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生物化学杂志。2009年6月19日；284(25): 16939–16947.
2009年4月21日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M808166200
预防性维修识别码：项目经理2719331
PMID：19386604

氧化应激使视网膜色素上皮细胞易受补体介导损伤*

约书亚·M·瑟曼,‡,1 布兰登·雷纳,‡,2 坎南·昆奇塔帕萨姆,§,2 维维亚娜·费雷拉, 迈克尔·K·彭伯恩,¶,三 Zsolt Ablonczy公司,§ 史蒂芬·汤姆林森,‖,1 V.迈克尔·霍尔斯,‡,4和巴贝尔·罗勒§,1,5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

补体替代途径的非受控激活被认为与年龄相关性黄斑变性（AMD）有关。替代途径在液相持续激活，组织表面需要持续的补体抑制，以防止自发的自体组织损伤。在这里，我们研究了氧化应激对永生化人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）调节细胞表面补体激活能力的影响。与H联合治疗2哦2（诱导氧化应激）和补体充足的血清被发现破坏稳定ARPE-19单层的屏障功能，如经上皮电阻（TER）测量所确定的。这两种治疗都没有任何效果。TER降低与C3的细胞表面沉积增加相关，可通过使用C7-缺失血清（末端补体途径的重要组成部分）来预防。H治疗2哦2补体抑制剂DAF、CD55和CD59的表面表达减少，血清中存在的因子H损害了细胞表面的调节。单分子膜与H的联合处理2哦2血清诱导血管表皮生长因子（VEGF）极化分泌。两者都可以通过使用替代途径抑制剂或阻断VEGF受体1/2信号来减弱VEGF的分泌和TER的减少。综上所述，这些研究表明，氧化应激降低了ARPE-19细胞表面补体的调节，增加了补体的激活。这种亚细胞激活导致VEGF释放，从而介导细胞单层的破坏。这些发现将氧化应激、补体激活和顶端VEGF释放联系起来，这些都与AMD的发病机制有关。

老年性黄斑变性（AMD）6是老年人失明的主要原因(1). 临床上，AMD分为“干型”或“湿型”。在干型AMD中，视网膜色素上皮（RPE）和基底膜（Bruch’s膜）之间会形成沉淀物（血栓）。患者的光感受器功能和视力的丧失归因于RPE的萎缩变化(1,2). 湿性AMD的特征是脉络膜新生血管通过Bruch膜和视网膜色素上皮延伸至视网膜下间隙。随后渗出液和血液的泄漏被认为是导致湿性AMD纤维化特征最终发展的原因。AMD被假设为一种进行性疾病，干型和湿型可能代表疾病严重程度谱上的不同点。大约10-15%的轻度干性AMD患者会发展为湿性AMD(1).

一些观察结果表明，补体级联反应的非受控激活有助于AMD的发展和进展。补体替代途径的循环抑制剂补体因子H的多态性与AMD的发生密切相关(三–6). 致密沉积病（一种由替代途径失调引起的肾小球肾炎）患者也会出现类药疹(7,8). 对酒糟成分的分析表明，它们含有重要的补体蛋白，包括C3、C5、膜攻击复合物（MAC）和内源性补体调节蛋白(7,8). 因子H基因缺失小鼠(立方英尺/小时−/−小鼠）在整个视网膜色素上皮和神经视网膜外层积累C3，并在衰老过程中比野生型同窝出生的小鼠更快地失去视觉功能(9). 此外，在激光诱导脉络膜新生血管的小鼠模型中，C3a和C5a阻断信号传导可减少眼睛中VEGF的生成并减少新生血管生成(10). 总之，这些研究表明，在AMD中，对替代途径的控制不足1）导致了在RPE和布鲁赫膜中观察到的结构变化，包括核糖核酸酶的形成；和2）是VEGF介导机制的上游。

补体的替代途径在液相中持续激活，组织表面对该途径的抑制不足可能会导致补体的自发激活，从而快速扩增和生成促炎激活片段(11). 在AMD等晚发性疾病中，替代途径的局部调节可能会逐渐被细胞损伤或碎片的积累所淹没(12,13). 一些环境因素导致RPE层高度氧化应激，RPE细胞的氧化损伤可能是AMD的重要原因(14). 因此，我们假设氧化应激可能损害RPE调节其表面补体的能力。在完整的成人眼睛中，RPE细胞上只发现了一种细胞表面补体抑制剂，即膜辅因子蛋白（MCP；CD46）(15). 在目前的研究中，我们研究了ARPE-19细胞是否表达三种细胞表面补体抑制剂CD46、衰变加速因子（DAF；CD55）和CD59；以及培养物中RPE细胞的氧化应激是否改变补体抑制蛋白的表面表达或减少因子H对细胞表面替代途径的抑制，RPE细胞上补体的亚溶解激活诱导这些细胞释放VEGF，这是已知的屏障功能受损。这些研究的目的是构建一个模型，根据该模型，眼睛中的氧化应激可能与导致AMD的炎症事件有关，包括补体的不受控制的激活。

