人类肺癌代谢途径调控的改变¹³碳稳定同位素再溶代谢组学（SIRM）

代谢物&¹³肺组织提取物的核磁共振碳同位素谱

代谢物及其分配示例¹³TCA提取物中的C-同位素¹H TOCSY和高分辨率1-D核磁共振谱如图所示​图2。2通过将单个共振的化学位移、自旋-自旋耦合模式和可用的共价连接性（在TOCSY轮廓图中用实心红色矩形描绘）与标准化合物的化学位移、自旋-自旋耦合模式和可用的共价连接性相匹配来进行分配[20,21]. 在所有肺组织提取物中常见的代谢产物包括异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）、乳酸、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、氧化谷胱甘肽（GSSG）、谷氨酰胺（Gln）、琥珀酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸（Asp）、肌酸（Cr）、磷酸胆碱（P-胆碱）、牛磺酸、甘氨酸（Gly）、，苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、肌醇、α-和β-葡萄糖、NAD⁺、胞嘧啶核苷酸（CXP）、尿嘧啶核苷酸（UXP）、鸟嘌呤核苷酸（GXP）和腺嘌呤核酸（AXP）。这个¹代谢物的H TOCSY赋值由2-D补充¹H（H）-¹³C同一提取物的HSQC分析，如图所示​图3，三，其中¹H（H）-¹³观察到C共价键模式。HSQC光谱为一些代谢物（如Glu、Gln和GSSG）提供了更好的分辨率（图​（图3C，3C公司，插图），从而确认其分配。

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图3

¹H（H）-¹³C 2-D HSQC识别¹³6号患者肺部肿瘤组织TCA提取物中的C代谢物。根据¹H（H）-¹³在二维等高线图（面板B）和TOCSY光谱中观察到的C共价键，如图2B所示。面板A是沿¹³C维，可以更好地比较不同代谢物的峰值强度。面板C显示了Glu、Gln和GSSG-Glu的C3和C4共振的扩展光谱区域，以说明2-D HSQC等高线图中这些共振的分辨率。

除了代谢物鉴定外，还提供了TOCSY和HSQC分析¹³肺TCA提取物中几种代谢物的C位置同位素信息。这个¹H TOCSY数据（参见图。​图2B）2B型)毫不含糊地揭示了¹³C标记的乳酸（[U-¹³C] -乳酸）和丙氨酸（[U-¹³C] -Ala）由¹³C卫星交叉峰模式（模式1-4)乳酸（乳酸-H3和H2）和丙氨酸（丙氨酸-H3和H2）的3-甲基和2-甲基质子（图中用绿色虚线矩形标记​图2B）2B型) [20]. 这种模式与多重标记乳酸和丙氨酸的富集相一致，其富集程度是天然丰度的200-300倍。以下人员的在场¹³C-3-Glu，¹³C-3-Gln，和¹³氧化谷胱甘肽（Glu-GSSG）的C-3-谷氨酰残基由¹³C卫星交叉峰模式9、10、14()和11-13()（图中用绿色虚线描绘。​图2B）。2B型). 模式5–8和15表示存在¹³C-2-Glu-GSSG和¹³C-2-Glu，而模式16和17表示存在¹³C-2-附录。

这个¹³HSQC分析证实了从TOCSY分析中获得的C位置同位素信息，包括¹³C-3-Ala，¹³C-3-乳酸，¹³C-3-Glu，¹³C-3-Gln公司¹³C-3-Glu-GSSG，¹³C-2-Glu-GSSG，¹³C-2-Glu和¹³C-2-Asp（分别参照图。​图3B3B公司和​和4B）。4B类). 此外，HSQC数据还提供了有关同位素的补充信息¹³C卫星交叉峰太弱，无法观察到，或被TOCSY光谱密集区域的其他交叉峰掩盖[参见附加文件中的文本和图S11]. 其中包括选择性¹³C-3-Asp、C-2,3-琥珀酸、C-2,4-柠檬酸、C-1'-核糖-5'AXP和C-1-α-和-β-葡萄糖中的C富集（分别参照Asp-C3、琥珀酸-C2,3、柠檬酸-C2,4、5'AXP-C1'和α-和β-Glc-C1，图。​图3B3B公司和​和4B4B类).

