长时程增强过程中单个树突棘中CaMKII的激活

摘要

CaMKII是一种由12个亚单位组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶¹每个亚单位都被钙的结合激活²⁺结合钙调素（Ca²⁺/CaM）。当一个CaMKII亚单位在T286位点被自动磷酸化时，其活性可以在Ca解离后保持²⁺/CaM公司²有人认为，CaMKII在突触后密度（PSD）中的激活可能会持续较长时间（超过小时）以维持LTP²CaMKII与包括NMDA受体NR2B亚单位（NMDAR）在内的多个离子通道相互作用^三和电压敏感钙通道（VSCC）⁴，表明CaMKII激活可能在这些通道的纳米域内启动，以产生通道特异性信号。然而，在单突触水平上，尚不清楚CaMKII激活是否是通道特异性的，CaMKIII激活在多大程度上被分隔，以及在LTP期间是否持续存在于受刺激脊椎中。

为了测量脊椎中CaMKII的活化，我们改进了先前报道的CaMKIα传感器Camuiα，开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的CaMKIIα传感器，其中CaMKIlα的N端和C端被供体和受体荧光团标记⁵为了优化灵敏度和亮度，我们使用FRET对单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）⁶和REACh，一种非辐射YFP变体⁷（Green-Camuiα），并使用双光子荧光寿命成像显微镜（2pFLIM）测量FRET^8-10激活Green-Camuiα应将CaMKIIα的构象改变为其激酶结构域暴露的开放状态¹从而降低FRET并增加mEGFP的荧光寿命(补充图1). 我们证实了Green-Camuiα被并入CaMKII十二碳全酶，Green-Camuiα的荧光寿命报告了与T286磷酸化和Ca²⁺/CaM绑定（补充说明）。我们从生物学角度¹¹用Geen-Camuiα和mCherry转染海马培养切片中的CA1锥体神经元。Green-Camuiα的表达水平估计为内源性CaMKIIα亚基水平的25-50%，CaMKILα亚基的内源性浓度估计为～10-100μM(补充图2，补充注释）。

树突棘结构塑性过程中CaMKII的活化

利用这项技术，我们成像了树突棘结构塑性过程中CaMKII的激活，这被认为与LTP有关^12-14(图1). 为了诱导突触特异性结构可塑性，我们在细胞外Mg为零的情况下，对单个树突棘施加了一系列2光子谷氨酸解束缚脉冲（0.5 Hz时为45个脉冲）^{2+ 13,14}谷氨酸去盖后脊柱体积迅速增加376±68%(图1c、e)并放松至104±21%的升高水平超过30分钟(图1c，f)^13,14结构可塑性与受刺激脊髓中Green-Camuiα的积累有关，该积累大致与体积变化成正比(补充图3)¹⁵通过阻断NMDAR（100μM AP5），树突棘的结构可塑性被破坏¹³(图1c、e、f). CaMKII抑制剂（10μM KN62）部分抑制了持续的结构塑性(图1c，f)，但瞬态阶段不明显(图1c、e)表明激活CaMKII是维持脊柱体积变化所必需的¹³Green-Camuiα的T286A突变体的过度表达降低了持续的脊柱增大(图1c，f,补充图4)证明该突变体作为显性阴性。由于T286A突变体的过表达水平相对较低（10-20%；补充说明），在全酶中相对较小部分的CaMKII亚基中抑制T286的自磷酸化可能足以抑制结构可塑性。这一结果与先前报道的T286A杂合敲除小鼠LTP减弱的研究一致¹⁶.

在单独的窗口中打开

图1

用2pFLIM结合双光子谷氨酸开盖法同时测量CaMKII激活和单棘结构可塑性

一，在缺乏细胞外镁的情况下，通过2-光子谷氨酸去钙诱导脊椎结构可塑性期间Green-Camuiα的荧光寿命图像²⁺寿命更长意味着活动增加。白色箭头表示未切割激光光斑的位置。

b，受刺激脊椎（表示为“Stim”）和相邻脊椎（显示为“Adj”，在受刺激脊柱5μm范围内）中Green-Camuiα荧光寿命变化的平均时间进程。还显示了使用药物抑制剂和T286A突变型Green-Camuiα的数据。受刺激脊椎的样本数（脊椎/神经元）为35/30，相邻脊椎为29/28，AP5为5/4，KN62为7/5，T286A为18/11。右侧面板：无套管期间荧光寿命变化的近距离视图。

c，受刺激脊椎和相邻脊椎中脊椎体积变化的平均时间进程。右：体积变化的近距离视图。

d日，CaMKII激活（平均0-40秒或前5点）。星形表示对照组和其他组之间的统计显著性(第页< 0.05).

e（电子），瞬时体积变化（1.5-2分钟内平均体积变化减去25-30分钟内平均的体积变化）¹³.