材料和方法

试剂

这些研究中使用的试剂包括作为补体蛋白来源的混合正常人血清（NHS（Quidel））。为了防止最终补体途径的形成，在一些实验中，使用了C7耗尽的血清（Quidel），并向血清中添加纯化的C7（250μg/ml；Quidel。使用了针对DAF（Chemicon International）、CD59（ChemiconInternationals）、MCP（Monosan）和C3（ICN Pharmaceuticals）的一级抗体。物种特异性二级抗体来自Jackson ImmunoResearch和MP Biomedicals，Inc.。为了阻断补体激活的替代途径，如前所述产生靶向抑制蛋白（CR2-fH）(16). 该药物将因子H的抑制域靶向C3d沉积位点，并有效阻断替代途径的激活。为了阻断因子H对细胞表面补体的抑制，我们使用了一种称为重组因子H域19-20（rh-19-20）的蛋白质(17). 该蛋白是因子H的第19和第20个短一致重复序列的重组形式，包含多阴离子和C3b结合区域，但不包含全长因子H蛋白的N末端补体调节区域。它竞争性地阻断天然因子H与细胞表面的相互作用，从而阻止因子H在这些表面上对补体激活和扩增的调节。VEGFR-1/2抑制剂SU5416（Chemicon）用于阻断VEGF的作用。SU5416型(Z-3-[（2,4-二甲基吡咯-5-基）亚甲基]-2-吲哚啉酮）是一种亲脂合成受体酪氨酸激酶抑制剂，通过与受体激酶域内的ATP结合囊结合来抑制VEGFR-1/2。SU5416已被证明抑制VEGF依赖的内皮细胞增殖在体外在动物模型中。

细胞培养系统

这些实验是使用ARPE-19细胞进行的，ARPE是一种显示RPE细胞分化表型的人类视网膜色素上皮细胞系，并在Transwell滤光片（Costar）上形成极化单层(18,19). 这些细胞生长在Dulbecco改良的Eagle's培养基F12（Invitrogen）中，F12含有10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素。在一些实验中，细胞在Transwell过滤器上作为单层生长。在这些实验中，在测量前的最后5-7天（2-3次培养基改变），胎牛血清被完全清除，我们之前已经证明，这不会改变这些细胞的存活率或单层形成(20). 通过使用EVOM伏特-欧姆计（世界精密仪器）测量跨单层电阻来确定Transwell过滤器上细胞单层的跨上皮电阻（TER）。细胞单层的值通过减去无细胞过滤器的TER，然后乘以过滤器的表面积来确定。当TER重复测量为～40–45Ω/cm时，细胞单层被认为是稳定的2(20). 与膜渗透性成比例的TER测量值是RPE单层屏障功能的可接受读数(18,20). 在平行实验中，细胞在细胞汇合后在平板或玻片上生长约2周，以模拟Transwell平板中的条件。将这些长期培养的细胞用于流式细胞术（平板）或免疫荧光显微镜（玻片）。

氧化应激和补体激活的体外模型

作为氧化应激的模型，用0.5μm处理稳定的ARPE-19细胞单层米第页，共页2哦2以前有报道称，剂量高达1米米不具有细胞毒性，不会破坏这些细胞的屏障功能(21). H治疗后2哦2，单层细胞暴露于25%NHS作为补体蛋白的来源。在一些实验中，NHS被C7缺陷的HS取代，或者NHS的补体系统被NHS的热失活（在52°C下30分钟）或用CR2 fH治疗抑制。用SU5416处理细胞，可抑制VEGFR-1/2活化产生的VEGF效应。

流式细胞术

流式细胞术检测各种补体调节蛋白的表面表达。ARPE-19细胞在长期培养中生长。细胞通过Accutase（Innovative Cell Technologies，Inc.）处理从平板上释放出来，在磷酸盐缓冲盐水中清洗，然后用H处理2哦2或rH-19-20，如具体实验所述。对于补体激活实验，然后将细胞在37°C的10%NHS中孵育1 h。通过将细胞与一级抗体在4°C孵育1h，然后在磷酸盐缓冲盐水中清洗细胞，并在必要时与适当的二级抗体孵育来进行表面蛋白染色。然后将细胞清洗并重新悬浮在500μl磷酸盐缓冲盐水中，在FACSCalibur机器（BD Biosciences）上运行，并使用CellQuest Pro软件（BD生物科学）进行分析。荧光以相对荧光单位表示。

