N46、E74和D92的乳糖诱导化学位移变化与在相同乳糖浓度下单独使用gal-1观察到的变化基本相同（图​（图66B类). 事实上，如图所示的HSQC化学位移图所示，所有gal-1交叉峰也可以这样说​图66C类和天一种情况下绘制的位移变化与另一种情况的线性拟合得出了0.94的回归系数，表明乳糖与gal-1/Davanat复合物中典型结合位点的结合方式基本相同，与gal-1中典型结合部位的结合方式相同。

我们还发现游离gal-1和gal-1/Davanat复合物的乳糖结合亲和力基本相同，如图所示​图66E类和F类其中我们绘制gal-1的分数变化¹H（H）-¹⁵在Davanat存在和不存在的情况下，N加权HSQC共振化学位移分别与乳糖浓度有关。实线表示通过每个乳糖浓度点的平均值进行的S形拟合。K（K）_d日在任一曲线上50%的gal-1结合位点被乳糖占据的点上估算值（0.5分数结合）。K（K）_d日数值基本相同，即250×10⁻⁶M。

在这两种情况下，由于gal-1共振仅因添加乳糖而改变，β-半乳糖苷结合位点的配体交换在化学位移时间尺度上相对较快。然而，对于Davanat，配体交换发生在相对较慢的时间尺度上（中间化学交换），如前一节中讨论的gal-1共振展宽所证明的。现在，当乳糖结合gal-1/Davanat复合物时，Davanat诱导的增宽最初有所减少，即共振强度增加，这表明乳糖结合诱导gal-1对Davanat的亲和力或亲和力有所降低。如图所示​图66A类尤其是N46和D92以及E74的共振行为。添加1 mM乳糖之前，N46的交叉峰甚至不明显，之后强度增加（与图中的N46强度相比​图66B类). D92共振强度仅在1 mM乳糖时增加。

其他gal-1共振也有类似的趋势，如图所示​图77A类图中显示了在没有（顶部）和存在（底部）1mM乳糖的情况下，gal-1:Davanat（10:1）的HSQC共振展宽图。如图所示​图3三B类，值为1表示与该特定残基相关联的共振不再明显，值为0表示共振强度没有变化。gal-1:Davanat络合物中所有残基的分数加宽的简单平均值（图​（图77A类)从不含乳糖的0.72降至含1mM乳糖的0.51。大多数gal-1共振的行为类似于D92（图​（图66A类)，如图所示​图77B类绘制了28个其他残留物的趋势图。在这方面，当添加1 mM乳糖时，共振展宽减小，然后随着更多乳糖添加到溶液中，共振展展宽再次增加。在任何一种情况下，gal-1仍然与Davanat结合，如持续的gal-1共振展宽所示。在某种程度上，乳糖与gal-1/Davanat复合体的结合明显地调节了gal-1对Davanat的亲和力，这表明当乳糖与复合体结合时，gal-1会经历构象转变，无论多么微小。

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图7

乳糖可减少达瓦那诱导的加宽。(A类)上图显示了在Davanat（10:1 gal-1:Davanat的摩尔比）存在下gal-1的共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。底图显示了在Davanat（摩尔比10:1 gal-1:Davanat）和1 mM乳糖存在下gal-1的共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。(B类)绘制了Davanat存在下gal-1 28个共振的分数展宽与乳糖浓度的关系。显示的线条只是将数据点连接起来作为视觉辅助。

对于同时结合的解释，我们担心的一个问题是，由于技术原因，我们必须使用gal-1:Davanat摩尔比为10:1，因此大部分gal-1是未结合的。因此，我们可以观察到乳糖与游离gal-1的结合。然而，Davanat/gal-1/乳糖系统在不断地交换，我们观察到的效果应该是一些加权平均的结果。此外，乳糖浓度高于饱和水平，Davanat仍与gal-1结合，这可以通过Davanat和乳糖存在下持续的gal-1共振展宽来证明。在这方面，乳糖和Davanat确实可以同时结合gal-1。

从聚糖侧

在我们的核磁共振实验中，我们实际上观察到Davanat制剂中gal-1与聚糖结合的平均效应，其大小略有不同（Miller、Klyosov等。2009). 因此，我们进行了脉冲场梯度（PFG）核磁共振扩散实验，以推导扩散系数，天，从聚糖分子结合gal-1的角度深入了解会发生什么。在大多数情况下天-这些值反映了由于这些“粘性”聚糖之间的分子间相互作用而导致的分子大小（表观分子量和水动力半径）和/或溶液粘度的变化（Daas等人。2000). 较小的天-值通常表示分子尺寸和/或粘度增加，以及反之亦然此外，由于多糖通常没有稳定的球状核，天-Davanat的值也可能在更大程度上取决于内部运动，而不是蛋白质，因此更大的内部灵活性反映在更大的天-值。

