Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1

Mamta Tahiliani; Kian Peng Koh; Yinghua Shen; William A. Pastor; Hozefa Bandukwala; Yevgeny Brudno; Suneet Agarwal; Lakshminarayan M. Iyer; David R. Liu; L. Aravind; Anjana Rao

doi:10.1126/science.1170116

科学。作者手稿；PMC 2009年7月24日发布。

以最终编辑形式发布为：

科学。2009年5月15日；324(5929): 930–935.

2009年4月16日在线发布。数字对象标识：10.1126/科学.1170116

PMCID公司：PMC2715015型

美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院126295

PMID：19372391

MLL合作伙伴TET1将哺乳动物DNA中的5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶

马姆塔·塔希利亚尼,¹ Kian Peng Koh先生,¹ 申英华,² 威廉·帕斯特,¹ 霍泽法·班杜克瓦拉,¹ 叶夫根尼·布鲁德诺,² 苏尼特·阿加瓦尔,^三拉克希米纳拉扬·M·伊耶,⁴ 大卫·R·刘,^2,^* 拉维德,^4,^*和安贾娜·拉奥^1,^*

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MLL合作伙伴TET1将哺乳动物DNA中的5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶
Mamta Tahiliani、Kian Peng Koh、Yinghua Shen、William A.Pastor、Hozefa Bandukwala、Yevgeny Brudno、Suneet Agarwal、Lakshminarayan M.Iyer、David R.Liu、*L.Aravind、*Anjana Rao*
*信件应寄给谁。电子邮件：ude.dravrah.idi@oara（A.R.）；vog.hin.mln.ibcn@德尼瓦拉（洛杉矶）；ude.dravrah.saf@uilrd公司（D.L.）
2009年4月16日发布于科学类快递DOI:10.1126/science.1170116
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具有预测5-甲基嘧啶氧化酶活性的2OG-Fe（II）加氧酶新家族的鉴定。为了确定催化5-甲基胞嘧啶氧化修饰的候选酶，我们创建了已知2OG-Fe（II）加氧酶的位置特异性评分矩阵（图谱），其中包括JBP1和JBP2的预测加氧酶域(图S1). 我们使用此配置文件通过PSI-BLAST程序对非冗余数据库进行系统搜索(1). 这项研究从Cooper和Nigel噬菌体的gp2蛋白中恢复了同源结构域，并从弗兰克氏菌基因组（e<10⁻⁴). 然后，我们生成了一个包含gp2蛋白序列的新图谱，并对环境样本中微生物的蛋白序列数据库进行了第二次搜索。这项研究检测到许多可能来自未培养的海洋噬菌体和原噬菌体的同源蛋白。进一步搜索非冗余数据库，将环境序列中新检测到的蛋白质添加到图谱中，恢复了后生动物中发现的三个同源人类致癌基因TET1（CXXC6）、TET2和TET3的同源区域及其同源序列（e<10⁻⁵). 真菌和藻类中也发现同源结构域。在PSI-BLAST搜索中，这些同源结构域组在恢复2OG-Fe（II）加氧酶超家族的任何其他成员之前一直相互恢复，这表明它们构成了一个不同的家族（LM Iyer，L Aravind，手稿正在准备中).
为了确认新鉴定的蛋白质（以下称为TET/JBP家族；参见图1图例）与经典2OG-Fe（II）加氧酶的关系，我们制备了它们共享的保守结构域的多重比对，并使用该比对生成隐马尔可夫模型（HMM）。该HMM与使用HHpred程序从蛋白质数据库（PDB）中为所有结构特征化域生成的HMM库的profile-profile比较(2)导致脯氨酰羟化酶恢复（e<10⁻¹²)是2OG-Fe（II）加氧酶超家族的典型成员，最受欢迎。二级结构预测表明存在一个N端α-螺旋，随后是一系列连续的β-链，这是典型的2OG-Fe（II）加氧酶的双链β-螺旋（DSBH）折叠(图1A,底部) (三). 多序列比对(图1A)进一步表明，新的TET/JBP家族显示了2OG-Fe（II）加氧酶的所有典型特征，包括：（i）HxD特征，正好位于螯合Fe（II）的N端β链下游（x是任何氨基酸）；（ii）HxD基序下游紧邻链的开始处的一个小残基，通常是甘氨酸，这有助于定位活性位点精氨酸；（iii）C末端部分的Hxs基序（其中s是一个小残基），其中H螯合Fe（II），小残基有助于结合2-氧代酸；（iv）接收端₅上述基序下游的标记（其中a是芳香残基）–该基序中的R与2-氧代酸形成盐桥，芳香残基有助于定位第一个与金属相关的组氨酸（关键残基在图1A). 这些观察强烈表明，TET/JBP家族的成员，包括TET1、2和3，是催化活性的2OG-Fe（II）加氧酶。
此外，后生动物TET蛋白含有一个独特的富含半胱氨酸的保守区域，与DSBH区域的N末端相连，该区域至少含有八个保守半胱氨酸和一个可能构成双核金属簇的组氨酸(图1A,顶部). 脊椎动物TET1和TET3及其所有其他动物的直系同源物也具有CXXC结构域，这是一个双核Zn相关结构域，具有八个保守的半胱氨酸和一个组氨酸，位于2OG-Fe（II）加氧酶结构域的N末端（如图所示图1B). 对CXXC结构域蛋白质结构的分析表明，CXXC域是一个辅助的DNA结合域，它往往与具有不同染色质修饰和修饰识别活性的多种结构域结合在同一多肽中。CXXC结构域存在于几种染色质相关蛋白中，包括甲基-DNA结合蛋白MBD1、组蛋白甲基转移酶MLL、DNA甲基转移酶DNMT1(4)以及赖氨酸脱甲基酶KDM2A（JHDM1A/FBXL11）和KDM2B（JHDM2B/FBLX10，其也包含泛素E3连接酶结构域）(5)在某些情况下，已经证明可以区分甲基化和非甲基化DNA(6).
综合起来，从这些结构域和噬菌体成员的基因邻域中收集到的上下文信息(补充信息)支持整个TET/JBP家族的保守DNA修饰功能，即5-甲基嘧啶的氧化。在这项研究中，我们测试了TET蛋白可能在5mC上运行以催化甲基氧化或氧化去除的特定假设，重点关注TET1作为TET/JBP家族哺乳动物的例子。
hmC可能不限于CpG。最近邻分析表明，ES细胞中总5mC的15-20%存在于CpT、CpA和（在较小程度上）CpC序列中；相反，体细胞组织的非CpG甲基化可以忽略不计(7).
以往关于hmC的研究。除了两篇报道基因组DNA中高水平hmC的论文外(8)，大多数以前的研究都将hmC描述为一种罕见的碱，可能是5mC的氧化产物(9, 10).
hmC、5mC和C的识别方法我们在此表明，三种最常用技术中的两种无法充分区分C、5mC和hmC。一种广泛使用的小鼠5mC单克隆抗体通过免疫细胞化学明显不能识别hmC(图2A)因此，仅基于该抗体的使用，重新评估以前关于DNA去甲基化的报告将非常重要。类似地，甲基化敏感的限制性内切酶HpaII不能切割hmC(图3D)如前所述(11)，增加了在某些情况下，hmC修饰的DNA被错误地判断为甲基化的可能性。另一种甲基化敏感的限制性内切酶，McrBC，已知可以同等地切割含有5mC和hmC的DNA(12)，因此也不允许区分这两个核苷酸。
亚硫酸氢盐修饰分析如何解释DNA中hmC的存在尚待确定。用亚硫酸氢钠处理DNA可促进胞嘧啶自发脱氨基为尿嘧啶，而不影响5mC；测序后对感兴趣序列进行扩增，可以确定给定序列的精确甲基化模式(13). 众所周知，亚硫酸氢盐在C5处与hmC快速反应，形成稳定的5-亚甲基磺酸胞嘧啶加合物，该加合物不易脱氨基(14). 该被取代物种有望形成类似于胞嘧啶形成的碱基对，在扩增步骤中，聚合酶可将其解读为C，从而将该序列解释为含有5mC。或者，聚合酶可能无法有效复制5-亚甲基磺酸胞嘧啶，在这种情况下，含有该加合物的DNA将无法有效扩增，而含有原始hmC修饰的序列在扩增的DNA中表现不足。
hmC对氮键羟甲基的稳定性。T-偶噬菌体基因组中hmC的稳定性(15)与DNA修复酶AlkB和JmjC结构域组蛋白去甲基化酶（也是2OG和Fe（II）依赖性加氧酶）生成的N-连接羟甲基加合物的不稳定性形成对比。这些氮键加合物自发分解，生成非甲基化氨基和甲醛(16); 相反，JBP1/2和胸腺嘧啶羟化酶对碳链甲基的氧化不会导致通过氧化去除甲基加合物(17, 18). 这种差异是由于碳的离开基团比氮差得多，这解释了我们检测基因组DNA中hmC的能力。
DNA去甲基化机制哺乳动物DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B建立并维持DNA甲基化模式(19, 20). 通过连续的复制循环防止维持甲基化逐渐稀释甲基标记并导致“被动”DNA去甲基化(21). 只有受精后不久，父系基因组才有令人信服的“活性”（复制无关）DNA去甲基化(22−24); 潜在的机制可能涉及连接甲基和嘧啶的碳-碳键在热力学上不利的断裂，导致甲基部分的释放，或一种类似修复的过程，其中甲基化的碱基或核苷酸被切除，然后对病变进行修复，以用非甲基化的C取代原来的5mC（参见(25, 26)). 后一种机制发生在植物中，DEMETER是一种限制在开花植物中的双功能糖苷酶，它能裂解5mC的糖苷键，并通过碱交换修复刺激非甲基化C的插入(27). 已经描述了各种候选哺乳动物去甲基化酶活性，但不幸的是，这些报告都没有得到其他实验室的证实（综述于(19, 28−30)).
TET蛋白在癌症中的作用人类LCX（具有CXXC结构域的白血病相关蛋白）/Tet1（十级易位-1）基因最初被定义为儿童和成人急性髓性白血病患者t（10；11）（q22；23）的新型MLL融合伙伴(4, 31). 在最近的一项研究中，MLL/Tet1融合占MLL相关白血病的3/759（0.4%）(32)两例急性淋巴细胞白血病，同时显示儿童和成人急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病均发生MLL/Tet1融合。MLL/Tet1融合的可能致病机制包括改变Tet1催化活性的基因组靶向性和/或干扰辅助因子向Tet-1介导的hmC生成位点的募集。据报道，最近约14%的患者出现了纯合型Tet2缺失/功能丧失突变JAK2号机组V617F阳性和阴性骨髓增生性肿瘤（包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原代性骨髓纤维化（MF）、PV后MF、ET后MF和爆发期PV/ET/MF）(33, 34); 大约29%的系统性肥大细胞增多症患者(35); 和其他髓系恶性肿瘤，包括慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病(36, 37). 研究Tet2功能丧失、表观遗传学改变（如以骨髓增生性肿瘤为特征的启动子高甲基化）和表观遗传学治疗反应之间的关系将是很有趣的(38).
图S1。5-甲基嘧啶的修饰。（A）锥虫基因组中含有一种改良的胸腺嘧啶，称为碱基J（β-D-葡萄糖基羟甲基尿嘧啶）。有人提出J碱是通过胸腺嘧啶甲基的顺序羟基化和葡萄糖基化合成的(17).（B）TET1，可能还有其他TET家族成员，氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基基团，生成5-羟甲基胞嘧啶。
