美国国家科学院院刊。2009年7月28日；106(30): 12283–12288.
甲型流感病毒A/M2质子选择性离子通道功能核心的鉴定
,a、，1 ,b、，1 ,一 ,b、，2 ,c（c） ,b条 ,d日 ,b条 ,c（c） ,日期：，e（电子） ,b、，三和a、，三
亚历克谢·波里什丘克
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
Yuki Ohigashi先生
以下部门一神经生物学和生理学
阿曼达·L·斯托弗
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
阿恩·舍恩
c（c）马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物系，邮编：21218-2685
艾玛·马加文
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
詹姆斯·李尔
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
埃内斯托·弗雷尔
c（c）马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物系，邮编：21218-2685
罗伯特·兰姆
d日生物化学、分子生物学和细胞生物学，以及
e（电子）霍华德·休斯医学院，西北大学，伊万斯顿，IL 60208-3500；
威廉·德格拉多
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
以下部门一神经生物学和生理学
d日生物化学、分子生物学和细胞生物学，以及
e（电子）霍华德·休斯医学院，西北大学，伊万斯顿，IL 60208-3500；
b条宾夕法尼亚大学生物化学和生物物理系，费城，PA 19104-6059；和
c（c）马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物系，邮编：21218-2685
William F.DeGrado供稿，2009年5月26日
.作者贡献：C.M.、A.L.P.、Y.O.、A.L.S.、A.S.、J.D.L.、E.F.、R.A.L.、W.F.D.和L.H.P.设计的研究；C.M.、A.L.P.、Y.O.、A.L.S.、A.S.和E.M.进行研究；X.J.贡献了新试剂/分析工具；C.M.、A.L.P.、Y.O.、A.L.S.、A.S.、E.M.、J.D.L.、E.F.、R.A.L.、W.F.D.和L.H.P.分析数据；C.M.、A.L.P.、R.A.L.、W.F.D.和L.H.P.撰写了这篇论文。
1C.M.和A.L.P.对这项工作做出了同等贡献。
2现住址：瑞士苏黎世8093号Eidgenössiche Technische Hochschule Hönggerberg有机化学实验室。
甲型流感病毒M2蛋白（A/M2）是一种四聚体、III型完整跨膜（TM）蛋白，通过介导内腔包埋病毒的酸化和脱膜，在病毒复制中发挥重要作用(1). A/M2有一个单一的TM结构域，形成一个4螺旋束，作为pH-激活的质子通道，具有非常低的电导，这是典型的转运体(1). A/M2是金刚烷胺和金刚乙胺药物的靶点，需要改进药物来治疗金刚乙烷耐药病毒株(1). 此外，A/M2是已知最小的真正离子通道或转运蛋白之一(2)它的小尺寸应该有助于分析序列、结构、动力学和功能之间的关系。它的通道/运输功能需要一簇对质子具有异常强亲和力的His残基（His-37），允许储存高达3H+(三)在其TM核心深处的亚纳米级腔体中。因此，已经在具有不同生物复杂度的模型中对其进行了研究。一些问题，例如药理学相关药物结合位点的位置，已经非常关键，以至于有必要构建活的感染性病毒(4). 然而，其他生物物理研究已经在人工双层或胶束中使用较短的片段进行(5–13). 因此，重要的是要确定重组片段忠实再现天然蛋白质的质子转运和药理抑制的程度。
A/M2是一种多功能蛋白质，由以下组成：(我)一个重要的外结构域（残基1-24），可并入正在萌芽的病毒颗粒中(14); (ii（ii）)成孔TM螺旋（残基25-43）；(三)两亲性C末端螺旋（残基47–60）(15); 和(iv（四）)胞质尾部（残基61-97），通过与M1蛋白结合促进病毒组装(16,17). C端螺旋的功能未知；它包含一个保守的棕榈酰化位点，对通道功能来说不是必需的(18)这表明该螺旋可能在膜定位或组装中发挥作用。在胶束中(6)C-末端螺旋结合成一个短螺旋束，延伸到TM四聚体的细胞质末端之外，而在双层中，螺旋延伸远离TM区域，与膜表面横向相互作用(19).