对于这些核磁共振扩散实验，我们将达瓦那的浓度保持在4.6 mg/mL，将gal-1滴定到聚糖溶液中，并观察到对天源于梯度诱导的衰减或相位差¹H共振来自Davanat。A类¹Davanat的核磁共振氢谱如图所示8A类虽然我们的分析不需要特定共振分配的知识，但¹该半乳甘露聚糖中各种化学基团的H化学位移显示在光谱下方，这与许多研究一致（Ikuta等人。1997; 田口等人。1997; Ishrud等人。2001; Takita等人。2001; 拉赫曼伯代娃和沙什科夫2005). 阳极氧化铝¹甘露糖和半乳糖的H共振（未显示）分别为4.69–4.78 ppm和4.98–5.06 ppm。

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图8

¹Davanat核磁共振氢谱，以及gal-1滴定的扩散衰减曲线。(A类)A类¹显示了Davanat的核磁共振氢谱图。插图说明了文中讨论的一些共振包络线的扩散介导的梯度诱导衰减。光谱下方的线提供了Gal和Man环蛋白质共振的化学位移范围，如文中所述。3.93 ppm时Davanat共振的扩散衰减曲线(B类)和3.694 ppm(C类)显示为gal-1浓度的函数，单位为mg/mL。聚糖浓度保持在4.6 mg/mL，并将gal-1滴定到溶液中。虚线表示对衰减曲线慢成分的Y轴截距的外推，如文中所述。

图的插图​图88A类举例说明共振如何随着梯度强度的增加而衰减等式（1）（请参见材料和方法)，当梯度强度为零时，测量开始时共振最强烈。随着梯度强度的增加，共振变得更加失相，因此强度降低。如果Davanat是由单一尺寸的聚糖分子组成，并且没有内部运动差异，天-从代表聚糖分子中不同化学基团的单个共振中得出的值将相同或非常接近。然而，Davanat是一种多分散的多糖（Miller，Klyosov等人。2009)，基于上述原因，天-根据使用达瓦纳共振导出给定的天-值。这在图的插图中很明显​图88A类其中3.83–3.86 ppm左右的共振包络内梯度诱导的退相不均匀。正是由于这个原因，我们测量了几种达瓦纳共振的扩散介导衰减曲线。

通过绘制分数变化的对数¹H共振强度（共振强度除以零梯度处的初始强度）与梯度强度的关系，得到其斜率产生扩散系数的衰减曲线，天（请参见材料和方法，等式。1). 图​图88B类和C类显示Davanat（3.7 ppm和3.94 ppm）两种共振的衰减曲线，作为gal-1浓度增加的函数（在每条曲线的右侧显示）。对于纯Davanat，3.94 ppm共振的衰减曲线（图​（图88B类)表现为线性，而3.7 ppm下的共振（图​（图88C类)略微弯曲。衰退曲线在以下情况下显示为线性天-数值变化幅度仅为5-10%左右。其他达瓦纳共振的衰减曲线也有类似的变化。对于曲线衰减曲线，如果我们假设只有两个物种存在，我们可以从Y轴截距估计慢衰减分量的比例。图中的虚线​图88A类和B类通过曲线的最后6–8个点显示，以指示慢衰减分量。这些点的线性拟合非常好，回归系数大于0.9。可以从线性外推曲线（虚线）的Y截距估计这些慢成分对全衰减曲线的分数贡献。一般来说，我们发现快速和慢速衰减分量分别约占单个曲线衰减曲线的10%和90%。因为“快速组件”的比例最小，所以我们将分析重点放在较慢的组件上。“快速成分”的存在可能是由于Davanat内各种碳水化合物单元的内部运动增加所致。

当初始等分的gal-1（0.5 mg/mL）添加到Davanat溶液中时，缓慢衰变组分的斜率大大增加（图​（图88B类和C类)相应地天这种趋势被随后添加的gal-1逆转，这导致衰减曲线不太陡峭，因此减少了天.在图中​图9，9，我们绘图天-Davanat的主共振值与gal-1浓度的函数。不管共振如何，我们观察到天-这些值通常在添加gal-1后开始增加，然后在较高的gal-1:Davanat摩尔比下减小，然后趋于稳定。在这一点上，这些曲线趋于稳定（gal-1浓度为3至6 mg/mL或207×10⁻⁶M至414×10⁻⁶M、 分别），我们可以估计结合化学计量比。达瓦纳特浓度为4.6 mg/mL（78×10⁻⁶M） Davanat的平均分子能够结合约3-6 gal-1当量的单体。

