美国国家科学院院刊。2000年9月26日；97(20): 11074–11079.
酪氨酸的调节和定位216细胞内糖原合成酶激酶-3β的磷酸化神经元变性动物模型
1800年康科德阿斯利康制药公司神经科学部派克，威尔明顿，DE 19850-5437
约翰·霍普金斯大学学院所罗门·H·斯奈德编辑医学，马里兰州巴尔的摩，2000年7月19日批准
摘要
糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）的失活S公司9磷酸化与神经元的机制有关生存。不同位置Y的磷酸化216，上的GSK3β对其活性是必需的；然而，该网站是否可以在细胞中被调节是未知的。因此，我们检查了法规第页，共页216小鼠模型中GSK3β的磷酸化神经变性。神经生长因子退出分化PC12细胞和staurosporine处理SH-SY5Y细胞导致Y时磷酸化增加216GSK3β活性，以及细胞死亡。锂和胰岛素，可抑制GSK3β和腺病毒介导的显性阴性转导GSK3β构建物通过促凋亡药物预防细胞死亡刺激。抑制剂诱导的S9磷酸化和GSK3β失活但不影响Y216磷酸化，表明S9磷酸化是足以通过Y覆盖GSK3β激活216磷酸化。在检查的条件下，增加了Y（Y）216GSK3β的磷酸化不是自身磷酸化反应。在静息细胞中，Y216磷酸化仅限于局部粘附时存在的GSK3β地点。然而，在使用staurosporine后观察免疫定位模式Y（Y）216-磷酸化GSK3β选择性增加原子核。在大鼠体内，Y216磷酸化增加缺血引起的皮层神经元退化。综上所述，这些结果表明Y216GSK3β的磷酸化代表了细胞侮辱可以导致神经元死亡。
细胞异常死亡成人中枢神经系统被认为是其基础的关键机制几种神经退行性疾病的病理学(1，2)。生存生长因子保护神经元免受多种促凋亡物质的影响刺激，其中一种保护机制被认为是磷脂酰肌醇-3激酶信号转导的激活通路(三)。该信号通路的下游效应器是Akt磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶GSK3β的激酶S公司9使其处于非活动状态(4，5)，a建议神经元抗凋亡的机制刺激物(6——8).
第二个监管站点（Y216)，这是谎言在已在GSK3β上鉴定出催化结构域，其磷酸化对功能活动是必要的(9).蛋白酪氨酸磷酸酶去磷酸化或突变Y（Y）216在GSK3β上导致活动(9)。尚不清楚Y216是一个GSK3β自动磷酸化的位点或是否为单独的酪氨酸激酶磷酸化该位点以激活GSK3β(10).
除了在凋亡中的作用外，GSK3β微管相关蛋白τ过度磷酸化，一种机制与阿尔茨海默病的成对螺旋丝形成有关(11，12)。尽管在定义生长因子依赖途径方面取得了进展调节S的9磷酸化(13)，很少是已知GSK3β活性的调节Y（Y）216神经元磷酸化。作为第一步，我们已经确定Y216残留物GSK3β在神经退行性变模型中受到调节。我们的结果表明Y216磷酸化GSK3β在对凋亡刺激的反应中显著增加在神经细胞和大脑中。Y（Y）216-磷酸化GSK3β定位于局部凋亡刺激后破坏的粘附点并在细胞核内选择性增加。增加的Y（Y）216磷酸化不是通过自我磷酸化机制，意味着在神经元中，促凋亡刺激导致未确定的导致GSK3β磷酸化的酪氨酸激酶途径Y（Y）216及其激活。
材料和方法
材料。
