组蛋白H2a mRNA与Lin28相互作用，并含有一个依赖于Lin28的转录后调控元件

Lin28结合组蛋白H2a mRNA体内

为了探索Lin28可能调节参与细胞周期进程的特定基因的可能性，我们搜索了Lin28的mRNA靶点。使用免疫沉淀（IP）和逆转录定量实时PCR（RT-qPCR），我们确定了细胞周期蛋白A和B以及cdk4 mRNA作为Lin28的假定靶点(10). 在此，我们报道了复制依赖性组蛋白H2a mRNA作为Lin28调控的新靶点。我们最初忽略了Lin28和组蛋白mRNA之间的相互作用，因为这些mRNA不是聚腺苷化的，因此无法通过我们的IP和RT-qPCR分析检测到，其中oligo（dT）用于从逆转录反应中沉淀的RNA生成cDNA。具有讽刺意味的是，我们使用组蛋白H2a mRNA序列作为Lin28结合的阴性对照。令我们惊讶的是，这些序列在我们的在体外RNA–蛋白质相互作用分析。这些观察促使我们探索Lin28和组蛋白mRNA之间的可能联系。

因此，我们使用单克隆抗Flag抗体进行IP，从转染Flag-Lin28的ES细胞中分离RNP。从IP复合物中提取的RNA样本用于产生cDNA，然后进行qPCR以鉴定相关的mRNA。在RT反应中，使用了四个核心组蛋白（H2a、H2b、H3和H4）mRNA以及寡核苷酸（dT）的特异性引物。图2给出了多个独立实验的代表性结果。与免疫前IgG IP复合物（任意设置为1）中的mRNA数量相比，抗Flag IP复合物中的mRNAs数量如所示图2a.使用Tubulin mRNA作为非特异性RNA结合的对照。H2a mRNA在抗Flag复合物与免疫前复合物中的四种组蛋白mRNA中表现出最显著的富集（～5倍）。然而，其余（H2b、H3和H4）仅表现出边际富集（～1.5–2倍）。确认我们之前的发现(10)细胞周期蛋白A和B以及cdk4的mRNA也显著富集。值得注意的是，也可重复观察到Oct4的富集，尽管程度较小（～2倍）。Oct4 mRNA可能是Lin28调控的靶点的可能性目前正在研究中。重要的是，IP使用多克隆抗Lin28抗体模拟了这些结果(6) (图2b） ●●●●。此外，相对折叠富集并没有反映细胞提取物中mRNA的水平(图2c） ，表明观察到的相对富集并非由于提取物中存在大量特定mRNA。与细胞提取物中的H2a和H3相比，细胞提取物中H2b和H4 mRNA的水平明显较高，这可能是由于RT和PCR反应中的引物效率较高所致。这些引物的设计使得在我们的RT和PCR反应中，每个组蛋白基因亚型中至少可以检测到12个mRNA（参见“材料和方法”一节）。综上所述，H2a mRNA在含有Lin28的RNP中的优先富集表明它可能是一种体内Lin28法规的目标。

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图2。

Lin28与小鼠ES细胞中mRNA的一个特定亚群相关。(一)用Flag-Lin28转染ES细胞，并使用抗Flag分离RNP。(b条)使用抗Lin28抗体从未转染的ES细胞中分离出RNP。(c（c）)细胞提取物中gapdh mRNA水平正常化后的相对mRNA水平。

Lin28结合H2a mRNA在体外

为了询问H2a mRNA是否包含Lin28的高亲和力结合位点，我们进行了在体外紫外线交联（XL）实验。XL允许根据核酸和氨基酸在紫外线照射下的自然光反应性检测RNA和蛋白质之间的直接接触。我们的初步实验表明，像许多其他RNA-结合蛋白[即脆性X智力低下蛋白FMRP(16)]，即使在非常严格的条件下，Lin28也可以与几乎所有测试过的RNA进行非特定交联(图3c和未显示的数据）。这并不奇怪，因为据报道Lin28对let-7 microRNA前体的特异亲和力在微摩尔范围内相对较低(5). 尽管如此，我们已经能够使用类似于Schaeffer所描述的交联和竞争策略来显示Lin28和H2a mRNA编码区之间的特异性和直接的相互作用等. (16). 这类分析相当敏感，并在很大程度上减轻了非特异性结合的作用。