图S2。用于生成职位特定得分矩阵（PSSM）的序列。该图显示了用于创建位置特定评分矩阵的序列，该矩阵在PSI-BLAST程序的搜索中检索TET蛋白。每个序列都由允许从GenBank数据库中恢复的gi编号标识，排列两侧的编号提供了序列中对齐区域的限制。动质体中的JBP蛋白标记为红色。搜索使用检查点开始选项–B进行，将–h设置为0.01，将–F设置为F，所有JBP序列通过–i选项循环进行单个搜索。
图S3。TET/JBP家族和具有代表性的2OG-Fe（II）依赖性双加氧酶结构域的多序列比对。富含半胱氨酸的区域（C）和核心催化域（D）分别对齐。蛋白质由基因名称和物种标记，用下划线分隔。95%的一致性是根据TET/JBP蛋白的更大比对计算得出的。TET特异性C末端链的一致性是从后生动物TET同源物的更大比对中单独计算出来的。除了TET/JBP家族外，该序列还包含双氧酶超家族的结构特征代表，即衣原体脯氨酰羟化酶（P4H）和大肠杆菌AlkB（2FD8）及其PDB代码。
图S4。使用CellProfiler进行图像分析使用IdentifyPrimAutomatic模块根据DAPI荧光对Nuclei进行概述，并表示为outlined Nuclei。预设直径范围为10−35像素单位的对象轮廓为绿色，并包含在分析中。范围外的对象（包括单元簇）以及接触边界的对象以红色勾勒出来，并从分析中排除。为了解释核边界的HA染色，添加了IdentifySecondary模块，将核轮廓扩展2个像素，表示为ExpandedNuclei outlines。然后使用MeasureObjectIntensity模块在相应的HA图像上应用ExpandedNuclei Outlines，在相应的5mC图像上应用Outlined Nuclei（未显示），分别测量HA和5mC染色的像素强度。像素数显示在图像的轴上，图像是以20倍的放大倍数拍摄的。
图S5。来自T4*噬菌体的真实hm-dCMP的质谱裂解分析（MS/MS）(顶部)以及过度表达TET1-CD的HEK293细胞基因组DNA中存在的未知核苷酸物种(底部).（A）在负离子模式下进行MS/MS分析，碰撞能量为25V。（B）在正离子模式下进行了MS/MS分析，碰撞能量为25 V。显示了观察到的质量（预期质量精度在0.003 Da以内）。
图S6。Sf9细胞重组Flag-HA-TET1-CD的纯化及TET1-CD片段的鉴定。（A）考马斯染色的野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD SDS-PAGE凝胶，通过亲和层析和抗Flag抗体结合珠从Sf9细胞纯化到接近同质性。将已知量的BSA加载到同一凝胶上进行比较。野生型和突变体TET1-CD（79KDa，箭头所示）都表现出强烈的氧化倾向，并形成二硫键连接的二聚体（158KDa）和高阶多聚体，它们对DTT具有抗性。星号表示免疫印迹检测不到的降解产物（参见（B）)可能是由于N-末端Flag-HA表位标签的丢失。（B）用抗HA抗体免疫印迹法鉴定表观高分子量条带为TET1氧化产物。（C）用抗Flag抗体进行的免疫印迹显示，多聚体形成的TET1-CD随着裂解物处理时间的增加和同时暴露于氧化条件而增加。在含有10 mM DTT的RIPA缓冲液中进行20分钟的裂解，可检测到TET1-CD二聚体的存在（通道1）。当来自Flag-HA-TET1-CD过度表达细胞的细胞颗粒直接在含有700 mMβ-ME的变性莱姆利SDS样品缓冲液中溶解时，未检测到该二聚体（通道3）。TET1-CD氧化的趋势似乎至少部分是由于富Cys-区域（C）形成了二硫键，该区域是DSBH（D）区域（通道2、4）的N末端。在RIPA缓冲液或SDS样品缓冲液中提取后，去除N-末端富含Cys-区域导致表达一种蛋白质（Flag-HA-TET1-D），该蛋白质在其预期分子量（57.6 KDa）下运行。中显示的数据（A-C）表明萃取过程中形成了抗还原剂的分子间二硫键。（D）在HEK293细胞中过度表达Flag-HA-TET1-CD，而不是Flag-HA-TET1-D，导致抗5mC抗体染色减少。
图S7。从Sf9细胞纯化的重组Flag-HA-TET1-CD不能将胸腺嘧啶（另一种5-甲基嘧啶）转化为hmU在体外（A）合成的双链DNA寡核苷酸，含有完全甲基化的Taq^αI（T）^^米将CGA）或SalI（G^TCGAC）位点与纯化的Flag-HA-TET1-CD或突变的Flag-HA-TET1-CD在37℃（酶底物比1:10）下培养5小时。（B）用Taq消化回收的寡核苷酸^αI或SalI，末端标记，水解为dNMP，并使用TLC进行解析。TET1-CD能够羟基化5mC，但在双链寡核苷酸底物中SalI位点的背景下不能作用于胸腺嘧啶在体外将终止于hmU的双链DNA寡核苷酸进行末端标记和水解，以生成hm-dUMP迁移的标准（通道5）。SalI已被证明可切割G（hmU）CGAC，相当于GTCGAC(39).
图S8。模型推测hmC的生物学作用及其作为DNA去甲基化中间产物的潜力。（A）将hmC整合到DNA甲基化和被动复制依赖性去甲基化的已知途径中。已知路径以黑色显示，本研究的新发现以红色显示。虚线和问号用于指示可能存在但尚未实验确定的路径。（B）涉及hmC的潜在生物学机制。hmC可能招募特异性结合蛋白；5mC转化为hmC可能会取代DNA中的甲基结合蛋白(中心). hmC也可能是促进被动DNA去甲基化的中间产物：半甲基化DNA中5mC转化为hmC可能会干扰DNMT1和相关SRA域蛋白的识别(左边). 最后，hmC可以通过自发或酶促过程转化为胞嘧啶，也可以被特定细胞类型中的特异性DNA修复蛋白识别，从而在活性DNA去甲基化中发挥中间体的作用(正确的).
方法
计算和生物信息分析使用PSI-BLAST程序搜索蛋白质序列的非冗余（NR）数据库（国家生物技术信息中心，NIH，Bethesda）(1). 使用PSI-BLAST程序进行的配置文件搜索使用单个序列或使用PSSM作为查询的序列，配置文件包含期望值（E）阈值为0.01，并进行迭代，直到收敛(1). 对于所有成分偏向的查询，在PSI-BLAST搜索中使用基于成分的统计数据进行校正(40). 使用Kalign程序建造了多条路线(41)，然后根据PSI-BLAST结果进行手动校正。多重对齐用于使用HMMER包的Hmbuild程序创建HMM(42). 然后用Hmcalibrate对其进行优化，并使用HMMER软件包的Hmsearch程序将所得图谱用于搜索完全测序的基因组数据库(42). 使用HHpred程序执行配置文件搜索(2, 43). JPRED计划(44)和COILS程序用于预测二级结构。使用SEG程序预测球状结构域，参数如下：窗口大小40，触发复杂度=3.4；扩展复杂性=3.75(45).
瑞士PDB查看器(46)和Pymol程序用于对PDB文件进行操作。以tblastn对染色体的搜索为指导，使用NCBI Splign程序重建外显子-内显子边界。基因邻域是使用一个自定义脚本来确定的，该脚本使用完全测序的基因组或全基因组枪序列来推导以查询基因为中心的基因邻域表。然后使用BLASTCLUST程序对邻域中的产品进行聚类，并建立保守的共现基因。然后，根据至少一个其他系统发育上不同的谱系（NCBI分类学数据库中的“门”）中的发生情况，按照排名方案对这些保守的基因邻域进行分类，在特定谱系（“门”染色体上的物理紧密性表明调控−10和−35元素的共享。用MEGA4软件包构建系统发生树。
TET1表达质粒从SY5Y cDNA和人类克隆中扩增TET1 ORF，并将其插入Flag-HA标记的pOZ-N的XhoI和NotI位点。使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）生成突变TET1（H1671D，Y1673A）。所有克隆的序列均经常规DNA测序证实。扩增野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD并克隆到pEF1（Invitrogen）的Acc651和XbaI位点。扩增pOZ-N的IRES-CD25并克隆到Flag-HA-TET1-CD-pEF1的XbaI和BstB1位点。从Flag-HA-TET1-CD-pOZ中扩增出野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD，并插入pFastBac（Invitrogen）的SalI和NotI位点。
免疫细胞化学将细胞以1.5×10的比例放置在24孔板中的无菌盖玻片上⁵使用pEF1-TET1表达结构或空载体（模拟）瞬时转染前，细胞/孔和隔夜生长变速箱IT™-293转染试剂（Mirus，Madison，WI）符合制造商的说明。转染后42−44小时，细胞在PBS中4%多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下用0.2%Triton X-100在PBS内渗透15分钟。为了检测5-甲基胞嘧啶，在室温下用2N HCl处理细胞30分钟，然后用100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中和10分钟。在PBS中进行广泛清洗后，细胞在1%BSA和0.05%吐温20的PBS中在室温下被封闭1小时。兔抗HA多克隆抗体（1:400稀释；加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）和小鼠抗5甲基胞嘧啶克隆162 33 D3抗体（1:2500−3000稀释；加州圣地亚哥Calbiochem）在室温下将其加入封闭缓冲液中2~3小时，并分别由与Cy2或Cy3偶联的二级抗体同时检测。用250 ng/ml的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对DNA进行染色，并安装在SlowFade®金防褪色试剂（分子探针，尤金，OR）中。使用OpenLab成像软件（英国考文垂Improvision）在配备CCD摄像头的蔡司Axiover 200倒置显微镜上对图像进行数字记录。
CellProfiler™细胞图像分析。使用20倍物镜从每个转染细胞孔中拍摄三个区域，每个区域包含200−400个细胞，并在每个实验中汇总分析。灰度图像（tiff）作为三个单独的文件上传到CellProfiler上，分别用于DAPI、GFP（HA检测）和Cy3（5mC检测）三种激发波长下捕获的每个场(47). 基于DAPI染色对核轮廓进行轮廓分析，包括一个二级模块，将核轮廓再扩展2个像素（表示为“扩展核”），以解释核边界处的HA染色。排除了聚集的单元格和字段边缘的单元格。单个细胞内HA和5mC的染色强度分别作为GFP和Cy3信号的平均像素强度，在“膨胀细胞核”和原始细胞核轮廓内进行测量。原始数据绘制为每个转染样品的5mC平均像素强度与HA平均像素强度的点图。同一组模拟转染细胞显示在图1C将HA表达细胞（任意分类为平均HA像素强度高于在模拟转染细胞中观察到的最高强度的细胞）的5mC染色强度的群体平均值与模拟转染细胞进行比较。数值是在归一化之前提取的背景值，是来自3个实验的平均值±SEM；统计比较基于ANOVA和Bonferroni的事后检验。
使用TransIT转染试剂（Mirius）将TET1-CD-IRES-CD25-pEF1载体转染并分选表达hCD25的HEK293T细胞。对照细胞（模拟）用相应的空载体转染，该空载体单独驱动CD25的表达。48小时后，30×10⁶细胞在1X FACS缓冲液（1XPBS，2%FBS，1mM EDTA，0。1%NaAzide）在4 C下放置30分钟。用1X FACS缓冲液清洗细胞两次。然后用抗PE微球（Miltenyi）染色25 min，4 C，然后用1X FACS缓冲液洗涤两次，然后用1 X MACS缓冲液（1X PBS，0.5%BSA，0.09%叠氮化钠和2 mM EDTA）洗涤一次。将细胞重新悬浮在2ml冰镇1X MACS缓冲液中，并使用AutoMACS细胞分选仪（Possel）对表达CD25的细胞进行分选。通过FACS分析输入、流通和收集的样品，以确认收集样品中CD25阳性细胞的富集。