免疫荧光显微镜

用免疫荧光显微镜检测DAF和CD59在ARPE-19细胞上的表面表达。细胞被镀在玻璃盖玻片上，在达到汇合处后生长2周，以生成极化单层。用磷酸盐缓冲盐水清洗后，将细胞固定并在冷丙酮/甲醇（1:1）中浸泡5分钟，使其渗透。用Superblock（ScyTek Laboratories）处理细胞，然后用抗DAF、抗MCP、抗CD59或抗Na孵育，可阻断非特异性结合+K（K）+-ATP酶抗体（4°C下1:400持续1小时）。清洗细胞，然后用适当的二级抗体孵育。作为阴性对照，省略了主要抗体。使用配备共焦显微镜的尼康T-2000倒置显微镜检查细胞染色，并使用Slidebook 4.2软件（智能成像创新）进行分析。根据制造商（Roche Diagnostics）之前发布的方案，对Transwell过滤器上的细胞进行TUNEL（TdT-mediated dUTP nick-end labeling）染色(22). 简言之，在4°C下将单层膜固定在2%多聚甲醛中2 h，然后进行TUNEL标记和荧光蛋白显示DNA链断裂。

VEGF和C5b-9的ELISA测定

为了测量细胞产生VEGF，将细胞培养上清液浓缩（Amicon Ultra-4，3000 Da截止值；Millipore），溶解在CellLytic MT（哺乳动物组织裂解/提取试剂；Sigma）中，并在20000×克用VEGF捕获抗体（Antigenix America，Inc.）包被微孔板5分钟，并添加100μl浓缩上清液。捕获的蛋白质用与辣根过氧化物酶结合的同一VEGF特异性抗体检测，然后用显色底物OPD（Sigma）显影。通过在492 nm处测量吸光度来分析产品开发。分两次对等分样品进行分析，并将数值与VEGF剂量-反应曲线进行比较。为了测量补体激活期间形成的C5b-9，将细胞上清液按1:10稀释，并按照制造商的说明进行C5b-9（奎德尔）的ELISA检测。

Western Blot分析

细胞培养上清液在10%BisTris聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上通过电泳分离，蛋白质转移到硝化纤维素膜上。用C3多克隆抗体（ICN Pharmaceuticals）探测膜，并使用化学发光检测试剂盒（Amersham Biosciences）观察抗体结合。

统计

数据表示为平均值±S.D.Statview软件用于统计分析。Fisher保护最小显著性差异（PLSD）用于比较随时间变化的趋势。使用学生的t吨测试。

结果

氧化应激使RPE对血清暴露的损伤敏感

ARPE-19细胞在Transwell过滤器上作为单层生长，并监测TER，直到达到稳定值。TER为40–45Ω/cm2是在紧密连接形成的基础上建立上皮屏障功能的结果。TER测量值的变化可用于探测屏障功能完整性，作为RPE损伤的早期标志。细胞暴露于25%NHS（作为补体蛋白的来源）不会改变TER(图1A类). 同样，细胞暴露在0.5 m米H（H）2哦2诱导氧化应激并没有显著改变TER，证实了Bailey及其同事以前的结果(21). 然而，用0.5 m处理细胞米H（H）2哦225%的NHS加在一起确实以时间依赖的方式显著降低了TER(第页< 0.01). 通过对血清进行热灭活以耗尽补体活性，可显著降低因氧化应激细胞暴露于血清而引起的TER下降(第页< 0.01). 为了证实血清的作用是由于补体激活而不是其他不耐热成分，使用了C7耗尽的血清来代替补体充足的NHS(图1B类). 与热灭活一样，C7-缺失的血清在降低TER方面无效，这表明膜攻击复合物在减少TER中起着重要作用。将纯化的C7添加到C7缺失的血清中，恢复了血清降低TER的能力，证实了C7缺失血清缺乏疗效是由于缺乏该因子。H的应用2哦2与基底表面相比，顶部表面的血清引起的TER变化更大(图1C类;第页=0.02），表明氧化应激后，心尖表面更容易受到补体介导的损伤。根据TUNEL染色，在任何治疗方案中均未观察到凋亡细胞，包括与H2哦2和血清(图1D类). 为了诱导稳定单层细胞的凋亡，有必要增加H2哦2浓度为10倍。因此，氧化应激细胞暴露于血清会损害细胞单层的屏障功能，但在这个系统中，TER的下降并不是由于直接的细胞毒性。