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图4

#6患者配对非癌和癌肺组织TCA提取物中代谢产物谱的比较.1-D中的代谢物¹H NMR（面板A）和¹³C HSQC投影光谱（面板B）分别如图2和图3所示。将这两组光谱归一化为干重和光谱参数，从而可以直接比较单个共振的峰值强度。虚线追踪癌性和非癌性肺组织中大量不同的代谢物。

基于图中的代谢物分配。​图22和​和3，三，1-D¹核磁共振氢谱和¹³C HSQC投影光谱允许比较代谢物和¹³配对非癌和癌肺组织TCA提取物中的C同位素谱。如图所示​图44对于6号患者。如图所示。​图4A4A级大多数代谢物（葡萄糖除外）在癌组织中的含量高于非癌肺组织。这些还包括¹³C-标记的同种异构体，[U-¹³C] -乳酸和[U-¹³C] -丙氨酸（分别用乳酸表示_坐和Ala_坐图中的共振。​图4A）。4A级). 范围¹³从各自的2-D定量乳酸、丙氨酸（作为统一标记的物种）和谷氨酸（在C-2位置）中的C富集¹H TOCSY交叉峰模式（参见图​图2B），2B型)，如前所述[18]. 如表所示，在同一患者的癌症组织中，它们始终高于非癌症组织​表2。2.范围¹³C在葡萄糖中的富集（如[U-¹³C] 非癌组织的-Glc）由1-D测定¹H光谱（参见图。​图4A），4A级)，这在癌症中明显低于非癌症对应物（参见表​表2）。2). 此外，增加了¹³C丰度（或¹³癌症中大多数代谢物相对于非癌组织的C峰值强度）在图中的1-D HSQC投影光谱中很明显。​图4B。4B类。部分增加¹³从非癌组织到癌组织的碳丰度反映了总代谢物浓度的差异，其中包含1.1%¹³自然丰度。然而，正如附加文件中所述1，选择性富集¹³许多代谢物碳的C也有助于其¹³C峰值强度。其中包括C-3-Ala、C-2,3-乳酸、C-3-Gln+GSSG、C-2-4-Glu、C-4-Gln、C-4-GSSG，C-2,4-柠檬酸、C-2,3-Asp、C-1'、4'、5'-5'-AXP和C-1'，4'-5'-UXP。

为了量化¹³C特定碳位置代谢物的丰度，2-D HSQC光谱被用于比1-D更好的分辨率¹³C投影光谱（参见图。​图4B）。4B类). 这是为执行的¹³通过整合其HSQC交叉峰的体积，C-2,3-琥珀酸患者#16–10（参见图。​图3C）。3C公司). 亲属¹³通过将HSQC峰体积归一化为总琥珀酸盐浓度来计算这两个碳的C丰度（选择性富集的量度）。亲属¹³肿瘤组织中C-2,3-琥珀酸的C丰度（3.6±1.2）显著高于非癌组织（0.6±0.7），p值<0.01。

代谢物&¹³用GC-MS对肺组织提取物进行C同位素分析

通过GC-MS对肺部TCA提取物进行平行分析，以验证通过NMR获得的代谢物谱中的关键发现，同时提供代谢物子集及其¹³C质量同位素。表​表3三显示了选定代谢物的数量及其总量¹³气相色谱-质谱法富集碳（超过自然丰度）。此外，还显示了天冬氨酸m+3质量同位素的定量(¹³C类_三-天冬氨酸或天冬氨酰，其中三个碳标记在¹³C） ●●●●。对于6号患者，GC-MS数据显示总量过多¹³癌组织中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、柠檬酸和琥珀酸在肿瘤中的富集。提高了¹³C类_三-与配对的非癌组织相比，肿瘤中的天冬氨酸也很明显。这与核磁共振观察结果一致（参见图。​图4B）4B类)各种物质的积累¹³代谢物的C位置同位素包括[¹³C-3]-丙氨酸[¹³C-2,3]-乳酸[¹³C-2,3,4]-谷氨酸[¹³C-4]-Gln[¹³C-2,3]-天冬氨酸[¹³C-2,4]-柠檬酸和[¹³C2,3]-琥珀酸用于肿瘤，与#6的成对非癌组织相比。A类似¹³在所有5例肺肿瘤组织中观察到丙氨酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸的C富集模式，其中¹³这些代谢物中的C标记足以通过GC-MS定量。此外¹³C类_三-五名患者中有四名患者的肿瘤组织中存在天冬氨酸（表​（表3）。三). 应该注意的是¹³C类_三-肿瘤组织中的天冬氨酸（0.5～1.4%）远高于自然丰度背景值（5×10^-4%)（参见表​表3三).