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图3。

XL和竞争分析。将Flag-Lin28转染至HEK293细胞并制备细胞提取物。(一)XL是使用放射性标记的H2a编码区RNA进行的，在没有（第2道）或有越来越多的未标记H4（第3-5道）、H3（第6-8道）、H2b（第9-11道）、B1U1（第12-14道）或H2a（第15-17道）RNA的情况下进行，然后是IP。用SDS-PAGE溶解总交联产物（5%）和免疫沉淀物，然后进行放射自显影。标有星号的波段为Flag-Lin28。(b条)交联Flag-Lin28的量与未标记竞争RNA的摩尔过量标绘。每个点代表三个独立的实验。数字为平均值±SD(c（c）)在未标记的B1U1（3–5道）或H2a（6–8道）RNA数量增加的情况下，放射性标记的B1U 1 RNA的XL。

为了表征H2a mRNA和Lin28之间的相互作用，将固定量的放射性标记H2a RNA（编码区，393-nt长）与转染Flag-Lin28的HEK293细胞提取物孵育，同时存在越来越多的类似大小的未标记RNA片段（见“材料和方法”一节）。使用的未标记竞争物RNA来自组蛋白H4、H3、H2b和H2a的编码区以及片段B1U1。B1U1来自细胞周期蛋白B mRNA的3′-非翻译区（UTR）的一部分，该区域不包含Lin28的高亲和力结合序列[(10)并查看图3]，因此用作非特异性Lin28结合的对照。对反应进行紫外线照射，然后进行核糖核酸酶A消化。IP使用抗Flag抗体捕获交联（放射性标记）Lin28，并通过放射自显影术进行可视化。如所示图3a、 与未标记的H2a RNA相比，Lin28与放射性标记的H2aRNA结合的竞争效率要高得多（比较15-17车道和3-14车道）。在所用条件下，H2a RNA对Lin28的亲和力比H4 RNA高约8倍，比B1U1、H2b和H3 RNA高约5倍(图3b） ●●●●。使用未标记的B1U1与未标记的H2a在7摩尔过量浓度下的明显更好的竞争(图3a、 将车道12–13与车道15–16进行比较）简单地反映了内在的实验变化，这反映在如所示的误差栏中图3b在7摩尔过量浓度下。当使用标记的B1U1时，与B1U1 RNA本身相比，H2a的竞争效率更高(图3c） ●●●●。综上所述，这些结果强烈表明H2a编码区包含Lin28的高亲和力结合位点。

细胞培养和转染

如前所述，将小鼠ES细胞系ES-C57BL/6细胞（ATCC，SCRC-1002）培养在丝裂霉素激活的MEF（ATCC、SCRC-1040）饲养层上(10). 使用ATCC提供的标准方案培养HEK293和NIH/3T3细胞。按照说明进行细胞转染(29).

蛋白质提取和蛋白质印迹分析

这些都是按照描述完成的(10).

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7分析

根据制造商的方案，使用载脂蛋白-ONE均相Caspase-3/7检测试剂盒（Promega）测量Caspase活性。

流式细胞术分析

在转染后24小时（质粒DNA转染）或48小时（siRNA转染）采集ES细胞，并在4°C的70%乙醇中固定30分钟。用PBS洗涤一次，然后再悬浮在PBS（5×10）中⁵细胞/100µl PBS），在室温下用最终浓度为100µg/ml的RNase A处理细胞10分钟。然后用冷PBS以1:5的比例将细胞悬浮液稀释，并以最终浓度16µg/ml添加碘化丙啶。在通过75μm网格（以去除细胞团）后，将细胞悬浮物放在冰上30分钟，然后进行流式细胞仪分析。使用Cellquest软件在CALIBUR FACScan中测量细胞周期参数，并使用Verity software House的Modfit软件处理数据(moc.hsv@ytirev).