大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞和人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞来自美国类型文化收藏馆（马里兰州罗克维尔）。抗体和来源：多克隆磷酸特异性Y（Y）216和S9GSK3β抗体（QCB-Biosource International，Camarillo，CA）；单克隆的GSK3β抗体（肯塔基州列克星敦转导实验室）；单克隆的vinculin抗体、神经生长因子（NGF）（2.5S）和多克隆抗NGF（Sigma）；得克萨斯州红色标记的鬼笔色素，俄勒冈州绿色488标记的山羊抗兔和德克萨斯州红色标记的山羊抗鼠二级抗体（分子探针）。重组人（rh）GSK3β由苏格兰邓迪大学菲利普·科恩提供，英国提供了延伸起始因子2b肽底物半岛实验室。γ33P-ATP（特定活性10μCi/μl）来自Amersham Pharmacia Biotech。
凋亡诱导。
PC12细胞在含有1%的RPMI中分化9-12天FBS和50 ng/ml NGF。洗涤细胞诱导细胞凋亡使用无NGF培养基，并通过添加抗NGF加速抗体（1:400）。在SH-SY5Y细胞中，凋亡是由使用staurosporine（0.1–0.3μM）。量化凋亡是通过使用细胞测量片段DNA来实现的制造商规定的死亡检测试剂盒（博林格-曼海姆，目录号1774425）。
免疫沉淀和激酶分析。
用于免疫沉淀，在冰柜中制备10μg细胞裂解物裂解缓冲液（10 mM Tris●HCl，pH 7.5/50 mM NaCl/30μM纳4P（P）2O（运行）7/1%Triton-X/0.2 mM PMSF/7.5μg/ml亮氨酸肽/7μg/ml每个胃蛋白酶抑制素A、抑肽酶和E-64/10μg/ml苯甲脒/2 mM纳三VO（旁白）4/2.5 mM氟化钠）在4°C下与5μl抗体孵育1小时，然后用75μl蛋白质G-Sepharose珠培养过夜。对于GSK3β激酶测定，免疫复合物用裂解缓冲液洗涤一次使用100μl激酶缓冲液[100 mM4-吗啉丙基磺酸（Mops），pH 7.0/2 mM EDTA]。激酶用35μl免疫沉淀或0.4μl免疫沉淀物进行检测单位/ml rhGSK3β，4μM伸长率起始因子2b底物肽[Ac-RRAAEELDSRAGS（p）PQL]/10μMγ33P-ATP（0.2μCi）/10 mM镁（Ac）2/10 mM拖把，pH7.0/0.2 mM EDTA总体积为50μl。用ATP启动反应（30分钟30°C），并通过在P81磷酸纤维素上滴加40μl而停止纸质过滤器。用75 mM磷酸清洗过滤器，并冲洗并通过闪烁计数进行定量。西部如前所述，使用1:1000稀释度的抗体(14).
细菌同源重组载体的构建。
pAdeasy-1、pAdTrack-CMV质粒和大肠杆菌BJ5183号来自约翰·霍普金斯肿瘤中心的Bert Vogelstein，Baltimore，MD。GSK3βcDNA从美国型培养物中获得集合映像克隆集合。血凝素（HA）表位标签是通过PCR引入，并通过使用Bgl公司II和生态RV场地。K85R和Y216F通过点突变GSK3β克隆产生突变使用Stratagene的QuickChange工具包。构造由验证测序和限制性消化。
野生型（wt）和突变型GSK3β重组腺病毒构造是通过使用AdEasy系统、Quantum生物技术（加拿大蒙特利尔）。细胞数量由估算计数，并提供适当的多重感染。在2%血清中进行感染（2小时），然后添加正常血清持续12小时。
脑缺血模型。
给Long–Evans大鼠（180–220 g）喂食和饮水广告自由居住在美国协会实验室动物护理认证机构的认证。动物皮下注射氯化锂或生理盐水，每天一次，共16次天（1.5 meq/kg，第1-4天；2.3 meq/kg/kg，第5-11天；3 meq/kg-天12–16），如前所述(15)。最后一次24小时后注射后，大鼠在90丝状诱导大脑中动脉闭塞（MCAO）min，as描述（15).梗死区（毫米三)每个切片都由一张图像决定分析仪。对于免疫组织化学，组织按照描述进行处理以前(14).