的定量相关性¹³人体肺组织中的C-代谢物

利用GC-MS数据¹³如图所示，对肿瘤和非癌组织中的C标记代谢物进行了前驱物-产物关系测试​图55和表​表4。4.¹³C-琥珀酸酯，¹³C-柠檬酸盐和¹³C-Glu是Krebs循环的产物，而¹³C-Ala来源于丙酮酸，丙酮酸是糖酵解的最终产物（参见图​图66).

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图5

Krebs循环中间体和糖酵解产物之间的关系¹³6~10号患者切除的肺癌和非癌组织的C-标记和总浓度.代谢物和¹³C同位素浓度（[代谢物]）通过GC-MS分析测定，如方法所述。R²表4列出了这些曲线图的线性拟合（癌症用实线表示，非癌组织用虚线表示）。

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图6

预期¹³线粒体Krebs循环中间产物和副产物中[U的C标记模式-¹³C] -Glc作为示踪剂循环反应描述为没有（图A）或有（图B）再复丙酮酸羧化酶（PC）反应¹³所示的C位置同位素模式是一个旋回的结果。在没有丙酮酸羧化的情况下，通过前向循环反应在C4和C5位置标记Glu，而当丙酮酸羰基化活跃时，Glu在C2和C3位置标记（面板A和B）。图B描述了丙酮酸通过丙酮酸羧化作用进入Krebs循环的丙酮酸从丙氨酸中分离出来的可能性，以及戊糖磷酸途径（PPP）的非氧化分支对丙酮酸池的贡献。对称琥珀酸盐发生同位素扰动，导致¹³C标签分为四个碳，每次两个（蓝色和绿色碳）。红色或蓝色和绿色字母C代表¹³C标记的碳分别在打乱前后；蓝色丙酮酸盐表示单独的丙酮酸池；实心箭头和虚线箭头分别表示有利的单步和多步反应；面板A中的开放箭头描绘¹³C标记的OAA在未标记的原有OAA转一圈后。

浓度的线性相关性¹³C-琥珀酸酯¹³C-Ala，¹³C-Glu，或¹³C-柠檬酸盐（图。5A–C级，表​表4）4)在肺癌组织中可以识别，但在非癌肺组织中无法识别。还注意到¹³C-琥珀酸酯和¹³肺肿瘤组织的C-乳酸（表​（表4）。4). 绘制总浓度时，相关性甚至不太明显，尤其是对于非癌组织（图。5D–F级，表​表4）。4). 这一观察结果强调了收购的必要性¹³碳同位素数据，而不仅仅是稳态浓度，来推断相关途径中转化产物之间有意义的关系。此外，在图。​图5，5，非癌组织和肿瘤组织的分离是明显的，即肿瘤和非癌组织分别聚集在高浓度象限和低浓度象限中。

人肺肿瘤中PC、谷氨酰胺酶和krebs循环脱氢酶的基因表达模式

独特的¹³上述肿瘤组织中Krebs循环代谢物的C标记模式表明相关酶中基因表达可能发生改变。通过对关键线粒体脱氢酶（DH）以及肿瘤和周围非肿瘤组织的补体丙酮酸羧化酶（PC）和谷氨酰胺酶的实时PCR分析来检验这一点，如表所示​表5。5在6-10号患者中，PC基因的两种亚型的表达明显增加，平均倍数变化为3.36±1.13，即在肿瘤中显著升高（p<0.01）。相比之下，另一种重要的再生酶基因谷氨酰胺酶（GLS）在肿瘤中的表达低于周围的非癌组织，平均倍数变化为0.52±0.16。对于Krebs周期DH，与苹果酸DH（MDH）表达的适度激活相比，异柠檬酸DH和α-酮戊二酸DH显著减少，而琥珀酸脱氢酶（SDH）和富马酸水合酶（FH）在肿瘤组织中的表达无统计学意义的变化。

