结果和讨论
内皮细胞主要被视为血管的内壁，在血液和周围组织之间的代谢交换中发挥作用。然而，最近的研究表明，内皮细胞除了在血液循环中的作用外，还调节许多过程[1–三]. 在哺乳动物肝脏发育过程中可以观察到内皮细胞在器官发生过程中的影响的几个例子[4–7]. 然而，由于内皮细胞是小鼠早期肝水肿形成所必需的，因此很难研究它们在肝脏发育后期的作用。斑马鱼系统为研究内皮细胞在器官发生后期的作用提供了独特的优势：在斑马鱼中，内皮细胞似乎不需要用于最初的肝胆形成[8]血管缺陷突变体通过简单扩散获得足够的氧气，在肝脏器官发生的各个阶段继续发育[9].
我们首先使用Tg（flk1:EGFP）s843条线路[10]. 我们发现肝内血管网络在受精后80小时内高度分支。门静脉和肝动脉在肝脏后侧与肝内血管网相连，该血管网在其前侧与肝静脉吻合(). 我们还观察到肝内血管网与活化的白细胞粘附分子（Alcam）紧密相连[11]-正网络()在这个阶段；这两个肝内网络在80hpf时很少相互接触或交叉(). 在这一阶段，Alcam的定位主要与胆盐出口泵Abcb11的定位重叠[12]和胆道上皮细胞标记物单克隆抗体（mAb）2F11[13,14] (图S1A、S1B和S1J表明Alcam阳性网络对应于发展中的肝内胆道网络Tg（flk1:EGFP）s843条经Alcam和Prox1染色的幼虫提供了清晰的肝脏光学切片(). 胆道和血管束之间总是存在一层肝细胞，从而防止这些胆道接触或交叉(). 肝内网络的高度协调排列使我们假设这两条管道相互作用以调节其位置。在本研究中，我们研究了内皮细胞在胆道网络形成中的作用。
斑马鱼肝脏发育中的血管和胆道网络
（A和A′）的投影共焦图像Tg（flk1：EGFP公司)s843条在80 hpf时在肝脏中表达。肝内血管网络通过Tg（flk1：EGFP公司)s843条表达式如（A′）所示。
（B和B′）80 hpf时Alcam表达的投影共焦图像。Alcam染色显示的肝内胆道网络如图（B′）所示。
（C和C′）的合并图像Tg（flk1：EGFP公司)s843条（绿色）和Alcam（红色）表达表明肝内血管和胆道网络始终保持一定距离。肝内血管（绿色）和胆道（红色）网络示意性地表示在（C′）中。
（D和E）的投影共焦图像（D）和z平面共焦图像Tg（flk1:EGFP）s843条幼虫可见GFP（绿色）、Prox1（蓝色）和Alcam（红色）的表达。如插图所示，单层肝细胞将血管和胆道网络分开。
我们首先分析了斑马鱼的肝内血管和胆道网络是如何发展的。我们发现内皮细胞在50 hpf时首先接触肝脏背外侧(). 在这个阶段，Alcam位于肝脏所有细胞的整个细胞膜上(). 在55 hpf时，内皮细胞环绕整个肝脏，但尚未侵入肝脏()Alcam仍然位于大多数细胞的整个细胞膜上(). 有趣的是，在邻近周围内皮细胞的肝细胞中，内皮细胞接触的膜上没有观察到Alcam（插图). 60 hpf时，内皮细胞侵入肝脏（如图中的白色箭头所示)并且侵入内皮细胞周围肝细胞中的Alcam定位已开始受到限制，无法与内皮细胞接触的膜接触(). 我们观察到Alcam定位首先在侵入内皮细胞附近的肝细胞中发生变化（如图中的白色箭头所示)这表明内皮细胞在这一过程中发挥了作用。在80 hpf时，内皮细胞在肝脏中形成了高度分支的网络()Alcam免疫染色显示肝内胆道网的轮廓().