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氧化应激与正常人血清结合，由于补体激活而破坏ARPE-19单层。生长ARPE-19细胞，直到获得稳定的TER。A类，用H处理细胞2哦2、血清、H2哦2和热灭活血清，或H2哦2和血清。虽然用H治疗2哦2或单独使用血清并没有显著降低TER，与H联合治疗2哦2血清确实导致TER恶化，在4小时内达到最大效果2哦2与单独的血清相比，血清导致TER显著下降2哦2和HI血清，或H2哦2当采用费希尔保护最小显著性差异（PLSD）进行分析时，单独使用。B类，用H处理细胞2哦2和血清或H2哦2和C7缺陷血清持续4小时。不能形成MAC的C7缺陷血清没有导致TER下降。重组C7恢复了血清降低TER的能力。C类，当细胞暴露于H2哦2和血清在其根尖上放置4小时(Ap公司)表面上，TER的下降幅度比暴露在基底层时更大(文学士)表面。D类在任何治疗条件下均未观察到ARPE-19细胞的TUNEL阳性染色，这表明这些治疗引起的TER下降不是由于细胞毒性。暴露于5 m米H（H）2哦224小时作为TUNEL的阳性对照。数据表示为平均值±S.D(误差线)的面板A–C(n个=每种情况3–6）；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.

RPE氧化应激使细胞表面的补体活化

接下来，我们通过流式细胞术测定C3活化片段（如C3b和C3d）在细胞表面的固定情况，以此作为补体活化的标记物，以确定氧化应激是否会损害ARPE-19细胞调节其表面补体激活的能力。我们发现用H2哦2即使在缺乏外源性补体蛋白的情况下，也会导致表面C3b/d染色增加(图2A类). 对应激或损伤的上皮细胞产生和释放补体成分的情况进行了详细描述(23). 接下来，我们研究了氧化应激对作为补体来源的NHS暴露细胞补体调节的影响。细胞暴露于10%NHS 1h后，C3b/d固定在细胞上，但经h处理的细胞表面C3b/d水平较高2哦2接触血清前(图2B类). 表面C3b/d的增加伴随着上清液中完整C3水平的下降(图2C类). 与之前用H处理过的细胞接触后，完整（～185 kDa）C3水平降低2哦2以剂量依赖的方式。换句话说，细胞的氧化应激导致完整C3的消耗增加，随后添加到上清液中。细胞上清液中C5b-9的ELISA证实，当血清暴露于氧化应激细胞时，会形成可检测的MAC水平，而当血清暴露在未经处理的细胞时，则不会形成MAC水平(图2D类).

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氧化应激增加ARPE-19细胞表面的补体激活。极化ARPE-19细胞用1m米H（H）2哦2流式细胞术检测氧化应激和表面C3b/d。A类，用C3多克隆抗体对未处理的细胞进行染色(填满)高于同型对照组(虚线). 用H处理的细胞2哦2表明C3b/d的表面水平较高(实线)而不是未经处理的细胞。B类、ARPE-19细胞暴露于血清(实线)经证明，表面C3b/d大于未经处理的对照(填满)，但氧化应激ARPE细胞(虚线)与未暴露于H的细胞相比，暴露于血清后的表面C3b/d更大2哦2。显示了至少三个独立实验的代表性结果，并对数据进行门控，以仅显示活细胞的结果。C类，用不同剂量的h处理细胞1小时2哦2清洗，然后暴露于血清中。上清液中C3的蛋白质印迹分析证实，暴露于氧化应激细胞后，血清中完整的C3（~185kDa）被更大程度地消耗。当用对照血清探测时，未发现低分子量条带，可能代表C3裂解片段或抗C3抗体与上清液中其他蛋白质的非特异性结合。D类，ELISA检测细胞上清液中C5b-9水平证实，当氧化应激细胞暴露于血清中时，补体被激活，MAC形成，而当未经处理的细胞暴露于血浆中时，则没有。*，第页< 0.05.