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图9

Davanat扩散系数。(A类)天-绘制了反褶积扩散衰减曲线的慢成分值与gal-1浓度的关系曲线。(B类)如文中所述，显示了标准聚糖和蛋白质的扩散系数与其分子量的关系。虚线表示蛋白质与聚糖结合的假设情况，其中复合物既不是蛋白质也不是聚糖，而是两者的某种组合。

最初的急剧增长天在gal-1:Davanat摩尔比约为1:2时发生，然后在摩尔比达到1:1之前下降。在这些初始gal-1浓度下，大多数gal-1应与聚糖结合（参见上文所示的核磁共振HSQC数据），然而天-数值增加，表明情况正好相反。对于这个明显的难题，一些可能的解释是：（1）gal-1结合破坏了导致达瓦那溶液通常较高溶液粘度的广泛的聚糖间网络，（2）聚糖的流体动力学半径因gal-1的结合而减小，和/或（3）gal-1结合增加了聚糖分子的内部柔韧性。无论如何，gal-1结合改变了Davanat构象，并可能干扰糖间相互作用。

讨论

在此，我们报告了gal-1在不同于galectinβ-半乳糖苷结合域的位置结合α-半乳甘露聚糖（Davanat）和寡聚甘露聚糖。Davanat，由（1→4）-连接的β-d日-其中单个α-d日-吡喃半乳糖残基通过（1→6）-键连接（Platt等人。2006)与gal-1结合在一条宽阔的条带上，该条带穿过与β-半乳糖苷结合域相对的蛋白质一侧的二聚体界面。碳水化合物结合域中存在大量极性残基，这与它能够促进蛋白质-聚糖相互作用一致。此外，该结合域似乎可以容纳包裹在gal-1表面的约10个糖单元的甘露聚糖主链长度，这与肝素与血小板因子-4的结合非常相似（Mikhailov等人。1999). 鉴于其他使用甘露糖或寡甘露聚糖的研究结果，gal-1以这种方式与α-半乳甘露聚糖（Davanat）和寡甘露糖结合令人惊讶。在甘露糖结合gal-10的x射线晶体结构中，单糖在正常的β-半乳糖苷结合域上明显相互作用，尽管与乳糖（Swaminathan等人。1999). 在另外两项研究中，gal-3被证明能结合β-1,2-键低聚甘露聚糖白色念珠菌或与牛血清白蛋白结合（Fradin等人。2000; Kohatsu等人。2006). 然而，在其中一项研究中（Fradin等人。2000)β-1,2-键低聚甘露聚糖不能与乳糖竞争，表明低聚甘露聚糖在β-半乳糖苷结合域以外的位置与gal-3结合。此外，在另一项研究中（Kohatsu等人。2006)，即使100 mM乳糖也不能完全消除gal-3与β-1,2-键低聚甘露聚糖在白色念珠菌在这里，我们观察到乳糖和α-半乳甘露聚糖可以同时与gal-1结合，表明gal-1上存在两个碳水化合物结合域。在这方面，可能是β-1,2-键低聚甘露聚糖也与gal-3上类似的二级结合位点结合。人类gal-1上α-半乳甘露聚糖（Davanat）结合域内的许多氨基酸残基在其他半乳糖凝集素序列中保守（Nesmelova，Dings，et al。2008).

我们还发现，与α-半乳甘露聚糖Davanat相比，甘露聚糖缺乏半乳糖结合的gal-1，亲和力显著降低(K（K）_一= 1 × 10⁵M（M）⁻¹对于Davanat，与0.7×10相比⁴M（M）⁻¹对于甘露聚糖）。这表明甘露聚糖骨架中的半乳糖单元促进了与gal-1的更大结合亲和力。然而，半乳糖是否必须像Davanat那样通过α（1→6）-键连接到甘露聚糖上，目前尚不清楚。据报道，gal-1与某些α-半乳糖苷的结合比与β-单体的结合更好（Appukuttan等人。1995). 阿普库坦(2002)发现gal-1与天然糖蛋白、人工糖基化蛋白和含有末端α-连接半乳糖的低聚糖（这些低聚糖中通常为α（1→3））的结合比与末端β-连接半乳糖的低聚物的结合更强。此外，Wu等人(2006)据报道，当将α（1→x）-半乳糖添加到galβ1-4GlcNAc或galβ1-3GlcNAc核心寡糖的末端时，gal-5与某些血型寡糖的结合更强，并且碳水化合物结合结构域由一个浅槽组成，该浅槽足够大，可以容纳五糖和α-异头半乳糖。