使用薄层色谱法分析5mC水平，通过在1 ml NPB（240 mM蔗糖、7.5 mM Tris、pH 7.5、3.75 mM MgCl）中重新悬浮，从CD25阳性细胞中制备细胞核₂，0.75%Triton-X-100，100μg RNAseA/ml（Qiagen）），放在冰上20分钟。细胞在1300 g下旋转15分钟，4℃，然后在NPB中清洗一次。在650μl 1X LB（（10 mM Tris，pH 8.0，300 mM NaAcetate，pH 7.2，0.5%SDS，5 mM EDTA，100μg RNAseA/ml和300μg/ml蛋白酶K（Roche））中溶解细胞核，并在55℃下培养过夜。早上添加额外的300μg/ml蛋白酶K，将样品在55℃放置5小时。用等量的苯酚、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）萃取样品，然后用2体积的乙醇沉淀。用1 ml 70%EtOH洗涤基因组DNA两次，干燥后再悬浮在10 mM Tris、0.1 mM EDTA、pH 8.0中，并在32 C下重新悬浮过夜。
用100单位的MspI、HpaII或Taq消化2μg基因组DNA^α1和100μg RNaseA（Qiagen）过夜。早上额外添加100单位的限制性内切酶，并持续培养6小时。添加10单位小牛肠磷酸酶（CIP），并在37℃下培养1小时。按照制造商的说明，使用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）纯化DNA。用T4多核苷酸激酶（T4 PNK）（NEB）和10μCi的[γ^32-P] -在37℃下，ATP作用1小时。通过在-80℃下左侧添加30μg线性聚丙烯酰胺、1/10体积的3 M醋酸钠、pH值7.2和2.5体积的乙醇，沉淀标记片段1小时。样品以14000 rpm在4℃下旋转20分钟，并在25℃下用70%EtOH洗涤两次。将颗粒重新悬浮在30 mM Tris中，pH 8.9，15 mM MgCl₂、2 mM CaCl、10μg DNaseI（沃辛顿）和10μg SVPD（沃辛斯顿），并在37 C下培养3小时。3μl在纤维素TLC板（20 cm×20 cm，Merck）上发现，并在异丁酸中展开：H₂0:NH（新罕布什尔州）_三(66:20:1). 使用磷光成像仪Storm 860扫描仪软件通过磷光成像器扫描分析板材。其他核苷酸的低水平标记反映了DNA剪切或污染的内核溶解活性。
制备用于制备hm-dCMP标准T4噬菌体库存的未葡糖基化T4噬菌体DNA的方法是在LB板上滴取10μl系列10X稀释液，在LB平板上放置100μl过夜培养物大肠杆菌倒入3毫升T4顶部琼脂中的CR63并使其固化。将平板在37℃下培养过夜大肠杆菌CR63外径₆₀₀用T4噬菌体的单个斑块感染0.5，并在37°C下摇晃培养，直到培养物清除（约2.5小时）。将培养物在冰上孵育10分钟，然后通过添加几滴氯仿并轻轻混合来完成裂解。如上所述滴定裂解液。
大肠杆菌ER1656在LB至OD中生长₆₀₀0.5，然后感染每个细菌0.2噬菌体，并在37°C下摇晃培养，直到培养物清除（约8小时）。。将培养物在冰上冷却10分钟，然后通过加入1ml氯仿完成裂解。将DNase I添加至1 mg/ml，并在4°C下培养2小时。将裂解液在12000g下于4C下离心10分钟，以形成碎片。收集上清液，并通过在23500g下离心1.5小时，在4C下对噬菌体进行造粒。将噬菌体颗粒放置在TE中过夜，以重新悬浮。使用等量的苯酚、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）提取噬菌体DNA。将提取的噬菌体DNA透析到TE中过夜，同时改变2次缓冲液。
质谱实验。将转染TET1野生型或突变型CD或T4噬菌体的HEK293细胞的基因组DNA在大肠杆菌13656中生长，用SVPD和DNaseI水解为dNMP，并用TLC进行解析。使用Acquity UPLC/Q-TOF Premier电喷雾LC/ESI-MS系统（Waters Corp.，Milford，MA）刮取与壁面dNMP对应的斑点，用水萃取，冷冻干燥，并在水中重新悬浮，以进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析。采用Waters HSS C18色谱柱（内径1.0mm×50mm，颗粒1.8-um）进行液相色谱（LC），线性梯度为0%至50%甲醇，0.1%甲酸铵水溶液，pH 6.0。流速为0.05 mL/min，洗脱液直接注入质谱仪。质谱以连续模式记录，并转换为质心模式以生成准确的质谱。使用Masslynx 4.1软件（Waters）分析数据。
重组蛋白的表达与纯化Bacmid DNA是使用DH10Bac™生成的大肠杆菌大肠杆菌（Invitrogen）按照制造商的指示。用PCR证实转座到正确的位点。使用悬浮适应的Sf9细胞将杆状病毒扩增三代。然后用杆状病毒感染Sf9细胞4天。将所得细胞颗粒置于40 mM Tris、pH 7.4、300 mM NaCl、0.2%NP40、0.4%Triton、5 mM DTT、不含EDTA（Roche）的1X蛋白酶抑制剂中冰上30分钟，然后在12000 rpm（SLA-TC600）下30分钟，4 C。然后在4 C下将超新药与抗旗帜抗体结合珠（Invitrogen）孵育5小时。将小球在40 mM Tris、pH 7.4、300 mM NaCl、0.2%NP40、8%甘油、1X PI、5 mM DTT中洗涤4次，然后在195 mM Tris、pH 7.4、110 mM NaCl、0.14%NP40、5.8%甘油、0.37X PI、3.7mM DTD、365μg/ml Flag肽中洗脱。用SDS-PAGE、考马斯蓝染色和抗标记抗体（Sigma）免疫印迹法测定洗脱蛋白的均一性。
双链寡核苷酸底物的制备合成寡核苷酸购自IDT。所有寡核苷酸长度为35个核苷酸，修饰如下。
F： 5'-CTATACCTCTCTCCAACTTCGACTCTCCGGCG-3'
F类^我：5'-CTATACCTCTCCAACTT（mC）GATCACTCTCCGGCG-3'
R： 5'-生物素-CGCCGGAGACGGTGAGAGAGAGTTGAGGAGTATAG-3'
R（右）^我：5'-生物素-CGCCGGACGGTGAT（mC）GAAGTTGAGGAGTAT AG-3’
在100 mM KAc、30 mM HEPES、pH 7.5中，将寡核苷酸退火为适当的互补寡核苷酸。将混合物煮沸5分钟，然后缓慢冷却至室温过夜。用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化双标记寡核苷酸。
体外酶分析将7.5μl重组蛋白（约3μg）与2μg寡核苷酸底物在50 mM HEPES、pH 8、50 mM NaCl、2 mM抗坏血酸、1mM 2OG、100μM FAS（Fe²⁺)用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）纯化寡核苷酸底物，然后用Taq消化^一1过夜，用CIP处理1小时，用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）再次纯化。纯化的DNA寡核苷酸用T4多核苷酸激酶（NEB）和10μCiγ标记^32便士-在37℃下，ATP沉淀1小时。添加30μg线性聚丙烯酰胺、1/10体积的3M醋酸钠、pH 7.2和2.5体积的乙醇，然后在-80℃下培养1小时，沉淀标记的片段。样品在冷冻微型离心机中以14000 rpm的转速在4℃下旋转20分钟。用70%的EtOH洗涤两次，并在室温下旋转10分钟，以去除未结合的放射性核苷酸。将颗粒重悬于10μl 30 mM Tris、15 mM MgCl中₂，2 mM CaCl，pH 8.9，加10μg DNaseI（沃辛顿）和10μg SVPD（沃辛斯顿），并在37 C下培养3小时。在纤维素TLC板（默克）上发现3μl，并在异丁酸：水：氨（66:20:1）中展开。使用磷光成像仪Storm 860扫描仪软件通过磷光成像器扫描分析板材。每条通道中微弱的dCMP斑点来自于基板每条链5'端的C末端标记。T4 PNK不能像限制性内切酶切割产生的5’端那样有效地对钝端进行磷酸化。
ES细胞培养将V6.5小鼠ES细胞保存在含有DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）、15%ES FBS（Omega Scientific，Tarzana，CA）和非必需氨基酸（Invit罗gen）各0.1 mM、2 mM L-谷氨酰胺（Invitro）、0.1 mMβ-巯基乙醇（Invitrougen）、，50单位/ml青霉素/链霉素（Invitrogen）和1000单位/ml ESGRO®（LIF；Chemicon）。对于所述的所有实验，在收集漂浮的ES细胞并将其重新涂敷在涂有明胶的培养皿或微孔上之前，将细胞胰蛋白酶化并在标准组织培养皿上涂敷30分钟，以去除饲养细胞。对于LIF提取分析，细胞以2−3×10的密度进行培养⁵在第二天（第0天）取出每10厘米培养皿中的细胞和LIF。如前所述进行RNA干扰（RNAi）实验(48)使用Dharmacon siGENOME siRNA双链体（Thermo Fisher Scientific Inc，Boulder，CO）对抗小鼠Tet1（目录号D-062861−01/02）。Dharmacon siGENOME非靶向siRNA#2（类别号D-001210−02）用作阴性对照。小鼠ES细胞以1×10的密度接种在明胶涂层的12孔中⁵根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen）在第二天（第0天）转染50 nM siRNA。在第2天以1:4的比例对预贴壁细胞进行转染，最后在第4天以1:2的比例在6孔板中进行转染。在第5天采集细胞进行RNA和薄层色谱分析。
使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Chatsworth，CA）和柱上DNA酶处理分离RNA分离、cDNA合成和定量实时PCR总RNA。使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen），用0.5μg总RNA合成cDNA。根据制造商的说明，使用FastStart Universal SYBR Green Master混合物（德国曼海姆罗氏）在StepOnePlus实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行定量PCR。基因表达水平归一化为Gapdh。引物序列为：Tet1正向5'-GAGCCTGTCCTCGATGTGG-3'，Tet1反向5'-CAACCACTGGC TGTT-3'；Gapdh前5’-GTGTTCCTACCCAATG TGT-3’，Gapdh后5’-ATTGTCATACCAGAAATGTT-3’。
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指南：ABF97214-2D1A-432B-987-A8F6093666A3