共焦显微镜和免疫组织化学。
将生长在盖玻片上的SH-SY5Y细胞固定在4%多聚甲醛中PBS逆转录（RT）15分钟。细胞被渗透在PBS中0.2%Triton X-100中，并在PBS的1%BSA中阻塞15分钟。一级和二级抗体孵育[兔抗Y216（1:500）或小鼠抗病毒素（1:500封闭试剂，山羊抗兔与俄勒冈州绿488偶联（1:1000）]，或与得克萨斯红结合的山羊抗鼠药（1:1000德克萨斯红指骨素（1:100）在RT进行30分钟。每一步然后用PBS清洗15分钟Vectashield（Vector Laboratories），拍摄于奥林匹斯山Fluoview 300（奥林巴斯，纽约州新海德公园）共焦显微镜a×100目标。
结果
在去除神经生长因子后测量凋亡细胞死亡PC12细胞通过检测DNA碎片的检测，这是一种现象与DNA内切酶裂解成180个碱基对有关细胞凋亡。术后3h内观察到细胞凋亡抽出NGF并保持升高24小时（图。A类)。NGF后3小时停药后，Hoescht染色证实20–25%的细胞显示凋亡形态学。测试GSK3β活性是否在凋亡模型中发生改变，我们进行了GSK3β激酶a法测定细胞裂解液中的免疫沉淀蛋白单克隆GSK3β抗体。NGF退出（3小时）导致6倍被锂（10 mM）阻断的GSK3β活性增加或胰岛素（1μM），已知会抑制GSK3β活动（图。B类).
Y的规定216通过提取NGF进行磷酸化PC12细胞。(A类)NGF退出诱导的量化DNA片段分析法检测PC12细胞凋亡（平均值±SEM，n个= 3). (B类)GSK3β活性通过免疫沉淀法和激酶分析。用10 mM氯化锂（Li）或1μM处理的电池胰岛素（Ins）降低了GSK3β活性。(C类)(左侧)Western blot显示磷-Y216特异性GSK3β抗体识别活性rhGSK3β（来自Sf9细胞），但不是经碱性处理的rhGSK3-β磷酸酶。(赖特)Western blot用抗总GSK3β抗体。(D类)斑点显示增加Y（Y）216退出NGF后的磷酸化(顶部)但S的变化微不足道9磷酸化位点(中部)。(底部)GSK3β的总水平。(E类)Western blots显示S上GSK3β磷酸化增加9通过锂和胰岛素，但Y没有显著降低216磷酸化(F类)，在NGF后3小时评估撤回。(F类 最右边)抗HA抗体免疫沉淀和Western blot显示Y（Y）216wt GSK3β-HA和K85R-GSK3α-HA的磷酸化取出NGF后（3小时）。
体外研究表明Y（Y）216GSK3β上的残基对其活动(9)。因此，我们决定是否Y（Y）216GSK3β的磷酸化在磷酸Y剥夺NGF216-特定的抗体。磷酸化的特异性Y（Y）216抗体通过活性rhGSK3β在存在或不存在碱性磷酸酶的情况下（图。C类)。此外磷-Y216-未检测到特异性抗体HA-从293转染细胞中免疫沉淀GSK3β，其中Y（Y）216残基突变为苯丙氨酸（Y216F-GSK3β-HA，未显示）。提取NGF后1小时内，aGSK3βY快速持续增加216观察到磷酸化，表明Y（Y）216磷酸化是凋亡（图。D类)。我们还评估了S的磷酸化9，GSK3β上的一个位点，磷酸化后，使GSK3β失去活性。在基础条件下，都不是S9也不是Y216磷酸化被检测到，低活性被证实使用GSK3β免疫激酶分析。NGF退出不影响S公司9GSK3β磷酸化。