50（A和F）、55（B和G）、60（C和H）和80（D和I）hpf时肝脏的肝内血管和胆道网络投影（A–D）和z平面（E–H）共焦图像的协调发展。图像显示的是腹部视图，位于顶部前面。
（A–D）Tg（flk1:EGFP）s843幼虫可见GFP（绿色）和Prox1（蓝色）的表达。
（A） 到50 hpf时，内皮细胞在其背外侧与肝脏建立了接触（如箭头所示）。
（B） 在55 hpf时，内皮细胞包围了肝脏。
（C） 到60 hpf时，内皮细胞开始侵入肝脏（如白色箭头所示）。
（D） 到了80 hpf，内皮细胞在肝脏中形成了一个高度分支的网络。
（东-西）Tg（flk1:EGFP）s843条幼虫可见GFP（绿色）、Prox1（蓝色）和Alcam（红色）。轮廓区域被放大并显示在底部角落。
（E′–H′）Alcam免疫染色单独显示。到60hpf时，Alcam的表达已被限制在与内皮细胞接触的细胞膜相反的细胞膜上（如白色箭头所示），而它仍然沿着远离入侵内皮细胞的细胞的整个细胞膜定位（如黑色箭头所示）。五十、 肝脏；P、 胰腺。
因为Alcam似乎改变了其定位，从沿着整个细胞膜定位到局限于细胞的一侧，我们接下来研究了Alcam阳性侧的身份。顶域标记非典型蛋白激酶Cλ和ξ（aPKC）的双重染色[15,16]Alcam发现这两个标记在80 hpf时部分共定位()，表明Alcam在此阶段定位于肝细胞的顶膜。我们还发现，在55 hpf时，aPKC开始在肝细胞中显示局部表达()当Alcam仍然沿着整个细胞膜定位时，表明肝细胞在Alcam限制到顶膜之前开始极化。我们进一步观察到prkci公司（以前称为apkc公司λ） 突变幼虫，无法在许多上皮组织中建立顶叶极性[16]，Alcam仍然局限于肝脏大多数细胞的整个膜()表明肝细胞顶叶极性的建立对Alcam定位很重要。为了进一步验证Alcam定位于肝细胞顶膜的假设，我们对幼虫进行了Alcam和基底外侧肝细胞膜标记物Na的双重染色+-牛磺胆酸协同转运蛋白（Ntcp）[17]并观察到Alcam和Ntcp以相互排斥的方式定位于肝细胞膜(). 总之，这些数据表明，当内皮细胞沿着成熟的肝细胞基底膜侵入肝脏时，Alcam定位局限于肝细胞的顶膜。因此，我们认为斑马鱼的肝内胆道网络沿着肝细胞顶膜形成。在羊膜中，肝细胞的顶端区域形成小管网络，其基底区域面向窦状内皮细胞。因此，斑马鱼肝内血管网和胆道网之间的关系似乎与羊膜中正弦血管网和胆管网之间的联系等效。
Alcam定位于肝细胞的顶端膜
肝脏在55（A）、70（E和F）和80（B–D）hpf时的Z平面共焦图像。图像显示的是腹部视图，位于顶部前面。（A和B）野生型Tg（胶GFP）第854页幼虫可见GFP（假蓝色）、Alcam（红色）和aPKCs（假绿色）的表达。（A）和（B）中的轮廓区域被放大并显示在右下角。在55 hpf时，aPKC在Alcam限制前在肝细胞中表现出限制表达。Alcam和aPKCs在80 hpf时更广泛地共存。
（C）Tg（胶GFP）第854页全心全意m567型（有）/prkci突变幼虫在80 hpf下观察GFP（假蓝色）和Alcam的表达。轮廓区域的Alcam染色被放大并显示在右下角。在80 hpf时，Alcam定位局限于野生型幼虫肝细胞的顶膜有m567毫米突变体，它仍然局限于大多数细胞的整个细胞膜。
（D）Tg（flk1:EGFP）s843条幼虫可见GFP（假蓝色）、Alcam（红色）和Ntcp（绿色）的表达。Alcam和Ntcp免疫染色分别显示在（D′）中。阿尔卡姆和Tg（flk1：EGFP公司)s843条表达式分别显示在（D〃）中。
（E和F）野生型（E）和钟表拉1164（克隆）可视化的突变（F）幼虫Tg（flk1:EGFP）s843条70 hpf时表达（绿色）、Alcam（红色）和Prox1（蓝色）。在这个阶段，虽然Alcam已经定位于野生型肝脏大多数细胞的顶膜，但它仍然定位于许多细胞的整个细胞膜克洛拉1164变异肝脏。