（f），持续的音量变化（25-30分钟内的平均音量变化）。

在结构塑性过程中，根据Green-Camuiα的荧光寿命测量，CaMKII的活性迅速增加(图1a、b). 这种活性仅限于受刺激的脊椎，不会扩散到树突或相邻的脊椎(图1a、b、d). CaMKII的激活先于脊柱体积的增大，这表明CaMKI触发了导致结构可塑性的分子过程(图1a、b、c). NMDAR阻滞剂AP5抑制了荧光寿命的变化，表明CaMKII被Ca激活²⁺来自NMDAR(图1b、d). CaMKII抑制剂KN62使荧光寿命变化降低40%(图1b、d). T286A和T305D突变传感器的活性较低，这表明钙调蛋白的结合和T286的磷酸化是脊椎中CaMKII完全激活所必需的(图1b、d,补充图4).

脊椎特异性CaMKII激活机制

一般来说，CaMKII活化的分区程度由两个因素决定：CaMKIII活性的失活时间常数和CaMKIL的迁移率^10,17因此，我们测量这些参数以研究限制CaMKII激活的机制。首先，为了精确测量CaMKII的动力学，我们以较高的时间分辨率（2s）成像CaMKIII活性，以响应一系列短的谷氨酸去钙脉冲（0.5 Hz，8个脉冲在细胞外零镁离子中²⁺). CaMKII的激活在6 s内达到一个平台，在停止去盖后，它被两个时间常数（6和45 s）灭活(图2a). T286A Green-Camuiα的活化程度远低于野生型，并在2 s内腐烂(图2a). 这些结果表明，T286磷酸化延长了CaMKII的激活，并允许在重复的谷氨酸去激活过程中积累激活的CaMKIL。为了测量CaMKII活化如何调节衰变动力学，我们用1到45个不同数量的非屏蔽脉冲刺激脊椎(图2b). 在45个未锁定脉冲的情况下，我们观察到棘的放大。我们的数据表明，衰变时间常数既不取决于刺激次数，也不取决于CaMKII激活水平(图2b).

在单独的窗口中打开

图2

确定脊椎特异性的参数测量：CaMKII的失活动力学和迁移率

一，使用野生型和T286A Green Camuiα在零细胞外Mg中对脊柱进行短暂刺激（8个脉冲，0.5 Hz）后CaMKII激活和失活的测量²⁺这些实验是以交叉方式进行的。固态青色曲线表示通过拟合野生型数据获得的双指数函数（时间常数：6 s[80%]和45 s[20%]）。蓝色虚线曲线表示时间常数为1s的单指数函数。野生型的样本数（脊髓/神经元）为25/5，T286A的样本数为28/4。

b.不同次数的去盖脉冲（1、8和45脉冲，0.5 Hz）后的CaMKII失活动力学。数据用双指数函数拟合（青色曲线）。1个脉冲的时间常数为9.3 s（71%）和>100 s（29%），8个脉冲为4.7 s（61%）和136.6 s（39%），45个脉冲为4.5 s（61%.）和102 s（39%。样本数（脊椎/神经元）为28/9（1个脉冲）、16/8（8个脉冲）和13/7（45个脉冲）。

c，使用可光活化GFP（paGFP）测量CaMKII的尖晶石-枝晶耦合。我们使用Green-Camuiα，mEGFP被paGFP（REACh-CaMKIIα-paGFP）或paGFP-CaMKIα取代。顶部面板：表达REACh-CaMKIIα-paGFP（绿色）和mCherry（红色）的神经元光激活前后的绿色和红色荧光。棒材，1μm。底部面板：红色和绿色比率的平均时间进程。信号被归一化为峰值荧光变化。第一个点是光活化后1s。通过双指数函数拟合，REACh-CaMKIIα-paGFP（青色固体曲线）的衰减时间常数分别为1.3分钟（48%）和17.0分钟（52%），而paGFP-CaMKIIIα（青色虚线曲线）为1.0分钟（53%）和20.7分钟（47%）。样本（棘/神经元）的数量为15/5（REACh-CaMKIIα-paGFP）和22/9（paGFP-CaMKIIα）。