此前，Tobler等人(20)结果表明，随着质子电导活性的保留，A/M2的C末端38残基可以被删除，但较短的片段在卵母细胞中的表面表达较差。因此，对较小片段的研究侧重于合成肽，尤其是“M2TM”（残基22-46）。该片段已被证明组装成四聚体，结合金刚烷胺(21). 然而，关于它的通道和质子输运活动知之甚少，Miller(22)指出了在囊泡和平面双层中测量的电导大小之间的差异。
在这里，我们探讨了A/M2和截断结构的质子传输函数爪蟾卵母细胞和合成肽在磷脂囊泡中重组，这两个系统之间具有良好的一致性。此外，为了探讨C-末端两亲螺旋的作用，在全长蛋白中，其5个保守的疏水残基被转化为丙氨酸。最后，我们研究了质子和药物在胶束和双层中与A/M2和A/M2（22-46）的结合。
结果
M2（21-61）显示强劲的向内电流。
构建了一系列A/M2截断突变体()并以表示非洲爪蟾卵母细胞。在pH 5.5的溶液中浸泡卵母细胞，测量金刚烷胺敏感性内向电流(23,24). 我们发现全长（WT）A/M2、M2（1-71），M2（21-71）和M2（21-61）的向内质子电流非常相似，这表明大部分外结构域和C末端尾部不需要进行活动(). 100μM金刚烷胺几乎完全抑制了截断突变体（≈95%）。金刚烷胺抑制M2（700 M）的二级速率常数−1·秒−1) (25)比扩散控制过程的预期慢了许多数量级，表明扩散到结合位点的能量障碍很大。截短突变体的抑制率虽然比WT慢约2倍，但也非常缓慢，并且在不同金刚烷胺敏感性病毒株M2的变异范围内(25). 如前所述，用于WT A/M2(23,24)金刚烷胺对突变体的抑制作用在2min内不可逆。
A/M2的模块化结构和A/M2变体的序列。深灰色框表示FLAG标记域，红色字母表示Ala取代，短划线表示删除的残基。
A/M2结构的pH激活和金刚烷胺敏感性爪蟾卵母细胞。显示了这些A/M2构造的代表性记录。当向内电流达到最大振幅时，将卵母细胞浸泡在含有100μM金刚烷胺的pH 5.5溶液中，以评估金刚烷胺的敏感性。
为了进一步探讨C末端螺旋（残基47–60）的作用，我们检测了a/M2（21-51）的结构编码，删除了大部分螺旋。尽管注射了该mRNA的卵母细胞没有显示出明显的膜电流，但似乎这样一个短片段可能不会表达或到达细胞表面。因此，在另一种方法中，我们将疏水残基（F47、F48、I51、Y52和F55）突变为Ala 5，这些疏水残基在C末端螺旋形成4螺旋束时被埋藏(6)或与膜相关(19). 这种结构显示出与WT A/M2几乎相同的向内质子通量()表明链间(6)或螺旋膜(19)观察到的C-末端螺旋的相互作用不影响质子传输。相反，该区域可能在控制细胞/病毒膜中a/M2的适当插入和拷贝数方面发挥作用。
A/M2（21-61）-FLAG和A/M2。
为了比较不同的构造和实验，重要的是要将特定卵母细胞的全细胞宏观电导正常化为a/M2表面表达量(23,24). 为了便于免疫检测，添加了C端FLAG标签。这种修饰还有一个额外的好处，就是增加了非常短的21-51结构体的长度，可能会增强其表达。利用表达FLAG标记构建物的卵母细胞和哺乳动物细胞的免疫荧光，无论是否含有膜渗透剂皂苷，我们发现A/M2-FLAG、M2（21-61）-FLAG和M2（21-51）-FRAG蛋白被表达并适当地插入细胞质膜中，C末端朝向细胞内部(图S1). 正如预期的那样，最短的构造在较低的级别上表示。