肝细胞极化与肝内皮细胞侵袭之间的时空相关性表明，侵袭内皮细胞在调节肝细胞极化中起作用。为了验证这个假设，我们首先研究了肝细胞极化钟（cloche）突变幼虫，头部和躯干缺乏内皮细胞[18]. 我们发现在60 hpf时(图S2)和70 hpf()，Alcam在肝脏中的定位存在明显差异clo（克隆）突变幼虫及其野生型同胞。例如，在70hpf时，Alcam仍然沿着许多细胞的整个膜定位clo（克隆）变异肝脏()而它主要局限于野生型肝脏的顶膜。然而，在80 hpf时，Alcam局限于clo（克隆）突变肝脏(图S2)，肝内胆管网络似乎形成[19]. 这些数据表明，内皮细胞有助于肝细胞建立根尖极化，尽管并非绝对必要。为了进一步研究内皮细胞对肝细胞极化的影响，我们破坏了肝内血管网络的模式，并询问这种破坏如何影响肝细胞极化。我们用血管内皮生长因子（VEGF）受体抑制剂SU5416治疗幼虫[20]从55到80hpf，并在80hpf下进行分析。VEGF受体抑制剂治疗以不同方式破坏肝内血管网络的模式(和图S3). 我们发现，Alcam阳性网络的模式也随着肝内血管网络的破坏而改变：无论肝内血管网的模式是如何被破坏的，这两个肝内网络仍然没有相互接触或交叉（每个肝脏平均三个交点，n=5，SD=1.5）。例如，在SU5416处理的幼虫中，肝内血管网络被破坏（比较具有)、Alcam（比较具有)远离突出的血管分支（比较具有)表明内皮细胞可以影响Alcam定位。该幼虫的Z平面共焦图像显示，Alcam定位于远离接触这些内皮细胞的膜（如图中箭头所示′). 这些数据表明，内皮细胞可以影响相邻肝细胞的极化，如Alcam定位所示。我们通过移植进一步破坏了肝内血管网血管内皮生长因子A121[21]-过度表达的细胞进入肝脏。目标血管内皮生长因子A121-只在内胚层过度表达细胞，我们移植了同时过度表达Vegf-a的细胞121和Sox32到Tg（flk1:EGFP）s843条主机为4 hpf。在这些条件下，移植细胞有助于形成内胚层谱系[22]，我们分析了80只含有血管内皮生长因子A121-肝脏中过度表达的细胞(和图S4). 我们发现移植瘤周围的血管密度增加血管内皮生长因子A121-过度表达细胞，从而破坏肝内血管网（比较具有). 与VEGF受体-抑制剂治疗的结果一致，Alcam定位似乎随着肝内血管网络的破坏而改变（比较和)：这两个肝内网络仍然很少接触或交叉（每个肝脏平均四个交叉点，n=5，SD=1.2）。作为实验对照，我们移植了过度表达红色荧光蛋白和Sox32的细胞，发现它们不会干扰肝内血管或胆道网络的模式（数据未显示）。总之，SU5416治疗和血管内皮生长因子A121移植支持内皮细胞可以调节肝细胞极化的观点。因此，我们建议内皮细胞调节肝细胞极化，以调整肝内血管和胆道网络的精细排列，并确保这些肝内导管的间距均匀。
内皮细胞可以影响Alcam亚细胞定位
（A–D）Tg（flk1:EGFP）s843条用VEGF受体抑制剂SU5416处理的幼虫在55至80 hpf时可以观察到GFP（绿色）、Alcam（红色）和Prox1（蓝色）在80 hpf的表达。
（A） 投影共焦图像Tg（flk1：EGFP公司)s843条SU5416处理幼虫的肝脏中的表达，其中肝内血管网络（示意图如[A′]所示）被破坏，内皮细胞形成了一个死血管分支（箭头所示）。
（B） 同一肝脏的投影共焦图像显示Alcam在80 hpf时的表达。Alcam阳性网络的模式（图示见[B′]）反映了肝内血管网络的破坏。
（C） Alcam的合并图像（红色）和Tg（flk1：EGFP公司)s843条（绿色）表达表明肝内网络仍不相交。
（D） 同一幼虫的Z平面共焦图像。Alcam（用白色箭头表示）积聚在远离死血管分支的膜上（用箭头表示）。轮廓区域被放大并显示在（D′）中。（D′）中的Alcam免疫染色分别显示在（D〃）中。
（E–I）Tg（flk1:EGFP）s843条幼虫含血管内皮生长因子121在80 hpf条件下观察GFP（绿色）、Alcam（伪红色）和供体细胞示踪剂（罗丹明葡聚糖；伪白色）mRNA-过表达细胞。
（E） 投影共焦图像Tg（flk1：EGFP公司)s843在肝脏中表达。移植的血管内皮生长因子121mRNA-过表达细胞（用黑色箭头表示）破坏了肝内血管网（如图[E′]所示）。