以前的研究表明，凋亡和坏死细胞上补体调节蛋白的表达可能减少(13)，这可能是C3b/d结合增加的原因。通过正向散射和侧向散射以及Annexin V和碘化丙啶染色对存活、凋亡和坏死人群中的C3b/d沉积进行比较（数据未显示）。与H联合治疗后C3b/d沉积增加2哦2酶处理释放细胞后，在凋亡和坏死的细胞群中可观察到血清。然而，更重要的是，活细胞的表面C3b/d增加，这表明氧化应激的ARPE-19细胞上的补体沉积是细胞表面非细胞毒性变化的结果。中的数据图2显示C3b/d沉积在活细胞上。

氧化应激过程中表面补体调节蛋白的表达减少

以前有报道称，基于免疫组织化学，人RPE细胞表达MCP，而DAF和CD59无法检测到(15). 在这里，我们使用FACS分析确定了人类ARPE-19细胞上所有三种膜结合抑制剂的存在(图3). 免疫荧光显微镜与三维重建一起进行，以确定DAF和CD59的表面表达是否极化(图4). 通过使用顶端标记Na标记来验证顶端侧+K（K）+-ATP酶。在未分化的极化单层细胞中，DAF和CD59的表达集中在顶端和基底外侧；抗CD46抗体不适合用于免疫荧光。

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氧化应激降低ARPE-19细胞DAF和CD59的表面表达。DAF、MCP和CD59的ARPE-19细胞染色(填满)与同型对照染色相比，所有三种膜结合抑制剂的表面表达均得到证实(灰色线条). 选通仅用于检测活细胞。A类，用1m剂量处理细胞1h后，DAF的表面表达降低米H（H）2哦2.B类，MCP的表面表达没有改变。C类，CD59的表面表达在未分化细胞中呈双峰分布，高表达细胞的表面水平在H处理后降低2哦2。显示了至少三个独立实验的代表性结果。D类与未操作细胞的表面水平相比，氧化应激细胞的CD59和DAF水平分别降至61±4%和70±3%。E类，用H处理细胞2哦2对血清、表面DAF和C3b/d进行染色。表面DAF水平低的细胞比DAF水平高的细胞沉积C3b/d更多(n个=3用于D类和E类); *,第页< 0.001.

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DAF和CD59在ARPE-19细胞的顶端和基底外侧表面表达。细胞在盖玻片上生长汇合。然后对其进行渗透和染色以进行DAF(A类)，CD59(B类)和Na+K（K）+-ATP酶(C类). DAF和CD59的最佳焦点视图显示了其在质膜中的顶端和基底外侧定位，三维重建证实了DAF和CD59与Na相比的顶端和基外侧浓度+K（K）+-ATP酶，已知其仅在顶端富集。

氧化应激ARPE-19细胞上的补体激活可能是补体蛋白或激活蛋白酶局部浓度增加的结果(11). 另外，我们假设补体调节蛋白表面水平的降低可能是H处理后细胞补体活化增加的原因2哦2用H处理后DAF的表面水平降低2哦2(图3,A类和D类)到～70%的非分泌细胞(第页< 0.001); 而用H处理后，细胞上MCP的表面水平没有明显变化2哦2(图3B类). 对未经处理的细胞进行CD59的测量显示细胞的高表达和低表达群体(图3C类). H治疗2哦2在高表达但不低表达的细胞群中引起表面CD59的向下移动。所有细胞的平均CD59表达降至非分泌细胞的约60%(图3D类;第页< 0.001). 从机械上讲，DAF通过C3转化酶的经典和替代途径加速C3转化酶类的衰变并减少C3的裂解，因此DAF水平的降低与观察到的表面C3b/d沉积的增加相一致(图2). 为了进一步探讨这种关系，用H2哦2接触血清，DAF和C3b/d染色，并进行FACS分析。细胞是否表达高或低水平的DAF被选通。低DAF细胞上的C3b/d沉积比高DAF细胞高约2.5倍(图3E类). CD59抑制细胞表面MAC的形成，但不抑制C3的裂解。如所示图1B类，MAC的形成对于H治疗后观察到的TER下降是必要的2哦2和血清。因此，DAF或CD59的减少可能会使RPE细胞更容易受到补体攻击。

氧化应激细胞中H因子在保护ARPE-19细胞免受补体介导损伤中的作用降低

除了细胞表面补体抑制剂外，血清因子H还可能调节ARPE-19细胞的替代途径(24). 为了确定因子H是否有助于调节ARPE-19细胞表面的补体激活，我们用rH-19-20培养细胞，rH-19-20是一种重组蛋白，通过阻断其结合来抑制因子H在细胞表面的活性。如所示图2，仅将细胞暴露于10%的血清中会导致C3b/d沉积在细胞表面。每毫升血清中添加50μg rH-19-20导致沉积在细胞表面的C3b/d数量增加(图5A类). rH-19-20的平均荧光比不含rH-19-20的细胞平均高40%(n个= 3,第页< 0.05). 这些结果表明，在正常条件下，血清衍生因子H限制了ARPE-19细胞表面补体的激活。