d日.结构塑性过程中Green-Camuiα的棘-枝晶耦合。在谷氨酸开盖期间（720 nm，6 ms，45脉冲，Mg²⁺自由溶液），REACh-CaMKIIα-paGFP可以被光活化。我们从归一化绿色荧光中减去归一化红色荧光，假设REACh-CaMKIIα-paGFP的小基线荧光表现与mCherry荧光变化相似（参见补充图3). 通过双指数函数（青色曲线）拟合，得到了1.6min（82%）和15.3min（18%）的衰减时间常数。样本数（脊椎/神经元）为10/7。

接下来，我们使用光活化GFP（paGFP；图2c、d). 我们使用了一种Green-Camuiα变体，用光活化GFP（REACh-CaMKII-paGFP）替代EGFP，或使用标记了CaMKIIα的paGFP（paGFP-CaMKIl）。paGFP光活化后，由于CaMKIIα从脊柱向外扩散，绿色荧光衰减，时间常数为～1和～20分钟(图2c). Green-Camuiα光漂白后的荧光恢复（FRAP）也显示出类似的恢复时间常数(补充图5b-c). 我们还通过监测REACh-CaMKIIα-paGFP的衰变来测量CaMKIl在结构塑性过程中的迁移率，该衰变通过谷氨酸去壳方案（6 ms脉冲，45次）进行光激活。光激活REACh-CaMKIIα-paGFP以与静止状态类似的时间常数衰减(图2d). 与此棘-枝晶耦合时间常数一致，与脊柱体积变化相比，结构塑性瞬态阶段CaMKIIα在脊柱中的积累较小(补充图3). 由于CaMKII的失活速度快于其在脊柱外的扩散速度，因此CaMKII的激活必须局限于受刺激的脊柱，这与我们对结构塑性过程中CaMKII活性的测量一致(图1).

剥皮诱导LTP期间CaMKII激活

在存在细胞外镁的情况下²⁺海马CA1突触中LTP的诱导需要同时进行突触后去极化和突触激活以释放Mg²⁺NMDAR块¹⁸为了研究在这种条件下CaMKII激活的动力学，我们对LTP过程中的CaMKII激活进行了成像，LTP是在细胞外Mg存在的情况下，通过突触后去极化与2-光子谷氨酸解封配对诱导的²⁺（1百万）¹³(图3). 我们对转染Green-Camuiα和mCherry的神经元进行全细胞膜片钳记录，并测量-65 mV下2-光子谷氨酸去极化（uEPSC）诱发的突触后电流。该LTP方案诱导uEPSC和脊柱体积持续增加～150%，并维持60分钟以上(图3c、d). 在相同的LTP方案中，去极化在脊椎（2.6±0.5μM）和树突轴（2.6±.5μM）中产生了较大的钙升高，这可能是由于VSCC的激活所致¹⁹(补充图6a-c). 尽管去极化保持了1分钟以上，[Ca²⁺]在2秒内迅速衰减²⁰(补充图6b、c). 在少量残余Ca的顶部²⁺（0.21±0.07μM），随后的谷氨酸去盖产生的钙瞬变在1.8±0.3μM（第一次去盖）和0.8±0.2μM（第三十次去盖^21,22(补充图6b、c).

在单独的窗口中打开

图3

双光子谷氨酸去钙结合突触后去极化诱导LTP过程中CaMKII激活的成像研究

一，Green-Camuiα在2光子谷氨酸去极化与突触后去极化联合诱导LTP期间的荧光寿命图像。

b，受刺激脊椎、邻近脊椎（受刺激脊椎5μm范围内）和靠近受刺激脊柱的树突轴中Green-Camuiα荧光寿命变化的平均时间进程。右图：未时效期间荧光寿命变化的近景。来自8个神经元的8个受刺激棘、13个相邻棘和8个树突的平均值。由于样本数量较少，受刺激脊椎的绘图噪音较大。中受刺激脊椎的绘图b-d都来自同一根刺。