gal-1在这个非传统碳水化合物结合域与Davanat和甘露聚糖的结合引发了生物相关性问题。虽然我们没有直接的答案，但我们知道gal-1的功能与它与细胞外基质和细胞表面聚糖结合的能力有关（Perillo等人。1995,1997; Fischer等人。2005; 内里和比克内尔2005)我们的研究确实拓展了gal-1如何与细胞表面聚糖相互作用的观点。我们的结果还表明，乳糖仍然可以在典型的β-半乳糖苷结合位点与gal-1/Davanat复合物结合，而与CRD的亲和力没有明显变化。然而，乳糖不是gal-1的体内配体，与生物学上更相关的低聚糖结构/配体的结合可能会受到Davanat的影响。无论如何，有趣的是，gal-1/聚糖相互作用的这种双重模式可能有助于聚糖原位交联，因为许多不同的糖组成哺乳动物细胞表面聚糖（Werz等人。2007). 例如，当β-d日-半乳糖占所有末端单糖的23%，α-d日-半乳糖占其中的2.3%，并且d日-甘露糖，在一种或另一种异聚状态下，含有18.9%，末端为α-d日-甘露糖残留量为8.2%。此外，细胞表面聚糖的组成在细胞的生命周期中不断变化（Balcan等人。2008; Laughlin等人。2008; Rodgers等人。2008)以及依赖其病理状态（福田1996; 丹尼尔斯等人。2002; Kannagi等人。2004)以及时间/空间动态（Rabinovich等人。2007).

Davanat已被开发成一种治疗癌症的干预手段（参见http://clinicaltrials.gov/ct2/show/{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT00110721”，“term_id”：“ncT00110722”}}NCT00110721号)我们在此证明Davana与gal-1相互作用，gal-1通过促进肿瘤内皮细胞的粘附和迁移对肿瘤生长至关重要（Thijssen等人。2006). 尽管Davanat对gal-1上典型的β-半乳糖苷结合位点的碳水化合物结合没有太大影响，也没有显著干扰gal-1单体结构或明显的二聚体稳定性，但其作用机制可以简单地通过隔离gal-1来干扰正常的gal-1质量作用来解释，或者通过诱导gal-1和细胞表面聚糖周围微环境的变化，或者通过影响gal-1糖共轭超分子结构。其中任何一种都可能影响gal-1在细胞粘附/迁移、聚糖交联和/或糖共轭受体信号方面的功能。

Gal-1与Davanat的结合明显影响了溶液中聚糖的物理化学性质。与水溶液中的所有低聚糖一样，Davanat等半乳甘露聚糖是粘稠的，即使在低浓度下也是粘稠的（Daas等人。2000). 相对较高的粘度是由甘露聚糖主链浓度引起的，与半乳糖含量无关，半乳糖明显决定了总溶解度。天与分子大小（表观重量-平均分子量和流体动力学半径）有关。在无限稀释下，Davanat显示出平均值天-反映59kDa的表观重均分子量的值（Miller，Klyosov等人。2009). 开始用gal-1、Davanat以4.6 mg/mL滴定时（图​（图8）8)有一个天-该值反映了由于聚糖分子之间的分子间相互作用而产生的110 kDa的表观分子量。添加少量gal-1会导致天Davanat将增加。这一观察结果似乎与gal-1与聚糖结合的事实相矛盾，这本应导致天当Davanat平均分子上只有一个或几个gal-1结合位点被占据时，就会出现这种效应。虽然不清楚这是如何在分子水平上发生的，但gal-1结合可能会减少聚糖分子之间的分子间相互作用，这是聚糖诱导粘度的基础。首次增加天当聚糖与少量gal-1络合时，也可能导致聚糖的水动力半径下降（在某种程度上增加了内部柔韧性）。使用Stokes–Einstein关系（Cantor和Schimmel1980)R的变化_H（H）大约为78-51Ω，这将是分子体积的显著变化。在这方面，最有可能的是R变化的某些组合_H（H）并且发生聚糖间相互作用的降低（即溶液粘度降低）。随着滴定的继续，天-然后，随着越来越多的gal-1与聚糖结合，这些值会降低，并随着结合饱和度的出现而趋于稳定。然而，gal-1与Davanat的结合会改变聚糖的超分子结构，减弱聚糖间的相互作用，最终导致聚糖的减少。我们之前在gal-1与大的异质性半乳鼠李糖基半乳糖醛酸聚糖的结合研究中观察到了这种现象（Miller，Nesmelova等人。2009).