摘要

DNA胞嘧啶甲基化对逆转录转座子沉默和哺乳动物发育至关重要。在计算搜索可修饰5-甲基胞嘧啶（5mC）的酶的过程中，我们确定TET蛋白是锥虫蛋白JBP1和JBP2的哺乳动物同源物，它们被提议氧化胸腺嘧啶的5-甲基。我们在此表明，TET1是急性髓系白血病MLL基因的融合伙伴，是一种2-氧戊二酸（2OG）和铁（II）依赖酶，在培养细胞和体外催化5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶（hmC）。hmC存在于小鼠胚胎干细胞的基因组中，在RNA干扰介导的TET1缺失后，hmC水平降低。因此，TET蛋白通过将5mC修饰为hmC在表观遗传调控中具有潜在作用。

5-甲基胞嘧啶（5mC）是哺乳动物DNA中的一个小碱基：它占所有DNA碱基的～1%，几乎完全是二核苷酸CpG的对称甲基化(1). 大多数甲基化的CpG存在于重复的DNA元件中，这表明胞嘧啶甲基化是为了防御转座子和其他寄生元件而进化的(2). 甲基化模式在早期胚胎发生中动态变化，此时CpG甲基化对印迹基因的X失活和不对称表达至关重要(三). 在体细胞中，启动子甲基化通常与基因表达相关：CpG甲基化可能直接干扰某些转录调节物与其同源DNA序列的结合，或可能导致甲基-CpG结合蛋白的招募，从而产生受抑制的染色质环境(4). DNA甲基化模式在癌症中高度失调：甲基化状态的改变被假定为灭活肿瘤抑制因子和激活癌基因，从而促进肿瘤发生(5).

锥虫含有碱基J（β-d日-葡糖基羟甲基尿嘧啶），一种通过胸腺嘧啶甲基的顺序羟基化和葡糖基化产生的修饰胸腺嘧啶(图S1A) (6). J生物合成需要JBP1和JBP2，据预测，这是2OG和Fe（II）依赖的氧化酶超家族的酶，可以催化J生物合成的第一步(7,8). 与5-甲基胞嘧啶一样，碱基J与基因沉默有关联：它存在于编码可变表面糖蛋白（VSG）的基因的沉默拷贝中，该蛋白负责宿主的抗原变异，但在单一表达拷贝中不存在(6). 我们对JBP1和JBP2的同源物进行了计算搜索，以期鉴定修饰5mC的哺乳动物酶。

使用JBP1和JBP2的预测加氧酶结构域进行迭代序列图谱搜索，在后生动物中发现的三种同源人类蛋白TET1、TET2和TET3及其同源序列中恢复同源区域(e（电子）< 10⁻⁵)以及真菌和藻类中的同源结构域(图S2和SOM文本). 二级结构预测表明存在一个N端α螺旋，随后是一系列连续的β链，这是2OG-Fe（II）加氧酶的典型双链β螺旋（DSBH）折叠(图S3) (9). 多序列比对表明，新的TET/JBP家族显示了2OG-Fe（II）加氧酶的所有典型特征，包括对辅因子Fe（II）和2OG的协调重要的残基的保存(图S3和SOM文本). 后生动物TET蛋白包含一个独特的富含半胱氨酸的保守区域，与DSBH区域的N末端相连(图1A和SOM文本）。脊椎动物TET1和TET3及其来自所有其他动物的直系同源物也具有CXXC结构域，这是一个双核Zn相关结构域，存在于几种染色质相关蛋白中，在某些情况下已被证明可以区分甲基化和非甲基化DNA(10).

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图1

TET1在HEK293细胞中的表达导致5mC染色减少。(A类)人类TET1的预测结构域显示CXXC型锌结合结构域（氨基酸584-624）；富含半胱氨酸的区域（富含半胱酶）（氨基酸1418至1610）；DSBH结构域（氨基酸1611至2074）；和三个二分核定位序列（NLS）。(B类)过度表达野生型或突变型HA-TET1的HEK293细胞与HA表位（绿色）和5mC（红色）特异性抗体共染。为了便于读者阅读，一些HA-表达单元被圈出。比例尺，10μm。(C类)在单个细胞核中测量HA和5mC的染色强度。HA-TET1表达细胞群的数据以点图（红色）的形式呈现，叠加在模拟转染细胞的点图（蓝色）上，每个点代表一个单独的细胞。(D类)HA-阳性细胞与模拟转染细胞的5mC染色强度的量化（设置为1）。所示数据为平均值±SEM，代表了三个实验。

作为确定TET蛋白是否在5mC上发挥作用的第一步，我们用全长血凝素（HA）标记的TET1转染人胚胎肾（HEK）293细胞，然后对转染的细胞进行5mC和HA表位染色。模拟转染细胞在5mC染色强度方面表现出显著差异(图S4;图1B，顶部面板；在中量化图1C)这可能是因为5mC水平因细胞而异，也可能是因为技术因素（例如DNA不完全变性）导致抗体对5mC的可及性因细胞而致不同。转染野生型TET1的细胞显示HA阳性与5mC染色减少密切相关，两者均可见(图1B，中间面板）和量化(图1C、左侧面板和图1D). 未转染的HA低细胞显示出与模拟转染细胞相似的5mC染色强度的扩散(图1C，左侧面板；注意低HA强度下红点和蓝点重叠），而高效转染的高HA细胞显示均匀低的5mC染色强度(图1C，左侧面板，红色HA-高圆点）。用携带H1671Y、D1673A取代的突变TET1转染的细胞预测会损害Fe（II）结合，但在5mC内未显示染色减少(图1B，底部面板；图1C，右侧面板；和图1D).

为了定量地确定TET1过度表达是否影响细胞内5mC水平，我们测量了表达全长TET1（TET1-FL）或TET1[TET1-CD的预测催化结构域的细胞中基因组CpG位点子集的5mC与C的比率，该催化结构域包括富含Cys（C）和DSBH（D）区域；图1A]. 用质粒瞬时转染HEK293细胞，其中TET1表达与来自内部核糖体进入位点（IRES）的人CD25表达偶联。用MspI消化CD25-表达细胞的基因组DNA，无论第二个C是否甲基化，MspI都会裂解序列为C^CGG的DNA。所得片段的5′端来自二核苷酸CpG，含有C或5mC，对其进行末端标记和消化，得到5′磷酸化dNMP，并使用薄层色谱（TLC）进行解析(图2A) (11).

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图2

TET1-过表达细胞的基因组DNA在二核苷酸CG中包含一个修饰的核苷酸。(A类)实验设计说明。(B类到F类)从过度表达TET1的HEK293细胞中纯化基因组DNA，并用[（B）和（C）]MspI、（D）HpaII或[（E）和（F）]Taq切割^αI.对片段进行末端标记，消化至5′dNMP，并通过TLC进行解析。修饰的核苷酸（随后被识别为hm-dCMP）用？表示？。用HpaII消化DNA时，未观察到5m-dCMP或修饰核苷酸。[（C）和（F）]量化dCMP、5m-dCMP和修饰核苷酸的相对丰度。显示的数据是三个独立转染的平均值±SD，并且至少代表三个实验。

来自转染对照载体细胞的MspI-digested DNA主要产生dCMP和5m-dCMP(图2B而来自表达野生型TET1-FL或TET1-CD的细胞的DNA产生了额外的未知标记物种，迁移速度比dCMP慢（“？”图2B，车道2和4）。用HpaII（MspI的甲基化离子敏感异裂殖体）消化DNA时，没有检测到这种新物种(图2D)但在用Taq消化DNA时可以清楚地观察到^α一、一种甲基化敏感酶，以不同序列切割，T^CGA(图2E). 在MspI-或Taq中未观察到新物种^α突变TET1-FL或TET1-CD转染细胞的I-消化DNA(图2、B和E其出现与5m-dCMP丰度降低有关(图2、B和E，2号和4号车道；量化于图2、C和F). 在所有实验中，野生型TET1-CD的表达与dCMP丰度的微小但显著增加相关(图2、C和F). 这些结果表明，这些未经鉴定的物种是通过修饰5m-dCMP而获得的，可能是5mC向C被动或主动转化的中间产物。

我们使用高分辨率质谱（MS）鉴定新核苷酸。基因组DNA由过表达野生型或突变型TET1-CD的HEK293细胞制备(米/z)336.0582，与C的分子式一致₁₀H（H）₁₅不₈P（P）^–是唯一在TLC上预期位置迁移的物种，野生型和突变型样品之间的丰度差异很大（约为19倍）(图3，A和B). 基于此结果，我们的计算分析和图2，我们假设未鉴定的物种是5-羟甲基胞嘧啶（hmC），由TET1通过5mC的甲基羟基化产生(图S1). 作为标准，我们从生长于大肠杆菌ER1656，一株葡萄糖供体分子UDP-葡萄糖（缩写为T4*DNA）缺乏的菌株(12). TLC分析表明，表达TET1-CD的未分类细胞中产生的新核苷酸与T4*DNA中的hm-dCMP迁移相似(图3A). 串联质谱（MS-MS）在正负离子模式下的几种碰撞能量（15和25V）下的裂解实验证实，336.0582道尔顿离子的裂解模式与hm-dCMP的裂解模式相同(图3C和图S5).