除锂直接抑制GSK3β外(17)，胰岛素和锂激活Akt并导致随后的GSK3β（参考。16和图。B类)。因此，我们评估了对Y的影响216和S9这些试剂对GSK3β的磷酸化。锂预处理（10mM，16小时）或胰岛素（1μM，3小时）添加到PC12细胞凋亡导致S9磷酸化（图。E类)，与概念一致这些药物正在激活磷酸化GSK3β的激酶S公司9虽然锂和胰岛素诱导S公司9磷酸化和降低GSK3β活性，它们不会影响NGF提取诱导的Y磷酸化216（图。F类)，意味着S9磷酸化足以覆盖Y（Y）216磷酸化诱导的GSK3β。这种反应也增加了Y（Y）216观察到的磷酸化可能不会引起通过自身磷酸化。为了进一步探索这种可能性，我们测试了GSK3β是否完全缺乏内在激酶活性，即。，K85R-GSK3β-HA可以在Y被磷酸化216作为对NGF退出的回应。通过使用重组腺病毒策略，我们实现了约90%的wt GSK3β-HA和K85R-GSK3β-HA构建物（绿色荧光蛋白的可视化包含在构造中）。K85R-GSK3β-HA免疫沉淀细胞在Y上磷酸化216类似提取NGF后的wt GSK3β-HA（图。F类)。因为GSK3β的失活不能阻止NGF的提取诱导Y（Y）216磷酸化，很可能Y（Y）216不是一个自动磷酸化位点。
锂（16小时）和胰岛素（3小时）也能阻止NGF提取诱导细胞凋亡50=1.3 mM和117 nM，分别）。在初步研究中，锂（10 mM）和通过使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析]。使用的锂和胰岛素剂量对MTT没有影响形成，表明缺乏明显的毒性作用。在治疗方面，细胞相对完整，与NGF分化的PC12相似形态上的细胞，可见广泛的神经突（图。A类)。因为锂不是GSK3β的特异性抑制剂，其神经保护作用可能是通过其他Akt介导的生存机制介导；因此，我们检测K85R-GSK3β突变对细胞凋亡的影响。与模拟感染的PC12细胞相比，K85R-GSK3β的感染突变体降低了NGF提取诱导的细胞凋亡≈60%（图。B类)。免疫激酶分析证实GSK3β与模拟感染细胞相比，活性降低了85%，表明K85R-GSK3β突变体是负蛋白。细胞看起来健康，神经突完整K85R-GSK3β在缺乏NGF的PC12细胞中的感染（图。B右侧)。因此，GSK3β的失活至关重要预防NGF提取诱导PC12细胞凋亡。
GSK3β抑制抑制NGF提取诱导的细胞凋亡在PC12细胞中。(A类)分化后的显微照片NGF退出导致PC12细胞凋亡(左上)。锂（10 mM）预处理或添加胰岛素（1μM）阻止细胞凋亡并维持相对完整的细胞形态。(B类) (左侧)的影响腺病毒介导的模拟（空载体）、wt GSK3β或显性阴性K85R-GSK3β对PC12细胞凋亡的影响。用DNA片段分析法检测细胞凋亡。K85R-GSK3β对NGF提取诱导的保护作用细胞凋亡。(赖特)PC12细胞的显微照片感染K85R-GSK3β后，突起完整（箭头）提取NGF。
评估Y是否增加216磷酸化是NGF剥夺范式所特有的或发生的在其他凋亡模型中，我们检测了星形孢菌素处理的SH-SY5Y细胞。添加staurosporine（100 nM）导致细胞凋亡和Y（Y）216GSK3β的磷酸化（图。A类)。两种锂（集成电路）50=13 mM）和腺病毒介导K85R-GSK3β转导阻断staurosporine，证实GSK3β在神经元中的作用的重要性细胞凋亡。在显微镜下观察时，>95%的K85R-GSK3β感染细胞（感染倍数=1）显示对staurosporine诱导的凋亡的抵抗（见图。B类).