c，受刺激脊椎和相邻脊椎（5μm内）脊柱体积和-65 mV（uEPSC）下未激活EPSC振幅变化的平均时间进程。对于uEPSC，每一点是每隔5秒进行四次试验的平均值。在每四次试验测量之前，将未老化的点重新定位到脊椎尖端。

d日在LTP诱导前和诱导后60分钟，在单个脊髓上进行uEPSC（平均4次试验，用2 ms窗口过滤）。

作为对去极化的反应，树突轴中的CaMKII活性增加（寿命变化=0.079±0.018 ns），但脊椎中的活性降低（0.028±0.010 ns）(图3a、b). 谷氨酸去盖脉冲在受刺激的脊髓中引起额外的CaMKII激活（0.097±0.014 ns），但在相邻的脊髓中没有(图3a、b). 脊髓和树突状轴中的CaMKII活化在～2分钟内迅速衰减。LTP诱导过程中，脊髓和树突轴之间的CaMKII活化梯度较大，表明单个脊髓中CaMKI活化的高度区域化(图3a、b).

CaMKII的通道特异性激活

据报道，Ca²⁺对于由多个协议引起的LTP，需要通过VSCC^19,23-26因此，我们进一步以较高的时间分辨率（2s；图4). 我们发现，去极化后2秒内树突状轴中的CaMKII激活增加，在去极化（16 s）期间持续，然后在复极后迅速衰减(图4a). 棘中CaMKII的激活（0.034±0.004 ns）小于树突中的激活（0.076±0.007 ns）。[加利福尼亚州²⁺]在去极化过程中，2s内衰减，几乎没有额外的Ca²⁺保持10秒以上（0.21±0.07μM）(补充图6b). 因此，这些结果表明，[Ca²⁺]在去极化过程中足以维持CaMKII激活超过～10 s。在去极化期间，T286A突变体的失活速度比野生型快得多（不到4 s）(图4b)表明CaMKII的长时间激活需要在T286进行自磷酸化，复极后CaMKIII活性的下降是由于T286的去磷酸化。反向传播动作电位的爆发（83 Hz，0.5 s，8次，2 s间隔）也在脊椎和树突中产生类似的CaMKII激活(图4d).

在单独的窗口中打开

图4

突触后去极化对脊髓和树突CaMKII的差异激活

一，高时间分辨率测量脊髓和树突中Green-Camuiα的荧光寿命变化，以响应脊髓（红色）和树突轴（黑色）中突触后去极化（0 mV，16 s，以条形表示）。12个神经元平均有53个棘和30个树突。青色线是通过拟合获得的双指数函数。棘的时间常数为11.3s（84%），>300s（16%），枝晶的时间常数分别为6.8s（60%）和43.7s（40%）。

b，Green-Camuiα的T286A突变体的荧光寿命变化。8个神经元平均有19个棘和14个树突。

c，在L型VSCC抑制剂（20μM尼莫地平）存在下，Green Camuiα的荧光寿命变化。来自7个神经元的平均22个棘和15个树突。

d日，反向传播动作电位（bAP）的爆发在近端树突（<100μm）诱导CaMKII激活。我们每隔2秒应用8次bAP脉冲，每次83赫兹，持续0.5秒。来自7个神经元的平均22个棘和12个树突）。

尼莫地平是L型VSCC的阻滞剂，在去极化过程中阻断了树突棘中CaMKII的激活(图4c). 树突状轴中CaMKII激活的峰值不受L型VSCC的阻断影响，但活性衰减更快(图4c). 因为L型VSCC只产生一小部分钙²⁺细胞去极化过程中的棘和树突状轴(补充图6d)，L型VSCC依赖的CaMKII活化可能发生在L型VSCCs口的纳米结构域中^4,27,28此外，全球Ca²⁺非L型VSCC开放引起的升高并没有激活脊髓中的CaMKII(图4c)，尽管它与未激活诱发的Ca一样大²⁺标高(补充图6). 这一结果表明，全球Ca²⁺仅升高不足以激活棘中的CaMKII。