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图3

经修饰的核苷酸被鉴定为5-羟甲基胞嘧啶。(A类)在缺乏UDP-葡萄糖的环境中生长的T4噬菌体基因组DNA大肠杆菌用Taq消化转染野生型或突变型TET1-CD的ER1656（T4*）和HEK293细胞^αI.对片段进行末端标记，消化成单核苷酸，并通过TLC进行分离。TET1-CD表达细胞中存在的修饰核苷酸迁移类似于真实的hm-dCMP。(B类)表达野生型（wt）或突变型（mut）TET1-CD的细胞基因组DNA中Rf=0.29的液相色谱-电喷雾电离质谱离子的比较米/z与突变样本相比，野生型样本中=336.06的丰度为18.5倍。(C类)真实hm-dCMP（顶部）的质谱裂解（MS/MS）分析，以及米/z=从表达TET1-CD的细胞中分离出336.06种（底部）。预期米/z数值以红色显示；观察米/z数值以黑色显示（预期质量精度在0.002 Da以内）。

为了确定TET1直接负责hmC的产生，我们在Sf9昆虫细胞中表达了Flag-HA标记的野生型和突变型TET1-CD，将重组蛋白纯化至接近同质性(图S6A)，并测定其对完全甲基化的双链DNA寡核苷酸的催化活性。野生型，但非突变型，TET1-CD催化5mC到hmC的稳健转化，并显示对Fe（II）和2OG的绝对需求(图4A; 在中量化图4B). 省略抗坏血酸不会导致催化活性显著降低，很可能是因为我们在反应中加入了二硫苏糖醇，以抵消TET1-CD氧化的强烈倾向(图S6、A至D) (13-15). 重组TET1-CD对5mC具有特异性：我们没有检测到胸腺嘧啶转化为氢甲基尿嘧啶（hmU）(图S7).

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图4

从Sf9细胞纯化的重组Flag-HA-TET1-CD在体外将甲基化DNA寡核苷酸中的5mC转化为hmC。(A类)含有完全甲基化Taq的双标记DNA寡核苷酸^αI位点用wt或mut-Flag-HA-TET1-CD培养（酶底物比1:10）。用Taq消化回收的寡核苷酸^α并通过TLC进行分析。每条通道中微弱的dCMP斑点来自于基板每条链的5′端C的末端标记。(B类)5mC转化为hmC的程度显示为平均比值[hmC/（hmC+5mC）]±SD(C类)使用wt或mut Flag-HA-TET1-CD培养产生的产品中Rf为0.29的物种的比较(D类)真实hm-dCMP（顶部）和Flag-HA-TET1-CD生成的核苷酸的MS片段分析（底部）。观察到的质量以黑色显示（质量精度在0.002 Da以内）。(电子)重组Flag-HA-TET1-CD能够在完全甲基化（完全，泳道5和6）和半甲基化（半甲基，泳道3和4）底物中羟基化5mC。Unme，非甲基化DNA寡核苷酸（通道1和2）。

和以前一样，我们使用高分辨率质谱证明，在米/z在比较与野生型和突变蛋白孵育的底物时，336.0582个物种是唯一在预期位置迁移的物种，其丰度差异显著（相差35倍(图4C). MS-MS实验证实，重组TET1-CD产生的物种在未糖基化T4 DNA中的片段模式与真实hm-dCMP相同(图4D). TET1-CD也能将半甲基化双链DNA中的5mC氧化为hmC(图4E).

我们询问hmC是否是哺乳动物DNA的生理成分。使用TLC分析，我们在小鼠胚胎干细胞（ES）中观察到一个与标记的hmC相对应的清晰斑点，但在先前激活的人类T细胞或小鼠树突状细胞中没有观察到(图5A). 多个实验的量化表明，在ES细胞MspI裂解位点（C^CGG）的所有胞嘧啶物种中，hmC和5mC分别占4~6%和55~60%(图5A). 与未分化ES细胞中观察到的Tet1 mRNA水平相比，白血病抑制因子（LIF）停药5天后，Tet1的mRNA水平下降了80%(图5B); 同时，hmC水平从总C物种的4.4%降至2.6%，比对照水平下降了约40%(图5C). 这种差异可能是由于其他Tet家族蛋白的代偿活性所致。类似地，RNA干扰（RNAi）介导的内源性Tet1缺失导致Tet1 mRNA水平下降87%，hmC水平下降～40%(图5、D和E). 同样，这种差异可能是由于存在Tet2和Tet3，它们都在ES细胞中表达。

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图5

hmC存在于ES细胞DNA中，其丰度随着分化或Tet1缺失而降低。(A类)（左）TLC显示在未分化ES细胞的基因组中检测到hmC，而不是树突状细胞或T细胞。（右）通过磷光成像仪定量未分化ES细胞基因组DNA中5mC、C和hmC的相对丰度。(B类)通过停用LIF 5天诱导分化的ES细胞中Tet1 mRNA水平下降约80%。(C类)相同分化的ES细胞hmC水平下降约40%。(D类)使用两种针对Tet1的不同RNAi双工体转染ES细胞可使Tet1 mRNA水平降低约75%。(电子)相同的Tet1-depleted ES细胞的hmC水平下降了约40%。所示数据为平均值±SD，代表2到3个实验。

总之，这些数据有力地支持了以下假设：Tet1和潜在的其他Tet家族成员负责生理条件下ES细胞中hmC的生成(图S8A). CpG二核苷酸是小鼠基因组中所有二核苷酸的～0.8%(16); 因此，hmC（构成位于MspI裂解位点的CpG二核苷酸中所有胞嘧啶物种的～4%）是所有碱基的～0.032%（每3000个核苷酸中～1个，或～2×10⁶每个单倍体基因组的碱基）。相比之下，5mC是MspI裂解位点CpG二核苷酸中所有胞嘧啶的55-60%(图5A)，约为hmC的14倍（hmC可能不限于CpG）（SOM文本）。一个重要的问题是hmC和TET蛋白是否定位于ES细胞DNA的特定区域，例如，参与维持多能性的基因或在分化时准备表达的基因。要充分认识hmC的生物学重要性，需要开发工具，明确区分hmC、5mC和C（SOM文本）。

作为一种潜在的稳定碱基（SOM-Text），hmC可能通过募集选择性hmC结合蛋白或排除通常识别5mC的甲基CpG结合蛋白（MBPs）来影响染色质结构和局部转录活性，从而取代MBPs募集的染色质修饰复合物(图S8B，中间）。事实上，已经证明甲基结合蛋白MeCP2不能识别hmC(17). 或者，通过排除维持DNA甲基转移酶DNMT1，5mC转化为hmC可能有助于被动DNA去甲基化，因为DNMT1对hmC的识别能力较差(图S8B，左）(18). 即使维持甲基化的保真度略有降低，也会导致CpG甲基化在许多细胞周期过程中呈指数下降。最后，hmC可能是活性DNA去甲基化途径的中间产物(图S8B，右侧）。在光氧化实验中，hmC通过甲醛的损失而产生胞嘧啶(19)在高pH值下(20,21)这为hmC在细胞中在特定条件下转化为胞嘧啶提供了可能性。一种相关的可能性是特定的DNA修复机制用C取代hmC或其衍生物(22,23). 为了支持这一假设，在牛胸腺提取物中报道了hmC特异的糖苷酶活性(24). 此外，一些DNA糖基化酶，包括TDG和MBD4，都与DNA去甲基化有关，尽管它们中没有一个在体外5mC酶分析中表现出令人信服的活性(25-27). 胞嘧啶脱氨基也与DNA去甲基化有关(26-28); 在这种情况下，hmC脱氨基产生hmU，成纤维细胞提取物中的hmU:G糖苷酶活性较高(29).

这些研究改变了我们对哺乳动物细胞中胞嘧啶甲基化如何调控的认识。值得注意的是技术工程师1和TET2测试遗传位点已被报道与血液恶性肿瘤相关（SOM-Text）。融合了技术工程师1组蛋白甲基转移酶MLL公司已在几个与t（10；11）（q22；q23）易位相关的急性髓细胞白血病（AML）病例中发现(30,31). 纯合子零突变和染色体缺失涉及TET2测试在骨髓增生性疾病中发现了该位点，提示TET2具有肿瘤抑制功能(32,33). 检测TET蛋白和hmC在致癌转化和恶性进展中的参与将非常重要。

补充材料

1

支持的在线材料

MLL合作伙伴TET1将哺乳动物DNA中的5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶

Mamta Tahiliani、Kian Peng Koh、Yinghua Shen、William A.Pastor、Hozefa Bandukwala、Yevgeny Brudno、Suneet Agarwal、Lakshminarayan M.Iyer、David R.Liu、*L.Aravind、*Anjana Rao*

*信件应寄给谁。电子邮件：ude.dravrah.idi@oara（A.R.）；vog.hin.mln.ibcn@德尼瓦拉（洛杉矶）；ude.dravrah.saf@uilrd公司（D.L.）

2009年4月16日发布于科学类快递DOI:10.1126/science.1170116

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材料和方法

SOM文本

图S1至S8

工具书类

补充文本

具有预测5-甲基嘧啶氧化酶活性的2OG-Fe（II）加氧酶新家族的鉴定。为了确定催化5-甲基胞嘧啶氧化修饰的候选酶，我们创建了已知2OG-Fe（II）加氧酶的位置特异性评分矩阵（图谱），其中包括JBP1和JBP2的预测加氧酶域(图S1). 我们使用此配置文件通过PSI-BLAST程序对非冗余数据库进行系统搜索(1). 这项研究从Cooper和Nigel噬菌体的gp2蛋白中恢复了同源结构域，并从弗兰克氏菌基因组（e<10⁻⁴). 然后，我们生成了一个包含gp2蛋白序列的新图谱，并对环境样品中微生物的蛋白质序列数据库进行了第二次搜索。这项研究检测到许多可能来自未培养的海洋噬菌体和原噬菌体的同源蛋白。进一步搜索非冗余数据库，将环境序列中新检测到的蛋白质添加到图谱中，恢复了后生动物中发现的三个同源人类致癌基因TET1（CXXC6）、TET2和TET3的同源区域及其同源序列（e<10⁻⁵). 真菌和藻类中也发现同源结构域。在PSI-BLAST搜索中，在恢复2OG-Fe（II）加氧酶超家族的任何其他成员之前，这些同源结构域组始终彼此恢复，这表明它们构成了一个独特的家族（LM Iyer、L Aravind、，手稿正在准备中).