如所示A类表达表位标记M2（21-61）-FLAG和全长A/M2-FLAG的卵母细胞显示出与未标记蛋白类似的对金刚烷胺敏感、pH-激活的内向电流。有趣的是，M2（21-51）-FLAG也显示出对金刚烷胺敏感的向内质子电流(A类)这表明，在未标记版本中未能观察到电流与表面表达不良有关。对于每个标记的构建体，绘制了一系列单个卵母细胞的全细胞质子通量，作为在同一单个细胞中测量的表面表达的函数( B–D类). 质子通量与表面蛋白表达呈线性变化，直线斜率反映了给定a/M2变异体的相对比活性(23)关于全长。M2（21-61）-FLAG的计算相对比活度与A/M2-FLAG相同( B类和C类)在实验误差范围内(P（P）= 0.17). 尽管M2（21-51）-FLAG的表达水平太低，无法确定活性差异是否显著，但计算出的M2（21-51）-VLAG的相对比活性约为全长A/M2的50%。
M2（21-51）-FLAG、M2（21-61）-FRAG和全长A/M2-FLAG蛋白的相对比活性。(A类)卵母细胞中表达的M2（21-51）-FLAG、M2（21-61）-FRAG和全长A/M2-FLAG蛋白的代表性记录痕迹。(B类)A/M2-FLAG的相对比活性；根据每个细胞的免疫荧光信号绘制电流。回归线的斜率提供了相对比活度。(C类和D类)M2（21-61）-FLAG的相对比活度(C类)和M2（21-51）-标记(D类).
还测量了突变体的反向电压，该反向电压提供了离子选择性的测量。M2（21-61）-FLAG的电流-电压关系与A/M2-FLAG基本相同。虽然M2（21-51）-FLAG表达减少导致全细胞电导降低，但推测I–V型M2（21-51）的曲线-FLAG截取的电压轴接近A/M2和M2（21-61）的截取点(图S2). 这些结果表明，截短的M2结构与全长蛋白具有相似的离子选择性。
囊泡中的质子通量。
为了更好地表征较短片段，我们使用大的单层囊泡评估了分析中的质子通量(26). 通过稀释含有K的囊泡产生电化学电位+缓冲液进入Na+钾选择性载体安定霉素存在下的缓冲液(26). 如果双层中存在质子通道，质子将沿着感应电场扩散，使囊泡内部酸化。以这种方式测量质子通量（而不是简单地改变脂质体外部缓冲液的pH值和测量内部酸化）的优点是它需要离子选择性。如果通道对质子没有选择性，或者脂质体是非选择性泄漏的，那么Na+，其浓度远大于H的浓度+，将扩散到囊泡中+扩散出去，没有发生酸化。
对许多重建方法进行了评估，以发现允许重建A/M2和不同长度片段的单一方法。最终，我们发现多肽或蛋白质与极性脂质的摩尔过量为1000到2000倍（参见材料和方法和SI文本)为整套M2蛋白类似物提供了令人满意的结果。结果显示于表示3次独立测量的平均值，在不同样品制备之间的重复性在20%以内。
synM2（22-46）(A类)，合成代谢产物M2（19-62）(B类)和A/M2(C类)质子通量由蛋白质脂质体测定法测定，在两种pH下均具有电势（≈-120 mV）外面的和pH值在里面第7.40页。在混合延迟3秒后，将脂质体稀释到分析缓冲液中，绘制每四聚体输送的累积质子与时间的关系图(看见SI文本). 无蛋白对照脂质体的背景通量最小。所有结构均被99μM金刚烷胺抑制。用金刚烷胺滴定synM2（22-46）(A插图)显示了未受抑制的初始速率（F）与金刚烷胺浓度负对数（M）的比值。
A/M2的质子通量速率(C类)为4.8秒−1每四聚体，与≈7.5 H的值一致+之前在几乎相同的条件下测量的每秒(26)在类似系统中性pH下观察到的速率的数量级内(27). 此外，如前所述，质子对K的选择性+或Na+至少10岁6-折叠（参见SI文本). 电导速率和高质子选择性也与在此pH值下的电生理测量结果相匹配(28). 合成片段synM2（19-62）、synM22（22-50）和synM2（22-46）（2.3、7.6和6.1秒）的质子转运速率也非常相似−1每四聚体），所有这些都在全长蛋白质测量值≈2的因子内(和第3章). 通常，以这种方式重组的蛋白质是随机定向的N在里面C类外面的和N外面的C类在里面然而，由于取向可能存在偏差，尚不确定速率的2倍差异是否反映取向偏好的差异或电导率的真正差异。