Y的规定216葡萄孢菌素磷酸化SH-SY5Y电池。(A类) (顶部)在SH-SY5Y细胞中用用DNA片段分析法测定staurosporine（0.1μM）（平均值±SEM，n个= 3). (中部)免疫印迹显示Y增加216磷酸化staurosporine治疗后。(底部)的总级别样品中的GSK3β(B类)。代表显性阴性感染SH-SY5Y细胞的显微照片K85R-GSK3β，服用staurosporine 1小时后。感染细胞（箭头）表现出完整的核形态。(C类)免疫沉淀和Western blot检测Y216细胞中表达的wt GSK3β-HA和K85R-GSK3α-HA的磷酸化用staurosporine治疗1小时。免疫沉淀完成通过使用HA抗体，然后用磷酸免疫印迹Y（Y）216抗体。
确定Y是否216磷酸化GSK3β是细胞内自身磷酸化的结果staurosporine诱导的细胞凋亡模型，we病毒转导HA标记的wt GSK3β和K85R-GSK3β（感染的多重性=100），然后用staurosporine处理。抗HA抗体免疫沉淀法和免疫印迹法磷酸特异性Y216抗体显示两者wt GSK3β-HA和K85R-GSK3β-HA在Y（Y）216staurosporine治疗的部位反应（图。C类)。因为K85R-GSK3β-HA缺乏内在激酶活动，但为Y216磷酸化开staurosporine治疗后，磷酸化不可能发生自动磷酸化。
共焦成像用于确定细胞的亚细胞分布Y（Y）216-磷酸化GSK3β。在休眠细胞中，磷-Y216免疫荧光观察与末端共定位定义的局部粘附位点肌动蛋白丝区域（图。A类)和焦点粘附蛋白vinculin（图。D类)。最小Y（Y）216-磷酸化GSK3β在细胞核（图。A中心)。相反，处理过的细胞使用staurosporine后Y（Y）216-从局部黏附中磷酸化GSK3β核隔间的位置早在5分钟就明显了（图。B类)添加300 nM staurosporine后30分钟（图。C类)。因此，在细胞凋亡与细胞的分化定位相一致Y（Y）216-磷酸化GSK3β。附加需要进行实验来确定这是否代表移位或仅仅是GSK3β水平的改变细胞核内的磷酸化。
磷酸化Y的亚细胞定位216GSK3β。共聚焦显微照片：磷酸化Y216GSK3β（绿色），肌动蛋白（红色），共定位（黄色）(A类).(左侧)正常SH-SY5Y细胞显示共定位磷酸化Y的（箭头）216局部GSK3β和肌动蛋白粘附部位。(居中)最小磷酸化Y（Y）216细胞核中的GSK3β（绿色）。(赖特)显示细胞核的细胞的亮场Nomarski显微照片（箭头）。(B类)Staurosporine，5分钟(左侧)缺乏磷酸化Y216GSK3β（绿色）和肌动蛋白（红色）局部粘连部位的共定位。(居中)与相同左侧在细胞核水平上磷-Y216免疫荧光。(赖特)亮场显微照片，箭头指向原子核。(C类)Staurosporine，30分钟(左侧)缺乏磷酸化Y216GSK3β（绿色）和肌动蛋白（红色）局部黏附位点的共定位(插入)但是显示Y增加216核免疫荧光级别。(居中)与Nomarski重叠磷酸化核定位的显微照片Y（Y）216GSK3β（绿色）。(赖特)布莱菲尔德诺马斯基显微照片。(D类)未经处理的SH-SY5Y细胞。Y（Y）216GSK3β（绿色）与长春花素共定位（黄色）（红色）。(赖特)高倍显微照片共定位蛋白。
我们使用大鼠局灶性缺血（MCAO模型）来确定在细胞培养模型中观察到的变化表明在里面活泼地响应。局部缺血导致皮层丧失它代表了一种急性神经退化模型。西部印迹分析显示，早在MCAO后3和6小时Y增加216磷酸化在同侧而非对侧皮层（图。A类)。组织免疫染色部分显示突出的Y216磷酸化缺血损伤同侧皮质（图。B类).用多余肽（×100）预吸附一抗完全阻断免疫染色（未显示）。磷酸化Y（Y）216免疫染色定位于皮层锥体神经元的胞浆和树突；然而，6小时后，一些神经元也显示出核免疫染色MCAO公司。脑缺血后6h的银染证实了皮层中存在退化神经元。S公司9磷酸化没有改变（未显示）。如前所述(15)，锂预处理16天导致显著下降(P（P）< 0.05;学生的吨测试）皮层梗死体积（载体：161.9±15.2毫米三; 锂：114.1±11毫米三)，提高了监管的可能性GSK3β活性体内可能会有类似的效果描述了神经退行性变的细胞培养模型。附加需要进行实验来确定S公司9和Y216磷酸化在MCAO模型中，GSK3β被锂吸收。