为了确认新鉴定的蛋白质（以下称为TET/JBP家族；参见图1图例）与经典2OG-Fe（II）加氧酶的关系，我们制备了它们共享的保守结构域的多重比对，并使用该比对生成隐马尔可夫模型（HMM）。该HMM与使用HHpred程序从蛋白质数据库（PDB）中为所有结构特征化域生成的HMM库的profile-profile比较(2)导致脯氨酰羟化酶恢复（e<10⁻¹²)是2OG-Fe（II）加氧酶超家族的典型成员，最受欢迎。二级结构预测表明存在一个N端α-螺旋，随后是一系列连续的β-链，这是典型的2OG-Fe（II）加氧酶的双链β-螺旋（DSBH）折叠(图1A,底部) (三). 多序列比对(图1A)进一步表明，新的TET/JBP家族显示了2OG-Fe（II）加氧酶的所有典型特征，包括：（i）HxD特征，正好位于螯合Fe（II）的N端β链下游（x是任何氨基酸）；（ii）HxD基序下游紧邻链的开始处的一个小残基，通常是甘氨酸，这有助于定位活性位点精氨酸；（iii）C末端部分的Hxs基序（其中s是一个小残基），其中H螯合Fe（II），小残基有助于结合2-氧代酸；（iv）处方₅上述基序下游的标记（其中a是芳香残基）–该基序中的R与2-氧代酸形成盐桥，芳香残基有助于定位第一个金属相关组氨酸（关键残基在图1A). 这些观察强烈表明，TET/JBP家族的成员，包括TET1、2和3，是催化活性的2OG-Fe（II）加氧酶。

此外，后生动物TET蛋白含有一个独特的富含半胱氨酸的保守区域，与DSBH区域的N末端相连，该区域至少含有八个保守半胱氨酸和一个可能构成双核金属簇的组氨酸(图1A,顶部). 脊椎动物TET1和TET3及其所有其他动物的直系同源物也具有CXXC结构域，这是一个双核Zn相关结构域，具有八个保守的半胱氨酸和一个组氨酸，位于2OG-Fe（II）加氧酶结构域的N末端（如图所示图1B). 对CXXC结构域蛋白质结构的分析表明，CXXC域是一个辅助的DNA结合域，它往往与具有不同染色质修饰和修饰识别活性的多种结构域结合在同一多肽中。CXXC结构域存在于几种染色质相关蛋白中，包括甲基-DNA结合蛋白MBD1、组蛋白甲基转移酶MLL、DNA甲基转移酶DNMT1(4)以及赖氨酸脱甲基酶KDM2A（JHDM1A/FBXL11）和KDM2B（JHDM2B/FBLX10，其也包含泛素E3连接酶结构域）(5)，在某些情况下已被证明可以区分甲基化和非甲基化DNA(6).

综合起来，从这些结构域和噬菌体成员的基因邻域中收集到的上下文信息(补充信息)支持整个TET/JBP家族的保守DNA修饰功能，即5-甲基嘧啶的氧化。在这项研究中，我们测试了TET蛋白可能在5mC下工作以催化甲基的氧化或氧化去除的特定假设，重点是TET1作为TET/JBP家族的哺乳动物例子。

hmC可能不限于CpG。最近邻区分析表明，ES细胞中总5mC的15−20%存在于CpT、CpA和（在较小程度上）CpC序列中；相反，体细胞组织的非CpG甲基化可以忽略不计(7).

以往关于hmC的研究。除了两篇报道基因组DNA中高水平hmC的论文外(8)，大多数以前的研究都将hmC描述为一种罕见的碱，可能是5mC的氧化产物(9, 10).

hmC、5mC和C的识别方法我们在此表明，三种最常用技术中的两种无法充分区分C、5mC和hmC。免疫细胞化学法显示，一种广泛使用的鼠抗5mC单克隆抗体显然不能识别hmC(图2A)因此，仅基于该抗体的使用，重新评估以前关于DNA去甲基化的报告将非常重要。类似地，甲基化敏感的限制性内切酶HpaII不能切割hmC(图3D)如前所述(11)，增加了在某些情况下hmC修饰的DNA被错误判断为甲基化的可能性。另一种甲基化敏感的限制性内切酶，McrBC，已知可以同等地切割含有5mC和hmC的DNA(12)，因此也不允许区分这两个核苷酸。

亚硫酸氢盐修饰分析如何解释DNA中hmC的存在尚待确定。用亚硫酸氢钠处理DNA可促进胞嘧啶自发脱氨基为尿嘧啶，而不影响5mC；测序后对感兴趣序列进行扩增，可以确定给定序列的精确甲基化模式(13). 众所周知，亚硫酸氢盐在C5处与hmC快速反应，形成稳定的5-亚甲基磺酸胞嘧啶加合物，该加合物不易脱氨基(14). 该被取代物种有望形成类似于胞嘧啶形成的碱基对，在扩增步骤中，聚合酶可将其解读为C，从而将该序列解释为含有5mC。或者，聚合酶可能无法有效复制5-亚甲基磺酸胞嘧啶，在这种情况下，含有该加合物的DNA将无法有效扩增，而含有原始hmC修饰的序列在扩增的DNA中表现不足。

hmC对氮键羟甲基的稳定性。T-偶噬菌体基因组中hmC的稳定性(15)与DNA修复酶AlkB和JmjC结构域组蛋白去甲基化酶（也是2OG和Fe（II）依赖性加氧酶）生成的N-连接羟甲基加合物的不稳定性形成对比。这些氮连接的加合物自发分解，产生未甲基化的氨基和甲醛(16); 相反，JBP1/2和胸腺嘧啶羟化酶对碳链甲基的氧化不会导致通过氧化去除甲基加合物(17, 18). 这种差异是由于碳的离开基团比氮差得多，这解释了我们检测基因组DNA中hmC的能力。

DNA去甲基化机制哺乳动物DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B建立并维持DNA甲基化模式(19, 20). 通过连续的复制循环防止维持甲基化逐渐稀释甲基标记并导致“被动”DNA去甲基化(21). “活性”（复制无关）DNA去甲基化仅在受精后不久的父系基因组中得到了令人信服的证明(22−24); 潜在的机制可能涉及连接甲基和嘧啶的碳-碳键在热力学上不利的断裂，导致甲基部分的释放，或一种类似修复的过程，其中甲基化的碱基或核苷酸被切除，然后对病变进行修复，以用非甲基化的C取代原来的5mC（参见(25, 26)). 后一种机制发生在植物中，DEMETER是一种限制在开花植物中的双功能糖苷酶，它能裂解5mC的糖苷键，并通过碱交换修复刺激非甲基化C的插入(27). 多种候选哺乳动物脱甲基酶活性已被描述，但不幸的是，这些报告均未被其他实验室证实（参见(19, 28−30)).

TET蛋白在癌症中的作用人类LCX（具有CXXC结构域的白血病相关蛋白）/Tet1（十级易位-1）基因最初被定义为儿童和成人急性髓性白血病患者t（10；11）（q22；23）的新型MLL融合伙伴(4, 31). 在最近的一项研究中，MLL/Tet1融合占MLL相关白血病的3/759（0.4%）(32)两例急性淋巴细胞白血病，同时显示儿童和成人急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病均发生MLL/Tet1融合。MLL/Tet1融合的可能致病机制包括改变Tet1催化活性的基因组靶向性和/或干扰辅助因子向Tet-1介导的hmC生成位点的募集。最近约有14%的患者出现纯合Tet2缺失/功能缺失突变JAK2号机组V617F阳性和阴性骨髓增生性肿瘤（包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原代性骨髓纤维化（MF）、PV后MF、ET后MF和爆发期PV/ET/MF）(33, 34); 大约29%的系统性肥大细胞增多症患者(35); 以及其他髓系恶性肿瘤，包括慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病(36, 37). 研究Tet2功能丧失、表观遗传学改变（如以骨髓增生性肿瘤为特征的启动子高甲基化）和表观遗传学治疗反应之间的关系将是很有趣的(38).

图S1。5-甲基嘧啶的修饰。（A）锥虫基因组中含有一种改良的胸腺嘧啶，称为碱基J（β-D-葡萄糖基羟甲基尿嘧啶）。有人提出J碱是通过胸腺嘧啶甲基的顺序羟基化和葡萄糖基化合成的(17).（B）TET1，可能还有其他TET家族成员，氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基基团，生成5-羟甲基胞嘧啶。

图S2。用于生成职位特定得分矩阵（PSSM）的序列。该图显示了用于创建位置特定评分矩阵的序列，该矩阵在PSI-BLAST程序的搜索中检索TET蛋白。每个序列都由允许从GenBank数据库中恢复的gi编号标识，排列两侧的编号提供了序列中对齐区域的限制。动质体中的JBP蛋白标记为红色。搜索使用检查点开始选项–B进行，将–h设置为0.01，将–F设置为F，所有JBP序列通过–i选项循环进行单个搜索。

图S3。TET/JBP家族和具有代表性的2OG-Fe（II）依赖性双加氧酶结构域的多序列比对。富含半胱氨酸的区域（C）和核心催化结构域（D）分别排列。蛋白质由基因名称和物种标记，用下划线分隔。95%的一致性是根据TET/JBP蛋白的更大比对计算得出的。TET特异性C末端链的一致性是从后生动物TET同源物的更大比对中单独计算出来的。除了TET/JBP家族外，该序列还包含双氧酶超家族的结构特征代表，即衣原体脯氨酰羟化酶（P4H）和大肠杆菌AlkB（2FD8）及其PDB代码。

图S4。使用CellProfiler进行图像分析使用IdentifyPrimAutomatic模块基于DAPI荧光勾勒出细胞核，并表示为outlined Nuclei。预设直径范围为10−35像素单位的对象轮廓为绿色，并包含在分析中。范围外的对象（包括单元簇）以及接触边界的对象以红色勾勒出来，并从分析中排除。为了解释核边界的HA染色，添加了IdentifySecondary模块，将核轮廓扩展2个像素，表示为ExpandedNuclei outlines。然后使用MeasureObjectIntensity模块将ExpandedNuclei Outlines应用于相应的HA图像，将Outlined Nuclei应用于相应的5mC图像（未显示），以分别测量HA和5mC染色的像素强度。像素数显示在图像的轴上，图像是以20倍的放大倍数拍摄的。

图S5。来自T4*噬菌体的真实hm-dCMP的质谱裂解分析（MS/MS）(顶部)以及过度表达TET1-CD的HEK293细胞基因组DNA中存在的未知核苷酸物种(底部).（A）在负离子模式下进行MS/MS分析，碰撞能量为25V。（B）在正离子模式下进行了MS/MS分析，碰撞能量为25 V。显示了观察到的质量（预期质量精度在0.003 Da以内）。