100μM金刚烷胺将A/M2和合成肽的质子通量抑制到接近背景水平(和图S3). 我们检查了最短结构synM2（22-46）的全剂量反应行为(A类). 在5μM金刚烷胺附近显示出半最大效应(A插图)，在卵母细胞A/M2范围内(4,25)100μM金刚烷胺接近完成（≈80–90%）。
四聚反应的pH依赖性。
磷脂双层中synM2（22-46）的NMR表明，四聚体中的pH-sensing His-37残基对pK有高度扰动一值（pK一[1] 通过pK一[4]); 前2、8.2和8.2高于单体（≈6.5）(三,21)，pK一[3] 与单体相似，pK一[4] 远低于单体(三). 因此，相对于单体，四聚体对结合前2个质子的亲和力要大得多，对第三个质子的吸附力大致相同，而对第四个质子的粘附力要低得多。由于质子结合和四聚体是热力学联系在一起的，因此，当四聚体从二溴化到三溴化（接近pH 6–7）时，四聚体的热力学稳定性应达到峰值，并且当pH值升高或降低超过该值时，四聚体应失稳。虽然2–3个紧密放置在膜蛋白中的His残基的质子化应该稳定蛋白质，这似乎违反直觉，但这种现象是配体（质子）结合与其热力学稳定性之间的热力学耦合的结果。此前，已有文献证明四聚体M2（22-46）在低pH值下的失稳(21). 在这里，我们证明了稳定性在pH 6.5附近达到最大值，并且在pH较高时会下降。
如前所述，通过分析超速离心（AUC）测定synM2（22-46）和A/M2的pH值6和9之间的稳定性(29). synM2（22-46）是在十二烷基磷脂酰胆碱（DPC）胶束中研究的，选择该胶束是为了与以前的研究进行比较(29). 然而，全长A/M2在DPC中显示出少量的高阶聚集(15)通过将洗涤剂改为C14-磺基甜菜碱（其较低的临界胶束浓度允许在较大的蛋白质/洗涤剂比率范围内进行测量），这一问题得到了缓解。M2在胶束中的结合程度取决于蛋白质/洗涤剂比率，因此四聚体-单体离解常数(K（K）应用程序)以MR为单位表示三（MR是肽与洗涤剂的摩尔比）。
pK图应用程序TM肽和全长蛋白质的pH值对比证实，四聚体强度在pH值6.5附近达到最大值，并随着pH值的增加而降低(). 曲线在A类对于synM2（22-46），它是使用pK的文献值生成的一单体和四聚体的s(三,21)最令人鼓舞的是，它们没有被视为可调参数。收集了更广泛的A/M2数据集；使用pK可以再次拟合滴定曲线一四聚体合成物M2的报告值（22-46）。这一发现证实了His-37的功能相关质子化行为在一系列片段长度和环境（包括胶束和双层）中是恒定的。向合成物M2（22-46）和A/M2中添加金刚烷胺将平衡转移到四聚体，pK的增加证明了这一点应用程序(). 与之前的调查结果一致(25)，金刚烷胺对四聚体的亲和力，反映在pK值之间的差异应用程序有无金刚烷胺(21)，随着pH值的降低而降低，表明药物结合强度随着His-37上质子数量的增加而降低。
热力学稳定性的pH依赖性（pK应用程序)synM2（22-46）的(A类)（DPC中60–100μM肽，1:150–1:250单体/洗涤剂）和A/M2(B类)（C14-磺基甜菜碱中的50μM蛋白质，1:150单体/洗涤剂），在没有（●，■）和存在（▲）金刚烷胺的情况下（根据洗涤剂条件，超过蛋白质四聚体的3到10倍）。中的曲线A类通过使用pK的文献值生成一s表示单体(21)和四聚体(三)，以及pK的值应用程序以限制高pH值作为唯一的拟合变量。pK一对于全长A/M2单体形式的His-37质子化尚未确定，因此该变量被视为B类.pK的计算值一单体中的His-37为6.2，接近胶束中synM2（22-46）的6.8(21).