缺血诱导Y216GSK3β磷酸化。(A类)蛋白质印迹显示Y（Y）216同侧皮层GSK3β的磷酸化（I） 与对侧皮层相比(C类)MCAO后3和6小时。组织样本中的总GSK3β为如下面的Western blot所示。(B类)代表显示磷酸化Y增加的显微照片216同侧与对侧神经元的免疫染色MCAO后6小时（对侧）顶叶皮层。
讨论
本研究为监管和本地化提供了证据第页，共页216神经元中GSK3β的磷酸化大鼠缺血后细胞凋亡。主要发现如下那个Y216GSK3β的磷酸化发生于神经元凋亡反应的一部分在所研究的条件下没有自动磷酸化。这个Y的磷酸化216是短暂的，之前诱导细胞凋亡，并在细胞凋亡。这些结果表明Y（Y）216GSK3β的磷酸化表示细胞损伤（如生长）的重要替代机制因子剥夺和staurosporine治疗可导致神经元死亡。
我们发现GSK3β抑制减弱神经元细胞凋亡与最近的报道一致(6——8); 然而，下游机制尚不清楚。GSK3β磷酸酯包括β-catenin和线粒体丙酮酸在内的细胞溶质蛋白脱氢酶(18，19)以及核蛋白如c-Jun，NFAT-c和伸长率起始因子2b(20，21)，但链接任何一种蛋白磷酸化为凋亡途径仍有争议。GSK3β在磷酸化τ中起关键作用促进成对螺旋丝的形成(11)，的外观这与阿尔茨海默氏症的早期神经炎变化有关疾病。最近，活跃的GSK3β定位于角前神经元(22).GSK3β诱导的τ磷酸化可导致神经炎功能障碍并触发细胞凋亡，从而将两种关键病理联系起来发现于阿尔茨海默病患者的大脑中。
我们显示Y216不受由于非活性GSK3β突变体变成Y（Y）216磷酸化以响应凋亡刺激。这表明Y（Y）216该位点可以被上游磷酸化yet-to-be-deciphered信号转导途径。最近，胰岛素和胞浆钙的增加导致τ磷酸化通过提高GSK3β激酶活性(23，24)。这个GSK3β伴随的磷酸化被general检测到抗磷酸酪氨酸抗体，因此这是否代表直接Y轴磷酸化216现场或间接抑制导致S的途径9磷酸化尚不清楚(23)。我们的研究提供了初步证据用于GSK3β在Y（Y）216由GSK3β以外的蛋白激酶定位，导致细胞凋亡过程中活性增加。
正常情况下，Y216-磷酸化的GSK3β局限于局部黏附部位与GSK3β在轴突伸长和收缩中的作用一致(25，26)。几种酪氨酸激酶在局部粘附时形成复合物包括FAK和Fyn激酶的位点(27，28)。Fyn免疫沉淀添加胰岛素后SH-SY5Y细胞中的GSK3β(23)。在神经元中，β-淀粉样蛋白增加Fyn激酶和GSK3β活性(29)和抑制任一激酶都具有神经保护作用(29，30)。尽管如此推测fyn激酶途径导致Y（Y）216神经元中GSK3β的磷酸化然后转移到细胞核参与促凋亡级联反应，需要进一步的工作来确定这个假设的有效性。
我们证明脑缺血后，Y216GSK3β的磷酸化在易受细胞凋亡和非选择性GSK3β抑制剂锂神经保护。因此，GSK3β可能在神经元疾病中发挥作用其中凋亡被认为是一种常见的分子机制。如果这是真的，GSK3β抑制剂将具有治疗作用有助于减轻急性和慢性病程神经退行性疾病。
致谢
我们感谢Richard Lampe、Youjun Chen、My Linh Do、LindaFoster-Brown和Rebecca Kozel负责技术援助，Timothy博士Piser征求建议，Alan Cross博士、Ladislav Mrzljak博士和Michael Klimas表示支持。
缩写
| GSK3β | 糖原合成酶激酶-3β |
| NGF公司 | 神经生长因子 |
| MCAO公司 | 大脑中动脉闭塞 |
| 相对湿度 | 重组人类 |
| 哈 | 血凝素 |
| 重量 | 野生型 |
脚注
本论文已提交直接（轨道II）到PNAS办公室。
印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国，10.1073/pnas.190297597。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.190297597
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