图S6。Sf9细胞重组Flag-HA-TET1-CD的纯化及TET1-CD片段的鉴定。（A）考马斯染色的野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD SDS-PAGE凝胶，通过亲和层析和抗Flag抗体结合珠从Sf9细胞纯化到接近同质性。将已知量的BSA加载到同一凝胶上进行比较。野生型和突变型TET1-CD（箭头所示为79 KDa）都表现出强烈的氧化倾向，并形成二硫键二聚体（158 KDa）和高阶多聚体，这些多聚体对DTT具有抗性。星号表示免疫印迹检测不到的降解产物（参见（B）)可能是由于N-末端Flag-HA表位标签的丢失。（B）用抗HA抗体免疫印迹法鉴定表观高分子量条带为TET1氧化产物。（C）用抗Flag抗体进行的免疫印迹显示，随着裂解物处理时间的增加以及同时暴露于氧化条件下，多聚物形成的TET1-CD增加。在含有10 mM DTT的RIPA缓冲液中进行20分钟的裂解，可检测到TET1-CD二聚体的存在（通道1）。当来自Flag-HA-TET1-CD过度表达细胞的细胞颗粒直接在含有700 mMβ-ME的变性莱姆利SDS样品缓冲液中溶解时，未检测到该二聚体（通道3）。TET1-CD氧化的趋势似乎至少部分是由于富Cys-区域（C）形成了二硫键，该区域是DSBH（D）区域（通道2、4）的N末端。在RIPA缓冲液或SDS样品缓冲液中提取后，去除N-末端富含Cys-区域导致表达一种蛋白质（Flag-HA-TET1-D），该蛋白质在其预期分子量（57.6 KDa）下运行。中显示的数据（A-C）表明萃取过程中形成了抗还原剂的分子间二硫键。（D）在HEK293细胞中过度表达Flag-HA-TET1-CD，而不是Flag-HA-TET1-D，导致抗5mC抗体染色减少。

图S7。从Sf9细胞纯化的重组Flag-HA-TET1-CD不能将胸腺嘧啶（另一种5-甲基嘧啶）转化为hmU在体外（A）合成的双链DNA寡核苷酸，含有完全甲基化的Taq^αI（T）^^米CGA）或SalI（G^TCGAC）位点与纯化的Flag-HA-TET1-CD或突变的Flag-HA-TET1-CD在37℃（酶与底物的比例为1:10）孵育5小时。（B）用Taq消化回收的寡核苷酸^αI或SalI，末端标记，水解为dNMP，并使用TLC进行解析。TET1-CD能够羟基化5mC，但在双链寡核苷酸底物中SalI位点的背景下不能作用于胸腺嘧啶在体外将终止于hmU的双链DNA寡核苷酸进行末端标记和水解，以生成hm-dUMP迁移的标准（通道5）。SalI已被证明可切割G（hmU）CGAC，相当于GTCGAC(39).

图S8。模型推测hmC的生物学作用及其作为DNA去甲基化中间产物的潜力。（A）将hmC整合到已知的DNA甲基化和被动复制依赖性去甲基化途径中。已知路径以黑色显示，本研究的新发现以红色显示。虚线和问号用于指示可能存在但尚未实验确定的路径。（B）涉及hmC的潜在生物学机制。hmC可能招募特异性结合蛋白；5mC转化为hmC可能取代DNA中的甲基结合蛋白(中心). hmC也可能是促进被动DNA去甲基化的中间产物：半甲基化DNA中5mC转化为hmC可能会干扰DNMT1和相关SRA域蛋白的识别(左边). 最后，hmC可以通过自发或酶过程转化为胞嘧啶，也可以被特定细胞类型中的特殊DNA修复蛋白识别，因此在活性DNA去甲基化中起到中间产物的作用(正确的).

方法

计算和生物信息分析使用PSI-BLAST程序搜索蛋白质序列的非冗余（NR）数据库（国家生物技术信息中心，NIH，Bethesda）(1). 使用PSI-BLAST程序进行的配置文件搜索使用单个序列或使用PSSM作为查询的序列，配置文件包含期望值（E）阈值为0.01，并进行迭代，直到收敛(1). 对于所有成分偏向的查询，在PSI-BLAST搜索中使用基于成分的统计数据进行校正(40). 使用Kalign程序建造了多条路线(41)，然后根据PSI-BLAST结果进行手动校正。多重对齐用于使用HMMER包的Hmbuild程序创建HMM(42). 然后使用Hmmcaliberate对其进行优化，并使用HMMER软件包的Hmmsearch程序搜索完整测序基因组的数据库(42). 使用HHpred程序执行配置文件搜索(2, 43). JPRED计划(44)COILS程序用于预测二级结构。使用SEG程序预测球状结构域，参数如下：窗口大小40，触发复杂度=3.4；扩展复杂性=3.75(45).

瑞士PDB查看器(46)和Pymol程序用于对PDB文件进行操作。以tblastn对染色体的搜索为指导，使用NCBI Splign程序重建外显子-内显子边界。基因邻域是使用一个自定义脚本来确定的，该脚本使用完全测序的基因组或全基因组枪序列来推导以查询基因为中心的基因邻域表。然后使用BLASTCLUST程序对邻域中的产品进行聚类，并建立保守的共现基因。然后，根据至少一个其他系统发育上不同的谱系（NCBI分类学数据库中的“门”）中的发生情况，按照排名方案对这些保守的基因邻域进行分类，在特定谱系（“门”染色体上的物理紧密性表明调控−10和−35元素的共享。用MEGA4软件包构建系统发生树。

TET1表达质粒从SY5Y cDNA和人克隆中扩增TET1 ORF，并将其插入Flag HA标记的pOZ-N的XhoI和NotI位点。使用QuikChange诱变试剂盒（Stratagene）产生突变体TET1（H1671D，Y1673A）。所有克隆的序列均通过常规DNA测序进行了确认。扩增野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD并克隆到pEF1（Invitrogen）的Acc651和XbaI位点。扩增pOZ-N的IRES-CD25并克隆到Flag-HA-TET1-CD-pEF1的XbaI和BstB1位点。从Flag-HA-TET1-CD-pOZ中扩增出野生型和突变型Flag-HA-TET1-CD，并插入pFastBac（Invitrogen）的SalI和NotI位点。

免疫细胞化学将细胞以1.5×10的比例放置在24孔板中的无菌盖玻片上⁵使用pEF1-TET1表达结构或空载体（模拟）瞬时转染前，细胞/孔和隔夜生长变速箱IT™-293转染试剂（Mirus，Madison，WI）符合制造商的说明。转染后42−44小时，将细胞在PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下用PBS中的0.2%Triton X-100透化15分钟。为了检测5-甲基胞嘧啶，在室温下用2N HCl处理细胞30分钟，然后用100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中和10分钟。在PBS中进行广泛清洗后，细胞在1%BSA和0.05%吐温20的PBS中在室温下被封闭1小时。兔抗HA多克隆抗体（1:400稀释；加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）和小鼠抗5甲基胞嘧啶克隆162 33 D3抗体（1:2500−3000稀释；加州圣地亚哥Calbiochem）在室温下将其加入封闭缓冲液中2~3小时，并分别由与Cy2或Cy3偶联的二级抗体同时检测。用250 ng/ml 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对DNA进行染色，并将其固定在SlowFade®Gold抗褪色试剂（Molecular Probes，Eugene，OR）中。使用OpenLab成像软件（英国考文垂Improvision）在配备CCD摄像头的蔡司Axiover 200倒置显微镜上对图像进行数字记录。

CellProfiler™细胞图像分析。使用20倍物镜从每个转染细胞孔中拍摄三个区域，每个区域包含200−400个细胞，并在每个实验中汇总分析。灰度图像（tiff）作为三个单独的文件上传到CellProfiler上，分别用于DAPI、GFP（HA检测）和Cy3（5mC检测）三种激发波长下捕获的每个场(47). 基于DAPI染色对核轮廓进行轮廓分析，包括一个二级模块，将核轮廓再扩展2个像素（表示为“扩展核”），以解释核边界处的HA染色。排除了聚集的单元格和字段边缘的单元格。单个细胞内HA和5mC的染色强度分别作为GFP和Cy3信号的平均像素强度，在“膨胀细胞核”和原始细胞核轮廓内进行测量。原始数据绘制为每个转染样品的5mC平均像素强度与HA平均像素强度的点图。同一组模拟转染细胞显示在图1C将HA-表达细胞（任意分类为平均HA像素强度高于模拟转染细胞中观察到的最高强度的细胞）的5mC染色强度的群体平均值与模拟转染的细胞进行比较。数值是在归一化之前提取的背景值，是来自3个实验的平均值±SEM；统计比较基于ANOVA和Bonferroni的事后检验。

使用TransIT转染试剂（Mirius）将TET1-CD-IRES-CD25-pEF1载体转染并分选表达hCD25的HEK293T细胞。对照细胞（模拟细胞）转染相应的空载体，仅驱动CD25的表达。48小时后，30×10⁶细胞在1X FACS缓冲液（1XPBS，2%FBS，1mM EDTA，0。1%NaAzide）在4 C下放置30分钟。用1X FACS缓冲液清洗细胞两次。然后用抗PE微球（Miltenyi）染色25 min，4 C，然后用1X FACS缓冲液洗涤两次，然后用1 X MACS缓冲液（1X PBS，0.5%BSA，0.09%叠氮化钠和2 mM EDTA）洗涤一次。将细胞重新悬浮在2ml冰镇1X MACS缓冲液中，并使用AutoMACS细胞分选仪（Possel）对表达CD25的细胞进行分选。通过FACS分析输入、流通和收集的样品，以确认收集样品中CD25阳性细胞的富集。

使用薄层色谱法分析5mC水平，通过在1 ml NPB（240 mM蔗糖、7.5 mM Tris、pH 7.5、3.75 mM MgCl）中重新悬浮，从CD25阳性细胞中制备细胞核₂，0.75%Triton-X-100，100μg RNAseA/ml（Qiagen）），放在冰上20分钟。细胞在1300 g下旋转15分钟，4℃，然后在NPB中清洗一次。在650μl 1X LB（（10 mM Tris，pH 8.0，300 mM NaAcetate，pH 7.2，0.5%SDS，5 mM EDTA，100μg RNAseA/ml和300μg/ml蛋白酶K（Roche））中溶解细胞核，并在55℃下培养过夜。早上添加额外的300μg/ml蛋白酶K，将样品在55℃放置5小时。用等量的苯酚、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）萃取样品，然后用2体积的乙醇沉淀。基因组DNA用1ml 70%EtOH洗涤两次，干燥并重悬于10mM Tris、0.1mM EDTA、pH 8.0中，并在32℃下重悬过夜。