（F） 同一肝脏的投影共焦图像显示Alcam在80 hpf时的表达。Alcam阳性网络的模式（示意图见[F′]）反映了肝内血管网络的破坏。
（G） Alcam（红色）和Tg（flk1：EGFP公司)s843条（绿色）表达表明肝内血管网仍不相交。
（H） 同一幼虫的Z平面共焦图像。轮廓区域被放大并显示在（I）中。
接下来，我们探讨了内皮细胞调节肝细胞极化的分子机制。内皮细胞在哺乳动物胰腺器官发生中的作用已被广泛分析[23–27]. 在胰腺发育的后期，内皮细胞提供基底膜，通过层粘连蛋白和β1-整合素信号调节内分泌细胞的增殖和成熟[25–27]. 因此，我们首先检查了内皮细胞和肝细胞周围的基底层。使用目前可用的抗体，我们没有检测到肝细胞极化期间内皮细胞或肝细胞周围层粘连蛋白α1（Lama1）或胶原IV沉积的显著水平(图S5). 因此，尽管基底膜的其他成分可能在肝脏发育中发挥重要作用，但这些数据表明内皮细胞对肝细胞极化的影响可能不受Lama1或胶原IV的介导。
然后，我们采用遗传学方法，试图识别影响内皮细胞对肝细胞极化影响的突变。我们假设，如果内皮细胞对肝细胞极化的影响受到损害，肝内血管网络将更频繁地与Alcam阳性网络相交。我们发现情人第259页（vtn）突变体[28,29]在80hpf时表现出这样的表型。在vtn网络突变肝脏在80 hpf时，肝内血管网经常与Alcam阳性网络相交（如图中箭头所示; 每个肝脏平均17次，n=5，SD=3.6，p<0.001；;图S6)而在野生型肝脏中很少观察到这种表型（平均5次，n=5，SD=1.6；). 这个vtn网络突变影响脑海绵状血管畸形2(立方厘米2)基因[29]，编码一种细胞质支架蛋白。因为vtn/ccm2基因似乎在肝脏内皮细胞中表达[29] (和图S7)，很可能vtn网络突变内皮细胞调节肝细胞极化的能力受到损害。
这个玻璃心基因调节肝细胞极化
（A–F）Tg（flk1:EGFP）s843条野生型（A和D），情人第259页（vtn）突变体（B和E），以及玻璃心552米（黑格）突变体（C和F）幼虫，可见GFP（绿色）、Prox1（蓝色）和Alcam（红色）的表达。80 hpf时肝脏的Z平面（A–C）和投影（D–F）共聚焦图像。（A和D）在野生型幼虫中，血管网络以Tg（flk1：EGFP公司)s843条表达与以Alcam表达为标志的胆道网络保持一定距离，通常不相交。
（B和E）输入vtn网络第259页突变体，肝内血管和胆道网络经常交叉（箭头所示）。
（C） 在黑格m552毫米突变体，表型与vtn网络第259页突变体，但较温和；肝内血管和胆道网络偶尔交叉（箭头所示）。
（G） 野生型、经Vegf-受体抑制剂处理的肝内血管和胆道网络之间的交叉点数量，血管内皮生长因子121mRNA-过表达细胞宿主，vtn网络第259页突变体，以及黑格552米80hpf下的突变体。误差线代表标准偏差。
（H和I）vtn网络（H） 和黑格（一） 在80只hpf野生型幼虫中表达。图像显示左侧前方的侧面视图。这两种基因似乎都在内皮细胞中表达。星号表示共同的主脉。黑色箭头指向肝内血管网。
（J） 80 hpf时肝脏的投影共焦图像。幼虫移植赫格内胚层中mRNA-过度表达细胞的Alcam（假红色）和罗丹明葡聚糖（供体细胞标记；假绿色）可见。箭头指向移植的黑格肝脏内mRNA过表达细胞。Alcam似乎在远离黑格mRNA-过表达细胞。Alcam表达模式如（J′）所示。
因为vtn网络已经证明在基因上与玻璃心(赫格) [29,30]编码跨膜蛋白，我们还分析了黑格552米突变幼虫[30]. 我们发现尽管表型比虚拟电视网络第259页突变体，肝内血管网黑格552米突变体在80 hpf时与Alcam阳性网络的交叉频率高于野生型; 平均每肝11次，n=5，SD=2.5，p<0.01；和图S6). 这个黑格该基因似乎也在内皮细胞中表达[30]在肝脏里(和图S7)表明Heg在内皮细胞中起调节肝细胞极化的作用。