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血清中的H因子限制了未经处理的ARPE-19细胞表面的补体激活，但不限制氧化应激细胞的补体活化。将ARPE-19细胞暴露于10%的血清中，添加或不添加50μg/ml的主要阴性形式的因子H(rH-19–20). 因子H是一种在正常血清中高浓度发现的替代途径抑制剂。A类当将rH-19-20添加到细胞中时，如果将其标准化为仅用血清获得的值，则会在细胞表面造成更大的沉积，这表明当细胞暴露于完整的补体系统时，因子H限制了细胞表面的补体激活。B类，当用H处理细胞时2哦2与单独血清相比，血清暴露导致C3b/d沉积增加2倍以上，但反应中添加rH-19-20并未导致表面C3b/d染色进一步显著增加。数据表示为平均值±S.D(误差线),n个=每种情况下为3。

如上所述，用H2哦2在将细胞暴露于血清之前引起C3b/d沉积增加。在用H预处理的细胞中2哦2然而，rH-19–20的添加并没有导致血清暴露后细胞上C3b/d沉积的显著进一步增加（增加了11%，n个= 3,第页=无。；图5B类). 因此，因子H控制非分泌细胞表面补体的激活和扩增(图5)，似乎无法补偿在受到氧化应激的细胞中观察到的膜结合调节因子的减少(图3).

氧化应激ARPE-19细胞上的补体激活诱导VEGF分泌，VEGF有助于ARPE-19单层的破坏

VEGF介导的脉络膜新生血管参与AMD的损伤，RPE层已被确定为VEGF生成和分泌的重要部位(25). 先前的研究表明，生物活性补体激活片段可在AMD动物模型中诱导VEGF的生成(10). 之前的研究使用t吨-作为氧化应激源的过氧化氢丁酯表明，这种氧化剂本身可诱导ARPE-19细胞产生和分泌VEGF(26).

为了确定氧化应激和补体激活对VEGF分泌的影响，用ELISA法测定ARPE-19细胞上清液中的VEGF水平。与Kannan及其同事以前的报告一致(26)用于ARPE-19细胞，由Blaauwgeers及其同事完成(27)对于分化的人RPE细胞，未经处理的RPE单层的基础分泌VEGF高于顶端分泌(图6A类). VEGF分泌没有被H持续改变2哦2或NHS单独应用于心尖腔。然而，联合用药H2哦2NHS对心尖表面的作用导致心尖VEGF分泌增加～100倍，基底分泌增加～50倍。用H刺激心尖的最大分泌量2哦2NHS的VEGF为～500 pg/ml(图6A类). 添加CR2-fH或SU5416可防止H2哦2以及NHS诱导的VEGF释放。在本实验中使用C7耗尽血清时，细胞不分泌VEGF。然而，如果在接触细胞之前将C7添加到C7耗尽的血清中，细胞确实分泌了VEGF，这证实了氧化应激细胞上MAC的形成对于该系统中VEGF的生成是必要的。

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ARPE-19细胞上的补体激活可诱导VEGF的分泌，进而破坏屏障功能。ARPE-19细胞作为单层生长，直到获得稳定的TER。A类，在根尖处理4小时后，去除根尖和基底上清液并分析VEGF含量。在基线检查时，VEGF的分泌呈两极分化，基底室的分泌增加。H（H）2哦2和血清单独对VEGF分泌没有一致的影响，而H2哦2+血清共同导致VEGF释放显著增加。与基底分泌物相比，这种增加表现出相反的极性，向心尖室的分泌物增加。H（H）2哦2+血清介导的VEGF释放可以通过阻断补体的替代途径（CR2-fH）或VEGF受体信号传导（SU5416）来抑制。当C7缺失血清用于氧化应激细胞时，VEGF不会分泌，但当C7耗尽血清与纯化的C7重新组合时，会分泌VEGF，这表明MAC的形成与这些细胞分泌VEGF.有关。数据表示为平均值±S.D(n个=每种情况3–6）。B类和C类，用H治疗2哦24小时后，血清导致TER降低。联合应用CR2-fH（一种替代途径抑制剂），以及添加VEGF受体1/2拮抗剂（SU5416），可以阻止TER下降。统计比较指无治疗与H（H）2哦2+血清；和C7-缺失血清与去C7-血清加纯化C7.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.