半乳糖凝集素介导的聚糖减少可能与生物学相关。例如，质膜中含聚糖粘蛋白的细胞表面堆积密度约为50分子/μm²，其中（假设立方体约为10⁻⁶每侧m）对应约10的肽聚糖浓度⁻⁵细胞表面的M（Rabuka等人。2007,2008). 考虑到糖蛋白通常不均匀地分散在细胞表面，并且通常在微域中发现，一些糖蛋白（及其相关聚糖）的浓度可能很高，因此，细胞表面的聚糖微粘度可以达到或接近我们在这里研究的半乳甘露聚糖。就生物学功能而言，gal-1与细胞粘附和迁移密切相关，细胞粘附通常通过改变细胞表面糖蛋白的组织和对抗蛋白质粘附系统的作用而发生（Brewer等人。2002; 泰勒和德里卡默2007). 众所周知，Gal-1与细胞表面聚糖的相互作用会改变膜的性质，正如Davanat所做的那样。Gupta等人(2006)使用红细胞和EPR光谱证明，gal-1显著增加膜流动性，这与粘度成反比。此外，共聚焦显微镜显示，暴露于gal-1后，CD45和CD43在暴露于gal-1后20分钟内聚集在MOLT-4细胞（白细胞）的细胞表面（Pace等人。1999). 已对gal-3进行了类似的观察，发现gal-3与细胞表面聚糖相互作用时会结合并形成簇，从而解释了gal-3介导细胞表面糖蛋白重组的能力（Nieminen等人。2007). 综上所述，这些数据表明，gal-1与细胞表面聚糖相互作用，并允许发生重组，可能是通过gal-1与其聚糖的结合促进糖蛋白的分解，并通过降低聚糖介导的微粘度促进更大的膜流动性。这将类似于缓解交通堵塞，并允许细胞膜平面内发生更多自由扩散。

结论

在这里，我们通过证明gal-1与α-半乳甘露聚糖Davanat在与β-半乳糖苷结合位置相反的gal-1侧的一个新的碳水化合物结合域结合来反驳galectin教条。我们观察到β-半乳糖苷乳糖仍能与gal-1/Davanat复合物结合，这表明gal-1介导的聚糖交联可能在原位得到促进。此外，我们发现gal-1与Davanat聚糖的结合减弱了聚糖间的相互作用，这一发现可能会产生生物学后果，值得进一步研究。总的来说，这些研究拓展了我们对半乳糖凝集素如何与细胞外基质或细胞表面更复杂的聚糖相互作用的看法。

材料和方法

脉冲场梯度核磁共振自扩散测量

对于NMR扩散测量，将Davanat溶解在0.6 mL磷酸钾缓冲D中₂O、 通过添加微升量的NaOD或DCl来调整pH值。如前所述，使用GRASP梯度单位在Varian INOVA-600上进行PFG NMR自扩散测量（Mayo等人。1996). 测量扩散系数的核磁共振波谱，天使用配备主动屏蔽z梯度线圈的5mm三重共振探头获得。根据所施加梯度的频率分布，使用制造商的标准程序校准梯度的最大值，发现其为100 G/cm。这与使用已知扩散常数分析水中PFG数据获得的98 G/cm的值一致（Mills1973). 通过对不同梯度范围内的水进行扩散测量，检查梯度的线性。PFG纵向涡流延迟脉冲序列（Mayo等人。1996)用于在D中进行的自我扩散测量₂O，温度范围30°C。

对于分子在各向同性液体中的无限制扩散，PFG NMR信号振幅，A类，归一化为在没有梯度脉冲的情况下获得的信号，与天通过

(1)

其中γ是观测到的原子核的旋磁比；克和δ分别是磁场梯度脉冲的大小和持续时间，Δ是梯度脉冲之间的时间（Mills1973). 对于这些实验，δ=4ms，克=1–75 G/cm，Δ=34.2 ms，以及纵向涡流延迟T型_电子＝100ms。每个扩散常数，天，由使用不同的克-值。通过对葡聚糖标准物和标准蛋白质进行PFG核磁共振自扩散测量，校准扩散系数测量值（Ilyina等人。1997; Miller、Klyosov等人。2009).

基金

国家癌症研究所（NIH R01 CA096090 to K.H.M.）；美国国立卫生研究院癌症生物学培训资助(美国国立卫生研究院T32 CA009138)致M.C.M。；国家科学基金（BIR-961477）；明尼苏达大学医学院；明尼苏达州医学基金会。

致谢

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