为了进一步验证CaMKII纳米结构域激活的假设，我们使用含有Ca的吸管进行了全细胞膜片钳²⁺螯合剂：EGTA或BAPTA。BAPTA和EGTA的离解常数与Ca相似²⁺但BAPTA的结合率高出约100倍²⁹因此，EGTA抑制全局Ca²⁺纳米域Ca上²⁺比BAPTA更具选择性²⁹与相同浓度的EGTA相比，BAPTA能更有效地抑制去极化诱导的CaMKII活化(图5a-f)表明纳米结构域Ca²⁺近钙通道足以激活脊髓和树突中的CaMKII。当神经元中装载EGTA时，去极化诱导脊髓中较大的CaMKII激活，表明存在全局Ca²⁺-依赖性CaMKII失活(图5b、c). EGTA存在下CaMKII活化动力学变慢(图5b、c)可能是由较小的Ca引起的²⁺-依赖性失活与单位时间内因钙减少而产生的较小激活相结合²⁺高程。与去极化诱导的CaMKII活化不同，EGTA和BAPTA都类似地还原了谷氨酸嵌合诱导的CaM KII活化(图5g-i)，表明纳米结构域Ca²⁺单独使用CaMKII不足以激活CaMKI。

在单独的窗口中打开

图5

钙的作用²⁺螯合剂对CaMKII活化的影响

a-e公司，脊髓和树突中Green-Camuiα的荧光寿命变化，以响应脊髓（红色）和树突轴（黑色）的突触后去极化（0 mV，0-16 s，用黑条表示），神经元的树突轴用不含Ca的电极拼接²⁺螯合剂(一)，5 mM EGTA(b)，20 mM EGTA(c)，5 mM BAPTA(d日)或20 mM BAPTA(e（电子）). 对照组样本数（脊椎/树突/神经元）为18/11/6(一)5 mM EGTA，29/14/7(b)20 mM EGTA，15/7/4(c)，5 mM BAPTA为21/7/5(d日)20mM BAPTA为18/7/4(e（电子）). 在建立全细胞补片后15分钟以上进行成像。

（f），荧光寿命变化依赖于钙的去极化（平均0-16 s）²⁺螯合剂浓度（EGTA：闭圈，BAPTA：开圈，红色：棘状，黑色：树枝状）。荧光寿命归一化为对照。

g小时，Green-Camuiα对谷氨酸去激活的荧光寿命变化（6 ms，细胞外Mg为零时45次刺激²⁺)用含有1-20 mM EGTA的电极拼接的神经元(克)，1-5 mM BAPTA(小时)在电流灯模式下。在打补丁灯之前，在相同的神经元中测量对照。用不含Ca的内溶液修补夹具²⁺螯合剂不改变荧光寿命变化(补充图7). 用于控制的样本数（脊椎/神经元）为22/9克1 mM EGTA为12/3，5 mM EGTA为15/3，20 mM EGATA为17/3，控制输入为16/7小时1 mM BAPTA为17/4，5 mM BAPT为14/3。

我，谷氨酸对Ca的去壳化诱导的荧光寿命变化依赖性（平均0-40 s）²⁺螯合剂浓度（EGTA：开环，BAPTA：闭环）。荧光寿命归一化为对照。

讨论

在本研究中，我们观察到LTP期间单个树突棘中的CaMKII激活。使用这种方法，我们证明了在2光子谷氨酸去钙诱导的LTP期间，CaMKII的激活主要局限于受刺激的脊椎(图.​.1,1,​,3).三). 这表明CaMKII激活对LTP的突触特异性很重要。这一发现与Ras的激活形成对比，Ras是LTP诱导所必需的另一种分子³⁰为了响应LTP诱导的刺激，Ras在受刺激的脊髓中被激活，然后被激活的Ras扩散至～10μm的树突长度，并通过扩散侵入附近的脊髓¹⁰限制性CaMKII激活可以通过脊椎和树突中CaMKIII的快速失活来解释（～5 s和～1 min：图.2a、b,​，4a）第4页)和缓慢的尖晶石-枝晶扩散耦合（～1和～20分钟：图2c、d)³¹：受刺激脊椎处激活的CaMKII在其扩散出脊椎之前被禁用。相反，Ras失活慢得多（～5分钟），而棘-枝晶耦合时间常数较小（～5秒）¹⁰这使得激活的Ras在失活之前扩散并侵入附近的脊椎。因为CaMKII和Ras在平行通路中作用，诱导LTP¹⁰，LTP的脊柱特异性可能由CaMKII产生，而Ras可能对LTP具有许可性，并负责树突状水平的信号传导，如LTP诱导阈值的调节^10,14.