尽管synM2（22-46）和A/M2的pH-依赖性组装趋势相似，但在所研究的每个pH值下，全长蛋白质的热力学稳定性更强。部分差异来自C14-磺基甜菜碱中A/M2的重组，这有助于形成约一个数量级的四聚体（相对于用于TM肽的洗涤剂DPC）。在DPC中K（K）应用程序A/M2的pH值为7.5时，synM2（22-46）为10−10先生三与≈10−6.3先生三分别是。这些值表明A/M2和synM2（22-46）在肽/DPC比率≈1/1700（中点=（2·K（K）应用程序)1/3)因此，根据这一测量，A/M2的稳定性约为synM2（22-46）的10-20倍，相当于约1.6 kcal/mol的单体。
金刚烷胺到合成物M2的等温量热和光谱滴定（22-46）。
光谱滴定表明A/M2结合金刚烷衍生物的化学计量比为每四聚体1种药物(30). 因此，我们使用CD测定法检测了金刚烷胺和金刚烷胺与synM2（22-46）结合的化学计量(21)在223 nm和209 nm（θ223/θ209) (21). 虽然与这些光谱位移相关的精确结构变化不容易解释[酰胺和色氨酸吲哚(31)两者在该区域都有很强的跃迁]，此比率为监视绑定提供了一个方便的参数。在pH值接近7.5且肽/洗涤剂比≈1:50（≈40μM总肽浓度）时，其中synM2（22-46）主要是四聚体，添加金刚乙胺会导致椭圆率线性变化(A类)，在10μM处出现断裂，对应于每四聚体1种药物的预期比率，而不是在之前的核磁共振研究中发现的每四聚物4种药物的化学计量比，其中药物超过四聚体200倍（40 mM药物浓度）(6). 在药物浓度高得多的情况下，可能会观察到额外的跃迁，但当金刚乙胺浓度增加>1mM时，光吸收和溶解度无法测量；鉴于药物对蛋白质的高亲和力，似乎没有理由检查药物以mM浓度存在的条件。用金刚烷胺进行相应的滴定，金刚烷烷胺是体内蛋白质的一种较弱的抑制剂，导致了一个具有较大曲率的等温线，这与已知的四聚体亲和力较低一致(A类) (30). 作为对照，我们还检测了药物与金刚烷胺抗性突变体synM2（22-46）S31N的结合，该突变体在该浓度范围内表现出弱结合(A类).
金刚烷胺到合成物M2的光谱和等温量热滴定（22-46）。(A类)用金刚烷胺和金刚乙胺对DPC胶束中的synM2（22-46）在pH 7.4和pH 8下进行CD滴定。肽单体浓度≈40μM；肽/DPC比率为1:40–1:50。平均剩余椭圆度之比（θ223/θ209)图中所示为WT syn（22-46）肽（闭合符号）和耐药synM2（22-4六）S31N（开放符号）的金刚烷胺（圆圈）或金刚乙胺（方块）浓度。synM2（22-46）的金刚乙胺数据曲线显示了M2紧密结合抑制剂的预期滴定（即，在总四聚体浓度远大于药物结合的离解常数的条件下）。箭头显示了每四聚体1种药物与每四聚物4种药物的化学计量比的中断位置。(B类)用金刚烷胺对POPC/POPG双层（1:100肽/脂质，pH 7.4）中的synM2（22-46）进行ITC滴定，并将同一药物滴定到不含肽的脂质双层中。CD和ITC滴定的缓冲条件见材料和方法.