这些数据与最近一篇关于培养中的胶质母细胞瘤细胞的报告不同，在培养中谷氨酸水解被证明是显著的，而丙酮酸羧基化未被检测到[13]尽管母代星形胶质细胞具有较高的PC活性[12,32]. 我们在人类非小细胞肺癌患者中的发现表明，任一回补途径的激活可能取决于肿瘤细胞类型。这与我们在人类NSCLC A549细胞（a.N.Lane、T.W-M.Fan、M.M.McKinney和J.L.Tan，未发表的数据）中发现的低谷氨酰胺分解（Gln-乳酸）能力相一致，与胶质母细胞瘤细胞的发现相反。

组织加工和提取

将冷冻组织样品在液态N中粉碎成<10μm的颗粒₂使用Spex冷冻磨机（Spex CertiPrep，Inc.，Metuchen，NJ）最大限度地提高后续提取效率，同时保持生化完整性。在提取极性代谢物之前，将冷冻粉末的等分试样冷冻干燥。

如前所述，从冷冻干燥的组织粉末（4–48 mg）中提取水溶性或极性代谢物，置于10%三氯乙酸（TCA）（v/w最小40/1）中，同时留下蛋白质、核酸和多糖[43]. 提取两次以进行定量回收。将等分（150μl）血浆样品制成最终10%TCA浓度，以沉淀蛋白质并回收上清液中的极性代谢物。然后通过冷冻干燥从组织或血浆提取物中去除TCA。将干颗粒溶解在纳米纯水中，并将两个小份冻干以进行硅烷化和GC-MS分析，同时将剩余部分通过Chelex 100树脂柱（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories，Inc.）以中和和去除干扰多价阳离子以进行NMR分析。

核磁共振分析

这个¹将H参考标准DSS（2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠盐）分别添加到组织或血浆样品的TCA提取物中（30或50 nmoles）。TCA提取物的核磁共振分析在20°C下在配备有5-mm HCN反向三重共振pfg冷探针的Varian Inova 14.1 T核磁共振波谱仪（Varian，Inc.，Palo Alto，CA）上进行。为了测定代谢物和¹³C位置同位素：1-D¹H、 二维¹H目录，2-D¹H（H）-¹³C HSQC和HSQC-TOSCY[20,21].¹H和¹³TCA提取物的C化学位移参考0.00 ppm的DSS，间接参考¹H位移。根据其代谢产物¹H和¹³C化学位移，¹H耦合模式，以及¹H（H）-¹H和¹H（H）-¹³C共价键模式（分别从TOCSY和HSQC实验中获得），与我们内部标准数据库中的模式进行比较http://research.louisville.edu/metabolomics网站.

对于代谢物和¹³C同位素定量，选定¹使用MacNuts软件（Acorn NMR，Inc.，加利福尼亚州利弗莫尔）对1-D NMR光谱中的H峰进行反褶积和积分。通过DSS的峰值强度校准产生的感兴趣的峰值强度，以进行绝对定量。百分比¹³通过整合适当的¹³C卫星1-D峰值¹H或2-D TOCSY光谱，如前所述[18,20].

GC-MS分析

对核磁共振分析的相同提取物进行GC-MS分析，以量化总量和¹³C-标记的质量同位素，如前所述[22]. 简言之，冻干提取物在MTBSTFA（N-甲基-N）中衍生-[第三种-丁基二甲基硅基]三氟乙酰胺）（Regis Chemical，Morton Grove，IL）和叔丁基二甲基乙烯基衍生物在PolarisQ GC-ion捕集器MSn（德克萨斯州奥斯汀市ThermoFinnigan）上分离和定量，该捕集器配有50 m×0.15 mm内径的开口管柱，0.4μm涂层BPX-5（5%苯基/甲基当量）（德克萨斯州，奥斯汀市SGE）。通过与标准品的比较，根据其GC保留时间和质量碎片模式来鉴定代谢物。代谢物的绝对定量是通过校准样品运行中特定代谢物与标准运行中特定离子特征的响应来完成的[22]. 使用Xcalibur（加利福尼亚州圣何塞市ThermoFinnigan）或Met-IDEA软件计算相对代谢物丰度[44]提取每个组分的单个离子特征的峰面积。对于Met-IDEA，除质量精度外，数据分析中使用了离子阱质谱仪的默认程序设置米/秒设定为0.001；以及目标两侧设置的质量范围米/秒±0.6。对于Xcalibur，使用针对每个分析物定制的参数进行峰值检测、识别、背景减除和定量。通过从样品中减去天然丰度（根据标准分析经验确定）的同位素剖面，对质量同位素进行定量。对每个系列的质量同位素重复该程序，以达到¹³富碳剖面[22]. 在所有情况下，使用MTBSTFA衍生物的特征伪分子离子簇来确保真实的质量等位异构体被量化。