用100单位的MspI、HpaII或Taq消化2μg基因组DNA^α1和100μg RNaseA（Qiagen）过夜。早上额外添加100单位的限制性内切酶，并持续培养6小时。添加10单位小牛肠磷酸酶（CIP），并在37℃下培养1小时。按照制造商的说明，使用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）纯化DNA。用T4多核苷酸激酶（T4 PNK）（NEB）和10μCi的[γ^32-P] -在37℃下，ATP作用1小时。通过在-80℃下左侧添加30μg线性聚丙烯酰胺、1/10体积的3 M醋酸钠、pH值7.2和2.5体积的乙醇，沉淀标记片段1小时。样品以14000 rpm在4℃下旋转20分钟，并在25℃下用70%EtOH洗涤两次。将颗粒重新悬浮在30 mM Tris中，pH 8.9，15 mM MgCl₂，2 mM CaCl，与10μg DNaseI（Worthington）和10μg SVPD（Worthington）一起，在37℃下孵育3小时。将3μl点在纤维素TLC板（20 cm×20 cm，Merck）上，并在异丁酸中展开：H₂0:NH（新罕布什尔州）_三(66:20:1). 使用磷光成像仪Storm 860扫描仪软件通过磷光成像器扫描分析板材。其他核苷酸的低水平标记反映了DNA剪切或污染核内溶解活性。

制备用于制备hm-dCMP标准T4噬菌体库存的未葡糖基化T4噬菌体DNA的方法是在LB板上滴取10μl系列10X稀释液，在LB平板上放置100μl过夜培养物大肠杆菌将CR63倒入3 ml T4顶部琼脂中，并使其凝固。将平板在37℃下培养过夜大肠杆菌CR63外径₆₀₀用T4噬菌体的单个斑块感染0.5，并在37°C下摇晃培养，直到培养物清除（约2.5小时）。将培养物在冰上孵育10分钟，然后通过添加几滴氯仿并轻轻混合来完成裂解。如上所述滴定裂解液。

大肠杆菌ER1656在LB至OD中生长₆₀₀0.5，然后感染每个细菌0.2噬菌体，并在37°C下摇晃培养，直到培养物清除（约8小时）。。将培养物在冰上冷冻10分钟，然后通过添加1 ml氯仿完成裂解。将DNase I添加至1 mg/ml，并在4°C下培养2小时。将裂解液在12000g下于4C下离心10分钟，以形成碎片。收集上清液，并通过在23500g下离心1.5小时，在4C下对噬菌体进行造粒。将噬菌体颗粒放置在TE中过夜，以重新悬浮。使用等量的苯酚、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）提取噬菌体DNA。将提取的噬菌体DNA透析至TE过夜，更换两次缓冲液。

质谱实验。将转染TET1野生型或突变型CD或T4噬菌体的HEK293细胞的基因组DNA在大肠杆菌13656中生长，用SVPD和DNaseI水解为dNMP，并用TLC进行解析。使用Acquity UPLC/Q-TOF Premier电喷雾LC/ESI-MS系统（Waters Corp.，Milford，MA）刮取与壁面dNMP对应的斑点，用水萃取，冷冻干燥，并在水中重新悬浮，以进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析。采用Waters HSS C18色谱柱（内径1.0mm×50mm，颗粒1.8-um）进行液相色谱（LC），线性梯度为0%至50%甲醇，0.1%甲酸铵水溶液，pH 6.0。流速为0.05 mL/min，洗脱液直接注入质谱仪。质谱以连续模式记录，并转换为质心模式以生成准确的质谱。使用Masslynx 4.1软件（Waters）分析数据。

重组蛋白的表达与纯化Bacmid DNA是使用DH10Bac™生成的大肠杆菌大肠杆菌（Invitrogen）按照制造商的指示。用PCR证实转座到正确的位点。使用悬浮液适应的Sf9细胞扩增杆状病毒三代。然后用杆状病毒感染Sf9细胞4天。将所得细胞颗粒置于40 mM Tris、pH 7.4、300 mM NaCl、0.2%NP40、0.4%Triton、5 mM DTT、不含EDTA（Roche）的1X蛋白酶抑制剂中冰上30分钟，然后在12000 rpm（SLA-TC600）下30分钟，4 C。然后在4 C下将超新药与抗旗帜抗体结合珠（Invitrogen）孵育5小时。将小球在40 mM Tris、pH 7.4、300 mM NaCl、0.2%NP40、8%甘油、1X PI、5 mM DTT中洗涤4次，然后在195 mM Tris、pH 7.4、110 mM NaCl、0.14%NP40、5.8%甘油、0.37X PI、3.7mM DTD、365μg/ml Flag肽中洗脱。用SDS-PAGE、考马斯蓝染色和抗标记抗体（Sigma）免疫印迹法测定洗脱蛋白的均一性。

双链寡核苷酸底物的制备合成寡核苷酸购自IDT。所有寡核苷酸长度为35个核苷酸，修饰如下。

F： 5'-CTATACCTCTCTCCAACTTCGACTCTCCGGCG-3'

F类^我：5'-CTATACCTCCTCACTT（mC）GATCACCGTCCGGCG-3'

R： 5'-生物素-CGCCGGAGACGGTGAGAGAGAGTTGAGGAGTATAG-3'

R（右）^我：5'-生物素-CGCCGGACGGTGAT（mC）GAAGTTGAGGAGTAT AG-3’

在100 mM KAc、30 mM HEPES、pH 7.5中，将寡核苷酸退火为适当的互补寡核苷酸。将混合物煮沸5分钟，然后缓慢冷却至室温过夜。用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化双标记寡核苷酸。

体外酶分析将7.5μl重组蛋白（约3μg）与2μg寡核苷酸底物在50 mM HEPES、pH 8、50 mM NaCl、2 mM抗坏血酸、1mM 2OG、100μM FAS（Fe²⁺)用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）纯化寡核苷酸底物，然后用Taq消化^一1过夜，用CIP处理1小时，用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen）再次纯化。纯化的DNA寡核苷酸用T4多核苷酸激酶（NEB）和10μCiγ标记^32便士-在37℃下，ATP沉淀1小时。添加30μg线性聚丙烯酰胺、1/10体积的3M醋酸钠、pH 7.2和2.5体积的乙醇，然后在-80℃下培养1小时，沉淀标记的片段。样品在冷冻微型离心机中以14000 rpm的转速在4℃下旋转20分钟。用70%的EtOH洗涤两次，并在室温下旋转10分钟，以去除未结合的放射性核苷酸。将颗粒重新悬浮在10μl 30 mM Tris和15 mM MgCl中₂，2 mM CaCl，pH 8.9，加10μg DNaseI（沃辛顿）和10μg SVPD（沃辛斯顿），并在37 C下培养3小时。在纤维素TLC板（默克）上发现3μl，并在异丁酸：水：氨（66:20:1）中展开。使用磷光成像仪Storm 860扫描仪软件通过磷光成像器扫描分析板材。每条通道中微弱的dCMP斑点来自于基板每条链5'端的C末端标记。T4 PNK不能像限制性内切酶裂解产生的5'悬垂物那样有效地磷酸化钝端。

ES细胞培养将V6.5小鼠ES细胞保存在含有DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）、15%ES FBS（Omega Scientific，Tarzana，CA）和非必需氨基酸（Invit罗gen）各0.1 mM、2 mM L-谷氨酰胺（Invitro）、0.1 mMβ-巯基乙醇（Invitrougen）、，50单位/ml青霉素/链霉素（Invitrogen）和1000单位/ml ESGRO®（LIF；Chemicon）。对于所述的所有实验，在收集漂浮的ES细胞并将其重新涂敷在涂有明胶的培养皿或微孔上之前，将细胞胰蛋白酶化并在标准组织培养皿上涂敷30分钟，以去除饲养细胞。对于LIF提取分析，细胞以2−3×10的密度进行培养⁵在第二天（第0天）取出每10厘米培养皿中的细胞和LIF。如前所述进行RNA干扰（RNAi）实验(48)使用Dharmacon siGENOME siRNA双链体（Thermo Fisher Scientific Inc，Boulder，CO）对抗小鼠Tet1（目录号D-062861−01/02）。Dharmacon siGENOME非靶向siRNA#2（类别号D-001210−02）用作阴性对照。小鼠ES细胞以1×10的密度接种在明胶涂层的12孔中⁵根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen）在第二天（第0天）转染50 nM siRNA。在6孔板中，在第2天以1:4的分裂对粘附前细胞进行再感染，最后在第4天以1:2的分裂对粘附前细胞进行再感染。在第5天采集细胞进行RNA和薄层色谱分析。

使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Chatsworth，CA）和柱上DNA酶处理分离RNA分离、cDNA合成和定量实时PCR总RNA。使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen），用0.5μg总RNA合成cDNA。根据制造商的说明，使用FastStart Universal SYBR Green Master混合物（德国曼海姆罗氏）在StepOnePlus实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行定量PCR。基因表达水平归一化为Gapdh。引物序列为：Tet1正向5'-GAGCCTGTCCTCGATGTGG-3'，Tet1反向5'-CAACCACTGGC TGTT-3'；Gapdh前5’-GTGTTCCTACCCAATG TGT-3’，Gapdh后5’-ATTGTCATACCAGAAATGTT-3’。

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33Delhommeau F等人在美国血液学会年会和展览会上发表的论文；加利福尼亚州旧金山，2008年12月9日。[谷歌学者]

34我们感谢K.Kreuzer赠送T4噬菌体和大肠杆菌ER1656和CR63；Charles Richardson、Udi Qimron和Ben Beauchamp为培养T4噬菌体提供建议和帮助；梅丽莎就昆虫细胞中重组蛋白的生产提出建议；和Patrick Hogan进行了许多有益的讨论。这项工作得到了NIH拨款AI44432、青少年糖尿病研究基金会学者奖和哈佛干细胞研究所种子拨款（给a.R.）的支持；霍华德·休斯医学研究所和美国国立卫生研究院/美国国立卫生研究院（R01GM065865）资助（给D.R.L.）；美国心脏协会博士后奖学金（K.P.K.）；NIH国家医学图书馆的内部资金（分配给洛杉矶和洛杉矶）；塔塔夫人纪念博士后奖学金（H.B.）；美国国立卫生研究院授予K08 HL089150（授予S.A.）；NSF研究生奖学金（W.A.P.和Y.B.）；国防部研究生奖学金（发给W.a.P.）。

MLL合作伙伴TET1将哺乳动物DNA中的5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶

马姆塔·塔西利亚尼

Kian Peng Koh先生

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威廉·帕斯特

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苏尼特·阿加瓦尔

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L.阿拉文德

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摘要

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参考文献和注释