为了证实这种相互作用，我们使用等温量热法检查了金刚烷胺与synM2（22-46）的结合。为了提供更天然的环境，在由1:2 1-棕榈酰-2-油酰基组成的磷脂囊泡中重组肽-锡-甘油-3-磷酸-（1′-rac-甘油）（POPG）/1-棕榈酰-2-油酰基-锡-3-甘油磷酸胆碱（POPC）。将金刚烷胺微量热滴定为含有合成M2（22-46）的囊泡与对照囊泡的比较(B类)表明药物以焓有利的过程（ΔH（H）=−10千卡/摩尔；K（K）diss公司=2.3μM）。将药物滴定到缺乏肽的囊泡中只显示出很小的热量，这与药物的稀释和与双层的结合有关(B类).
讨论
A/M2是一种模块化蛋白质，具有不同的区域，有助于膜靶向、包装、核衣壳结合和质子运输。在这里，我们表明A/M2蛋白的质子移位功能被封装在一个非常小的功能核心中。外结构域的残基1–20和C末端尾部的残基62–97虽然对其中一些功能很重要，但可以通过完全保留质子运输活性来去除。C末端螺旋的截短降低了表面表达，但FLAG标记的21-51片段在校正表达水平后，其特异性活性约为全长蛋白的2倍。我们还通过在该区域构建一个含有5个突变的变异体，证实了C末端螺旋对A/M2的质子转运/通道活性是非必需的。
这些发现通过使用脂质体重新合成的合成A/M2肽（简称synM2（22–46））得到进一步证实，所有这些肽的质子传导速率均为全长A/M2活性的2倍，并被金刚烷胺抑制。为了获得可靠的结果，特别重要的是：(我)确保油脂没有氧化产物；(ii（ii）)严格测定重组后最终产品中蛋白质的最终浓度，而不是依赖输入的化学计量；和(三)通过光散射和电子显微镜证实获得了均匀的囊泡布居。因为我们没有确定天然N中定向蛋白质的比例外面的C类在里面方向，囊泡通量的结果应被认为是半定量的，只有在它们与用卵母细胞和哺乳动物细胞中表达的蛋白质获得的电生理实验相一致时才有意义(1). 此外，在胶束中，当药物在生理相关浓度范围内滴定时，A/M2和synM2（22-46）也保留了与每四聚体1个高亲和力结合位点结合药物的能力。虽然核磁共振研究表明，当药物浓度在4到40 mM（四聚体的20到200倍过量）之间时，可以观察到其他位点，但我们认为该位点是药理相关的相互作用位点(6). 胶束中的A/M2和synM2（22-46）也显示出强烈扰动的pK一在双层中观察到的His-37的s(三)，证明了在一系列构造和解条件下函数重要属性的守恒性。此外可用于评估在给定pH值下肽主要为四聚体的肽/洗涤剂比率范围；此外，因为A/M2在双层中比在胶束中更稳定(32)这些测量对囊泡和多双层环境中的稳定性设定了较低的限制。
值得注意的是，25残基肽能够组装成配体激活的质子转运蛋白。现在，通过使用这个小功能核心，可以在胶束和双层系统中进行生物物理研究。然而，考虑到伪影的可能性，特别是在质子通量测量中，必须注意确保结果与电生理和药理学研究相关，而不是依赖生物物理测量作为主要标准。此外，与双层相比，胶束对synM2（22-46）诱导了更大的构象延展性(24). 因此，尽管对胶束中M2片段的高分辨率核磁共振和晶体结构研究提供了对这种多信息蛋白质的迫切需要的洞察力，但只有在其他生物物理、生物化学、电生理、，以及蛋白质的细胞生物学特性。
材料和方法
SI文本提供了质粒生成、A/M2表达、免疫荧光、脂质体质子通量、AUC和CD的详细材料和程序。
卵母细胞膜电流和反向电压的测量。