基因表达分析

从对一组单独的六对组织样本进行的初始基因微阵列分析中，我们发现肺癌组织与其非癌组织之间存在一些具有统计学意义的基因表达差异。这包括丙酮酸羧化酶（PC）基因在肺癌和配对非癌组织中的过度表达。由于样本限制，没有对6-10号患者进行阵列分析，因为这些患者获得了PC激活的代谢证据。

实时（RT）-PCR被用来检测6-10号患者的PC基因表达。基本上按照制造商的指示，使用RNeasy minikit（Qiagen）分离非癌组织和癌组织RNA。唯一的修改是，在RNA分离的第一步，使用Trizol试剂（invitrogen）而不是试剂盒提供的缓冲液RLT来破坏和均质粉碎的冷冻组织。改进后的程序可以提供更高的RNA产量和更好的纯度。通过1%琼脂糖凝胶电泳证实RNA的完整性。使用寡核苷酸（dT）将RNA反向转录成第一链cDNA₁₈和SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）。具体而言，将1μg RNA添加到含有2μl 500μg/ml寡核苷酸（dT）的40μl反应混合物中₁₈、2μl dNTP混合物（每个10 mM）、8μl 5×第一链缓冲液、4μl 0.1 M DTT、2μl RNaseOUT™（40单位/μl）和2μl SuperScript II逆转录酶（200单位/μl）。将反应混合物在42°C下培养50分钟，然后在70°C下加热15分钟以终止反应。

用SYBR绿色染料和Mastercycler ep Realplex 4S（Eppendorf）进行RT-PCR扩增。每次运行时，混合20μl 2.5×Real Master Mix（Qiagen）、0.3μM正向和反向引物以及2μl第一链cDNA。热循环条件包括在95℃下初始变性步骤2分钟，在95℃条件下50个循环15秒，在55℃条件下15秒，以及在72℃条件下20秒。每个反应重复进行。所有引物对的扩增效率接近2.0（即100%）。如前所述，使用Livak方法计算每个基因的相对表达水平[45]以18S核糖体RNA作为内部控制基因。使用的引物序列由Beacon Designer 5.0（Premier Biosoft International，Palo Alto，CA）设计，如表所示​表66.

丙酮酸羧化酶的蛋白质印迹

将粉碎的和冻干的肺组织在氯仿中提取两次：甲醇（2:1）+1 mM丁基羟基甲苯以去除脂质，这会干扰PC的提取。然后将脱脂的组织粉末在62.5 mM三羟甲基氯化钠+2%十二烷基硫酸钠（SDS）中提取和5 mM二硫苏糖醇，并在95°C下加热10分钟，使蛋白质变性。使用10%聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分析蛋白质提取物，并将分离的蛋白质转移到PVDF膜上（Immobilon™-P，Millipore，Bedford，MA），并在4°C下过夜用抗PC兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）进行印迹。PC在与辣根过氧化物酶（HRP）相关的二级抗兔抗体（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）中孵育，然后与化学发光HRP底物反应（超级信号^®West Dura Extended Duration衬底，Thermo Scientific）和X射线胶片曝光。使用高分辨率扫描仪对胶片进行数字化，并使用图像J（NIH，Bethesda，MD）分析适当条带的图像密度（PC为130 kDa，α-微管蛋白为50 kDa）。PC蛋白带的图像密度归一化为α-微管蛋白带的密度。