免疫沉淀、RNA提取和RT-qPCR

这些是根据前面描述的协议进行的(10). 对四种小鼠组蛋白基因特异的RT引物为：H2a，5′-CTTTTGAGCTCCTCGTCGT；H2b，5′-GGTCGAGCGCTGTTAAT；H3，5′-GACGGCACGCTGGATGTCCT；和H4，5′-TAACCGCCGAATCCGTAGA。单个基因的PCR引物为：Gapdh正向：5′-TTAGCACCCTGGCCAAGG；Gapdh反面：5′-CTTACTCCTTGGAGGCAATG；β-肌动蛋白正向：5′-GTGGGGCCGCTCTAGGCACCAA；β-肌动蛋白反面：5′-CTCTTGATGTCACGCACGATTTC；管蛋白前体：5′-CGTGTCGGCCAGAGTGTGC；Tubulin反向：5′-GGGTGAGGGCATGACGCTGAA；Cdk4正向：5′-TGTTGGAGCGTTGGCTGTATC；Cdk4反面：5′-TGGTCGGCTTCAGAGTTCC；10月4日转发：5′-TGGAGAAGGTGGACCAACCACTCC；10月4日背面：5′-ACACGGTTCTCAATGCTAGTTCGC；Lin28前锋：5′-GTCTTGTGCACCAGCAA；林28反面：5′-CTTGGATCTCGCTTCTGC；细胞周期蛋白B（B1）前向：5′-TCCTCGGTGGATTCAAGTGC；细胞周期蛋白B（B1）反向：5′-CAGGAGTGGCGCCTTGTGTGTGTGGTGTGATGG；Cdk1正向：5′-TTGGAGAGGTACTACTACGGTGTG；Cdk1反面：5′-CAGGAGGATGGTCCAGGT；细胞周期蛋白A（A2）前体：5′-GCTCAAGACTCGCTGC；细胞周期蛋白A（A2）反向：5′-GCTGCATTAAAAGCCAGGGCATC；H2a正向：5′-GGCGGTGCTGGAGTACCTA；H2a反面：5′-GATGATGCGCGTCTTG；H2b正向：5′-GAGAGTACTCGGTGTACGTG；H2b反面：5′-CGCTCGAAGTGTCTCAC；H3正向：5′-AAACAGATCTGCTGCTTCCAG；H3反面：5′-TTGTTACGTTTGGCATGG；H4正向：5′-AACATCCAGGCATACACGAA；H4反面：5′-TCTTGCGCTTGGCGTCT；萤火虫荧光素酶前体：5′-GCTGGCGTAATCAGAGAGAG；萤火虫荧光素酶逆转：5′-GTGTCGTCTTCGTCCCAGT；雷尼拉前锋：5′-GCAAAATCAGGCAAATCTGGT；雷尼拉反面：5′-GGCCGAAAAATGATCTTC。

萤火虫报告基因构建和荧光素酶活性测定

通过插入鼠标Hist2h2aa1的开放阅读框（ORF）创建了各种firefly报告器结构({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_013549”，“术语id”：“2260855219”}}NM_013549)，历史1h2bc({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_023422”，“term_id”：“142381596”}}NM_023422号)，历史1h3g({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_145073”，“term_id”：“75991703”}}NM_145073号)和历史1小时4小时({“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”NM_153173“，”term_id“：”588480522“}}NM_153173)分别进入父母萤火虫报告者的3′UTR(19)在Not I和XhoI开业。通过小鼠ES细胞总RNA的RT-PCR获得ORF。F3-1X是通过将含有135-nt H2a区域（nts 259–393，相对于H2a的翻译起始位点）的PCR片段插入在Not I和Xho I位点打开的萤火虫报告子的3′UTR中创建的。为了制备F3-2X，将H2a的135-nt区（由两端带有非I位点的PCR产生）插入在非I开放的F3-1X中。测序证实了所得到的克隆。B1U1荧光素酶结构如前所述(10). 将构建物转染到NIH/3T3细胞中，同时增加Flag-Lin28 DNA的数量。此外，为了正常化目的，所有转染中都包括一名Renilla报告员。转染是在48孔平板秤上进行的。每个孔的质粒DNA总量为400 ng，其中包括100 ng萤火虫报告DNA、2 ng雷尼拉DNA和0、10、20或40 ng Flag-Lin28。根据制造商的说明，使用TD 20/20n（Turner BioSystems）和双荧光素酶测定系统（Promega）测定荧光素酶活性。荧光素酶mRNA水平通过RT-qPCR测定，并在β-微管蛋白和Renilla mRNA归一化后绘制水平图。

我们要感谢张克雄的流式细胞仪分析。