按照说明测量膜电流和反向电压(23). 为了最大限度地减少细胞内酸化，在pH 5.5下，当稳定内向电流的振幅达到最大时，进行膜电压斜坡测量。在pH值为8.5时也进行了膜电压斜坡测量。电压斜坡范围为110毫伏，从−50到60毫伏。卵母细胞膜不能承受极性到非常正的电压（>60毫伏），因为它们要么会泄漏，要么会产生较大的内源性电流；因此，对于许多卵母细胞来说，可以施加不足的正电压来实现电流的反转。将pH值为5.5的电流减去pH值为8.5的背景电流后，绘制电流-电压关系图。
活卵母细胞的免疫荧光和相对特异性活性的测定。
免疫荧光与之前的工作类似(23). 为了检查蛋白质的取向，在存在和不存在0.1%皂苷的情况下测量荧光。为了测定比活性，至少测量了5个表达FLAG标记全长A/M2蛋白的卵母细胞和3个未注射的卵母公司。对于每一个未注射的细胞和每一个表达给定截短突变蛋白的细胞，绘制pH 5.5下的电流与该细胞的卵母细胞表面免疫荧光的关系图，通过使用PTI Imagemaster微荧光计进行量化，并将直线拟合到图上。
脂质体通量测定。
蒸发蛋白质（25 nmol）与25μmol 4:1:2 POPC/POPG/胆固醇的乙醇混合物，并用995μL K缓冲液（100 mM K2SO公司4，15毫微米Kx个人事军官4pH≈7.5）。添加pH指示染料8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS）（吡喃），在pH 7.40的K缓冲液中通过冻融、挤压（100nm孔）和透析形成脂质体。荧光质子通量测定在18°C的缓冲液中进行，缓冲液相当于K缓冲液，Na除外+作为反离子（钠缓冲液），在膜不渗透的吡喃猝灭剂存在下[第页-二甲苯-双吡啶溴化物（DPX）]和安定霉素。脂质体（预先与所需浓度的抑制剂孵育过夜）迅速稀释到分析缓冲液中，并测量染料质子化的动力学(看见SI文本). HPTS pH校准曲线如图所示。S4系列.
资产负债表。
将synM2（22-46）肽（≈60–100μM）和全长A/M2（≈50μM）溶解在含有洗涤剂的缓冲液中（对于synM2（22-4六）：15 mM十二烷基磷酸胆碱，1:150–1:250单体/洗涤剂；对于A/M2，7.5 mM C14-磺基甜菜碱，1:150单体/洗涤剂），添加氧化氘以匹配洗涤剂的密度(29)，缓冲液pH值范围≈6–9(SI文本). 当样品在15000到40000 rpm的3到4个速度下达到平衡时，收集250到320 nm的吸光度扫描数据，并且单体-四聚体平衡是全局拟合的（参见SI文本)径向吸收曲线。
等温滴定量热法（ITC）。
在pH 7.4的2:1 POPC/POPG小单层囊泡中，通过蒸发肽/脂质有机储备、水合残留膜和超声处理，以1:100的单体/脂质比例重建synM2（22-46）。将分析缓冲液中的配体溶液在25°C下滴定到量热计中。每次注入时产生的热量由热量信号的积分获得。通过从反应热中减去稀释热，得出配体与synM2（22-46）结合的热量。
圆形二色性。
CD滴定法(21)DPC胶束中的肽在Jasco J-810分光光度计中的1 mm路径长度试管中进行，25°C，1 nm步进扫描（4s采集；6次累积）。计算椭圆率（θ223/θ209)平均223±2和209±2nm处的椭圆度以提高信噪比。synM2（22-46）和S31N变体的缓冲液分别为10 mM磷酸盐，pH 7.4和50 mM Tris，pH 8.0。