因为Heg在其胞外结构域中含有EGF重复序列[30]我们推测它可能是内皮细胞向肝细胞的信号传递机制的一部分。为了验证这个假设，我们注射了编码Heg跨膜亚型的mRNA[30]在单细胞期，在80hpf时分析肝细胞极化。我们发现Heg过度表达的肝脏中Alcam表达减少，Ntcp表达增加，表明大多数肝细胞膜具有基底外侧特征（数据未显示）。我们进一步验证了Heg可以通过将Heg过度表达的细胞移植到肝脏来改变肝细胞极化的假设。为了将Heg过表达细胞专门靶向内胚层，我们将Heg和Sox32过表达细胞移植到4 hpf的宿主中[22]. 在这些条件下，我们获得了在80 hpf的肝脏中含有一些供体细胞的幼虫。在所有检查的病例中（n=6），我们发现Heg过度表达的细胞改变了周围细胞的Alcam放大模式。例如，在肝脏中含有一小群供体细胞的幼虫（用箭头表示)，Alcam似乎位于远离黑格-过度表达的细胞。我们还发现，肝脏中少量Heg过度表达细胞不会干扰肝内血管网络的模式（数据未显示）。这些数据表明黑格-过度表达的细胞可以改变周围肝细胞的极化，支持了Heg是内皮细胞影响肝细胞极化的介体的假设。
总之，在发育中的斑马鱼肝脏中，高度分支的肝内血管和胆道网络交织在一起。肝细胞排列的顶膜决定了肝内胆管网络的位置。内皮细胞可以影响肝细胞的顶叶极化，至少部分通过Heg，从而影响肝内胆管网的位置(图S8). 在一个特定的器官内，单个细胞的极化必须与整个器官结构相协调，才能发挥作用。我们提出，内皮细胞在协调周围细胞的极化中具有指导作用，至少在斑马鱼肝脏中，可能在其他器官中也是如此。
实验程序
斑马鱼养殖
斑马鱼(达尼奥雷里奥)幼虫是从野生型或杂合子突变鱼类的自然杂交中获得的，在28.5°C下饲养，并按照之前描述的年龄（在28.5℃下受精后的小时数）分期[31]. 本研究中使用了以下转基因和突变系：Tg（flk1:EGFP）s843条[10],Tg（GutGFP）第854页[8],全心全意m567型[16],钟表拉1164（洛杉矶加利福尼亚大学J.-N.Chen的礼物），钟表378立方米[18],情人第259页[28]、和玻璃心552米[30].
免疫组织化学和原位杂交
斑马鱼幼虫和成虫肝脏用1.5%甲醛固定在0.1 M PIPES和1.0 mM MgSO中4和2 mM EGTA在4°C下过夜。染色前，人工将卵黄和皮肤从幼虫中取出，将成年肝脏嵌入4%的SeaPlaque琼脂糖（BioWhittaker Molecular Applications）中，并用徕卡VT1000S振捣器切割成250μm的切片。用5%羊血清和1%Triton X-100将样品在PBS中封闭2小时。一级抗体在4°C下孵育过夜，二级抗体在室温下孵育4小时。我们使用了以下抗体：1:1000的Prox1兔多克隆抗体（Chemicon）、1:10的抗Alcam小鼠IgG1（Zn-5；ZIRC，抗Ntcp兔多克隆抗体（F.Suchy的礼物）为1:200，抗Lama1兔多克隆（Sigma）为1:2000，抗Fibronectin兔多克隆疫苗（Sigma1:200），抗胶原IV小鼠IgG1（Thermo Scientific）为1:200:100，荧光结合Alexa抗体（分子探针）为1:200-1。如前所述，我们使用生物素化2F11抗体对Alcam和mAb 2F11进行双重染色[13]. 处理后的样品安装在Vectashield（Vector Laboratories）中，并使用蔡司LSM5 Pascal共焦显微镜成像。所有三维共焦图像和电影都是用Volocity（即兴）构建的。
如前所述，进行了整体原位杂交[31].
药物治疗、微量注射和细胞移植
用1.2 mg/L的SU5416（一种VEGF受体抑制剂）处理幼虫，从55 hpf到80 hpf，以破坏血管模式。
血管内皮生长因子121,射频脉冲,黑格，以及sox32型如前所述制备并注射mRNA[31]. 每胚胎400、400、500和200 pg血管内皮生长因子121,射频脉冲,黑格，以及sox32型分别在单细胞期注射mRNA。
如前所述进行细胞移植[22]. 我们合成了可固定的罗丹明和生物素右旋糖酐（分子探针），以便可视化供体细胞。来自4个hpf供体胚胎的大约10-15个细胞被移植到阶段匹配的宿主胚胎的胚层边缘。
电子显微镜
用卡诺夫斯基固定剂固定幼虫和成年肝脏，并按照前面所述进行处理[32].