LTP诱导过程中CaMKII的快速失活(图.​.1,1,​,3)三)与之前的研究一致，该研究表明，LTP维护不需要持续激活CaMKII^32,33然而，这似乎与证明在LTP诱导后T286磷酸化持续的生化研究不一致^34,35这种差异可能是由于样品制备（急性切片与培养切片）、测得的CaMKII群体（包括胞体与单个突触的整个裂解物）或刺激范式的差异造成的：以前的大多数生物化学研究使用强烈刺激在大量突触中诱导LTP，而我们在单个突触中诱导LTP。或者，只有与NMDARs NR2B亚基结合的CaMKII亚基亚群才能维持其活性^三,36考虑到PSD中的CaMKII比NMDAR多³⁷持续激活的CaMKII亚群可能低于我们方法的检测阈值。

我们发现T286磷酸化是CaMKII高激活所必需的，以响应重复的2光子非激活(图.​.1亿，1亿,​，2a）。2a个). [加利福尼亚州²⁺]每次开盖后瞬态仅持续～0.2 s(补充图6a-c)，由于钙含量高²⁺脊椎和树突中的挤压¹⁷因此，Ca²⁺/如T286A Green-Camuiα的激活时间过程所示，在这些刺激后，CaM应迅速从CaMKII中解离(图.​.2a、，2a个,​，4b）。4b个). T286的磷酸化延长CaMKII的激活约5 s(图.​.2a、，2a个,​，4a），第4页)，并允许在重复解锁过程中积累活化的CaMKII(图2a).

我们的成像结果表明，树突棘和树突轴中的CaMKII活化受不同的Ca调节²⁺细胞去极化反应的来源：树突棘中的CaMKII被L型VSCC特异性激活，而树突轴中的CaM KII除L型VSCCs的少量作用外，主要由非L型通道激活(图4). 因为L型VSCC对全球Ca没有贡献²⁺在脊椎和树突轴中(补充图6d)，L型VSCC依赖的CaMKII活化必须在L型VSCCs口的纳米域中产生^4,27,28.使用钙的实验²⁺不同结合率的螯合剂(图5a-f)也表明纳米结构域Ca²⁺在脊髓和树突中，钙通道足以激活CaMKII以响应细胞去极化。因为几种方案诱导的海马LTP需要L型VSCC^19,23-26L型VSCC激活CaMKII，尽管比NMDAR小(图.​.3,三,​,4),4)可能对LTP的调制很重要。

与CaMKII对去极化的激活不同，纳米结构域Ca²⁺仅NMDAR介导的CaMKII激活是不够的(图5g-i). 因为全球Ca²⁺通过非L型VSCC提升，尽管其高度和持续时间与无套管的[Ca一样长²⁺]高程(补充图6d)，不足以激活脊椎中的CaMKII(图4c)，NMDAR介导的CaMKII活化可能需要全局和纳米域Ca²⁺因此，CaMKII激活机制取决于Ca来源的通道²⁺发生流入。这种差异可能是由于通道附近的CaM定位不同所致。此外，钙的动力学²⁺-依赖性蛋白磷酸酶活性在形成CaMKII的时空动力学中可能很重要(图5a-f).

大多数LTP诱导方案涉及突触后去极化¹⁸，仅此一种就可以产生大量钙²⁺在脊椎中(补充图6)¹⁹然而，为什么单靠突触后去极化不能诱导突触非特异性LTP仍然是一个谜^18,19我们的结果表明去极化仅激活与L型VSCC相互作用的CaMKII的一个子集，这可能不足以诱导LTP³⁸因此，局部Ca²⁺-脊髓中介导的通道特异性CaMKII激活在诱导突触特异性LTP中起着重要作用。

方法总结

Green-Camuiα由Camuiα制成⁵将ECFP替换为mEGFP，将Venus替换为REACh（Venus_{A206K，T145W} ^7,39). 如前所述，从出生后第6-8天的大鼠制备海马培养切片⁴⁰.使用弹道基因转移稀疏地将Green-Camuiα和mCherry转染神经元¹¹体外培养8~14天，转染后2~5天成像。使用2pFLIM测量CaMKII活性，使用常规双光子显微镜测量脊椎中mCherry（红色）的荧光强度来监测脊椎体积变化^9,10使用ANOVA进行统计检验，然后进行最不显著差异的事后检验。所有误差条均表示标准偏差。

补充材料

致谢

附录

工具书类