如果暴露于NHS的氧化应激ARPE-19细胞单层导致的TER下降依赖于补体介导的VEGF释放，那么用重组靶向型因子H（CR2-fH）抑制补体的替代途径或用SU5416阻断VEGF受体信号应该可以防止TER下降。两种抑制剂均能显著降低H的联合作用2哦2TER上的NHS(图6,面板B和C类)表明替代途径激活和VEGF受体信号都有助于细胞单层的破坏。

这些结果共同表明，RPE细胞上的补体激活可诱导细胞分泌VEGF。使用SU5416抑制剂的实验表明，VEGF触发自分泌反馈，导致VEGF介导的VEGF分泌。体内这种反馈作用将使炎症部位持续释放VEGF。这种释放的VEGF可以促进RPE屏障特性的丧失、脉络膜血管生成和CNV的发展。补体激活和下游VEGF的产生似乎对ARPE-19单层的破坏至关重要。

讨论

我们的结果表明，氧化应激阻碍了RPE细胞控制其表面补体系统激活的能力。ARPE-19细胞表达膜相关补体抑制剂DAF、MCP和CD59。利用rH-19-20，我们还证明了液相补体抑制剂因子H在控制ARPE-19细胞表面补体活化方面具有重要功能。在氧化应激的细胞中，DAF和CD59的表面水平降低，而H因子对补体抑制的贡献不太明显。这些变化与细胞表面补体激活增加有关，如C3b/d沉积增加所述，并导致RPE单层屏障功能受损。屏障功能的降低与细胞毒性引起的细胞损失无关，而是与VEGF的分泌有关，VEGF是一种与RPE屏障功能破坏有关的细胞因子。通过使用补体抑制剂或VEGF信号抑制剂的替代途径处理细胞，可以等效地防止屏障功能受损。这表明，在RPE单层细胞中，补体激活本身并不溶解细胞，而是补体诱导的VEGF以自分泌方式破坏上皮紧密连接。

补体的替代途径在液相持续激活，组织表面需要持续的补体抑制，以防止自发的自体细胞损伤(11). 观察到的DAF表面表达的降低、因子H对表面抑制的相对降低以及氧化应激的ARPE-19细胞释放C3都可能促进细胞表面的补体激活。此外，CD59的减少将增加MAC组装，这对于H2哦2和血清诱导的TER下降。用H处理细胞2哦2似乎导致血清中H因子控制细胞表面C3转化能力的相对和绝对下降。这可能是由于因子H与氧化应激细胞表面的相互作用减少，或者因子H可能无法补偿DAF抑制作用的减少和C3生成的增加。最后，因子H也可能通过除短一致重复序列19-20以外的其他域与氧化应激细胞相互作用，这将影响rH-19-20作为因子H细胞表面竞争对手的效率。

补体调节蛋白，特别是因子H的多态性与AMD的发生密切相关(三–6)补体系统的中断可减轻AMD动物模型的损伤(28). 对因子H常见AMD相关多态性的结构功能分析表明，疾病相关多态性蛋白产物与糖胺聚糖的结合减少(29). 目前尚不清楚为什么视网膜是携带这些多态性的患者的特定损伤部位，也不清楚后天事件对视网膜补体激活有什么贡献。然而，由于补体级联在眼部的低水平持续激活(30)可能更需要补体抑制剂的严格调控，以防止该部位的自体组织损伤。因此，补体调节的任何损伤都可能产生补体介导的炎症。根据我们的研究结果，我们认为RPE层的持续氧化应激可能通过减少受影响细胞上DAF和CD59的表达、减少因子H的表面抑制以及刺激细胞产生C3来促进补体激活。此外，RPE细胞光氧化的脂褐素产物也可以直接激活补体(31). 因此，RPE层的氧化应激可能会创建一个微环境，该微环境富含激活表面，但补体抑制蛋白相对较少。

此外，我们的结果表明，除因子H外，补体抑制剂的缺陷也可能参与AMD。DAF和CD59的多态性尚未被报道为该疾病的危险因素，但我们的数据表明，表面DAF或CD59功能缺陷会加剧RPE表面的补体介导炎症。然而，RPE细胞表达多种抑制蛋白似乎确实提供了一些冗余。要详细了解这种补体抑制系统在AMD发展过程中是如何逐渐被淹没的，需要对疾病不同阶段的动物模型和人体组织进行进一步研究。这些研究应该有助于确认我们确定的机制是否在疾病发展过程中与完整的眼睛有关。

其他已发表的具有相同细胞类型的研究表明，化学诱导的氧化应激本身会导致ARPE-19细胞单层在顶部和底部分别将VEGF的释放增加约8倍和6倍(26). 然而，由于这些实验包括1%的胎牛血清，除了上述作者提出的涉及低氧诱导因子-1信号传导的机制外t吨-在他们的方案中使用的丁基过氧化氢可能会导致补体激活。反过来，补体激活片段可能介导了细胞分泌VEGF。在我们的实验中，H诱导的氧化应激2哦2其本身足以导致C3沉积在细胞上，但并没有持续增加VEGF的分泌。另一方面，氧化应激加上暴露于补体充足的血清，使基础和顶端VEGF分泌分别增加约50倍和100倍。4小时后，发现VEGF的峰值浓度为～500 pg/ml，我们已经证明其与EC相对应50对这些细胞应用VEGF后TER降低(20). 血清中的产物（补体蛋白除外）不太可能提供细胞在所述条件下分泌VEGF所需的信号，因为VEGF的分泌可以通过选择性途径抑制完全阻止。VEGF分泌本身以自分泌的方式介导细胞进一步产生VEGF。之前已经观察到VEGF-189有类似的自分泌作用，可以持续释放VEGF(32).

我们的数据进一步支持了补体激活诱导VEGF产生的观点，并且补体抑制可以防止脉络膜新生血管中VEGF介导的损伤。目前正在开发几种治疗性补体抑制剂用于临床。此外，补体调节蛋白表达减少可能是RPE对各种机械、化学和感染应激的一般反应。因此，类似的事件可能发生在许多类型的视网膜损伤中，补体抑制可能是AMD以外的视网膜疾病的有效治疗选择。

培养模型因其简单而具有吸引力，但由于缺乏组织复杂性而受到限制。我们的实验表明，与基础暴露相比，RPE单层的顶部暴露于氧化应激和血清对RPE屏障功能的损害更为有效。然而，将血清应用于细胞会使其暴露于整个补体系统。体内，大分子量补体蛋白从循环向RPE层的传递可能不均匀，或者一些补体成分可能由RPE或视网膜产生(33). 类似地，氧化应激RPE细胞的补体介导损伤可能只有在其他损伤允许大补体蛋白进入顶端RPE的限制环境后才会发生。因此，迄今为止，尚不清楚AMD发病机制需要哪些补体成分，或者这些成分是系统性衍生的还是局部产生的。组织学实验没有提供深入的信息，因为可以发现补体蛋白在血肿RPE的基底侧积聚(1)或外段层的顶端(立方英尺/小时−/−鼠标(9)). 最后，虽然我们的实验没有解决AMD患者可能经历的慢性氧化应激和补体激活问题，但我们仔细选择了亚细胞、非细胞毒性水平的刺激。事实上，在初步研究中，我们已经表明，每天用这种低水平氧化应激和补体激活处理ARPE-19细胞单层并不会在2周的时间内诱导细胞死亡，而是永久性降低了TER，可以说是慢性应激的良好模型。7

总之，越来越多的证据表明，补体替代途径的非受控激活有助于AMD的发展和进展。我们的发现提供了一种机制，即RPE细胞的氧化应激通过表型改变它们，从而降低其对补体系统的调节。一旦激活，补体系统会产生几个具有生物活性的片段，并诱导RPE细胞分泌VEGF，这是AMD发病机制中涉及的另一种分子。这些发现提供了眼睛中发生的无菌损伤与致病性免疫反应之间的联系。我们的研究结果也支持最近的研究结果，即补体激活是AMD发展过程中的一个近期事件，发生在病理性VEGF生成的上游。因此，治疗性补体抑制剂可以防止多种致病因子的形成，并减缓AMD的进展。

*这项工作得到了国立卫生研究院DK077661和DK076690（发给J.M.T.）、DK035081（发给M.K.P.）、EY13520和EY017465（发给B.R.）以及HL082485（发给S.T.）的全部或部分支持。这项工作还得到了Vision Core Grant EY014793、基金会抗击失明基金会、美国心脏协会拨款0735101N（给V.P.F.）以及纽约南卡罗来纳医科大学预防失明研究公司的无限制拨款的支持。

7K.Kunchithapautham和B.Rohrer，未发表的结果。

6使用的缩写如下：

AMD公司
年龄相关性黄斑变性
零售物价指数
视网膜色素上皮
TER公司
经上皮阻力
DAF公司
衰变加速因子
血管内皮生长因子
血管表皮生长因子
MCP公司
膜辅因子蛋白
雨衣
膜攻击复合物
隧道
TdT介导的dUTP镍标记
FACS公司
荧光激活细胞分选机
英国国家医疗服务体系
正常人血清
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
BisTris公司
2-[双（2-羟乙基）氨基]-2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇
相对湿度
重组因子H。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会