基因表达等级指数：BIG 1–98试验中内分泌治疗乳腺癌患者复发的潜在预测因子
,#1 ,#2 ,三 ,三 ,三 ,三 ,1 ,1 ,4 ,5 ,1和
1 克里斯汀·德斯梅特
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·博德研究所
安妮塔·乔比·胡德
2美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所IBCSG统计中心
帕特里克·内文
三U.Z.Gasthuisberg，比利时鲁汶卡托利克大学
罗伯特·帕里丹斯
三U.Z.Gasthuisberg，比利时鲁汶卡托利克大学
玛丽·罗丝·克里斯蒂安斯
三U.Z.Gasthuisberg，比利时鲁汶卡托利克大学
安·斯密茨
三U.Z.Gasthuisberg，比利时鲁汶卡托利克大学
弗朗索瓦斯·拉勒曼德
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·波德研究所
本杰明·海贝-凯恩斯
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·博德研究所
理查德·德·盖伯（Richard D Gelber）
5美国马萨诸塞州波士顿哈佛大学公共卫生学院前沿科学技术研究基金会丹纳-法伯癌症研究所IBCSG统计中心
马丁·皮卡特
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·博德研究所
克里斯托斯·索蒂里欧
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·博德研究所
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学朱尔斯·波德研究所
2美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所IBCSG统计中心
三U.Z.Gasthuisberg，比利时鲁汶卡托利克大学
4意大利米兰欧洲肿瘤研究所
5美国马萨诸塞州波士顿哈佛大学公共卫生学院前沿科学技术研究基金会丹纳-法伯癌症研究所IBCSG统计中心
通讯作者。 #贡献均等。
版权©2009 Desmedt等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
我们之前已经证明，基因表达等级指数（GGI）能够识别雌激素受体（ER）阳性肿瘤的两种亚型，这两种肿瘤与未经治疗和他莫昔芬治疗的患者的统计差异临床结果相关。在此，我们旨在研究GGI预测在BIG 1–98试验中接受三苯氧胺（T）或来曲唑（L）治疗的绝经后妇女复发的能力。
方法
我们生成了基因表达谱（Affymetrix），并计算了来自两所医院的匹配病例对照样本的GGI，这些样本是在BIG 1-98试验中登记的患者，这些医院都有冷冻样本。所有复发（例）均来自随机接受单药治疗的患者或在转换前复发的转换治疗组。每个病例根据淋巴结状态和治疗（T或L）与四个对照组随机配对。GGI的预后价值被评估为一个持续预测值，并按中位数进行划分。使用ROC曲线的时间依赖性曲线下面积（AUC）来估计GGI的预测准确性。
结果
对48名患者（10名患者和38名对照）的冷冻样品进行分析。10例患者中有7例被分配接受L。病例和对照组在更年期和淋巴结状态、局部和化疗以及HER2阳性方面具有可比性。病例年龄略大于对照组，且ER+/PgR-肿瘤大而分化差。GGI与复发风险呈显著线性相关：GGI每增加10个单位，危害率增加约11%（p=0.02）。在淋巴结阳性疾病患者或接受L治疗的患者亚组中，GGI患者的复发风险显著高于中位数。27个月时AUC最高达到78%。
结论
该分析支持GGI作为ER阳性患者复发的良好预测因子，即使是在接受L的患者中。在BIG 1–98的一个较大系列中，计划使用由较小的一组基因表示的简化GGI对这些结果进行验证，并在石蜡包埋组织上通过qRT-PCR进行测试。
背景
大多数肿瘤表达雌激素受体（ER）的乳腺癌患者接受内分泌治疗。尽管ER状态是目前用于预测内分泌治疗（如三苯氧胺或芳香化酶抑制剂）疗效的最可靠的生物标记物之一，但仍有很大一部分女性复发，这表明需要额外的预测标记物。
几项研究报告称，乳腺癌是一种分子异质性疾病，不同的基因表达模式在ER阳性乳腺癌亚组的女性中尤为明显（综述于[1])。这些研究一致表明，根据基因表达谱的层次聚类，ER阳性乳腺癌可分为分子亚型（主要是管腔A和B），这些亚型与不同的临床结果相关，表明临床异质性背后有分子基础。不幸的是，该聚类分析产生的分类目前对临床设置没有用处，因为目前还没有对每个管腔亚型的构成进行操作定义。
我们小组最近根据97个主要参与细胞周期调节、增殖和分化的基因，以及低级别和高级别乳腺癌之间持续差异表达的基因表达等级指数（GGI）评分[2]. 有趣的是，GGI不仅能够将组织学2级肿瘤患者重新分类为两组，具有与组织学1级和3级患者相似的不同临床结果，而且能够以可重复和定量的方式定义ER阳性乳腺癌中的两个分子亚群，与之前描述的管腔A和B分类具有高度可比性[三]. 事实上，先前分类为管腔A或B的样本在不同评估人群中与显著不同的GGI值相关，所有ER-阳性的管腔A亚型具有最佳临床结果，与低GGI数值相关，而管腔B肿瘤具有显著较高的GGI值。我们还表明，这两种亚型与未经全身治疗和接受他莫昔芬治疗的人群的统计差异性临床结果相关。鉴于这些结果，了解GGI高的患者是否会受益于替代性抗雌激素药物，如芳香化酶抑制剂，似乎至关重要，因为这些药物在全球范围内已显示出优于三苯氧胺[4-8]或者需要完全不同的治疗策略。因此，我们旨在研究GGI预测在BIG 1–98试验中接受他莫昔芬（T）或来曲唑（L）治疗的激素受体阳性乳腺癌绝经后妇女复发的能力。
方法
患者
BIG 1–98研究的设计和实施已在其他地方进行了描述[9]. 简而言之，BIG 1-98试验包括四个治疗组，比较来曲唑（L）或他莫西芬（T）5年的单药治疗，以及一种药物连续给药2年，然后另一种药物持续给药3年。从BIG 1–98数据库（2007年2月版）中识别出来自可用冷冻材料的癌症复发患者，这些冷冻材料需要用于基因表达谱分析。只有两个比利时地点有冰冻材料。复发（例）被定义为局部、对侧乳腺、局部、远处软组织、骨或远处脏器，从随机接受单一治疗或在转换治疗前复发的患者中确定。这两家医院有14名患者复发。根据淋巴结状态（阴性（N-/Nx）或阳性（N+））和治疗（T或L），每个患者随机与四个对照组配对，结果列出70名患者。研究人员只收到了一份患者识别号列表，没有其他信息。这项研究得到了BIG 1-98指导委员会和当地道德委员会的批准。
基因表达分析
国际乳腺癌研究小组（IBCSG）统计中心从这两家医院收集了来自病例和对照组的冷冻样本，并将其从朱尔斯博德研究所送往转化研究室，在那里对样本进行进一步处理。根据制造商的说明，使用Trizol方法（Invitrogen）分离RNA，并使用RNeasy微柱（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）进行纯化。根据生物分析仪（安捷伦公司）生成的RNA图谱评估从每个肿瘤样本中获得的RNA的质量。根据标准Affymetrix协议进行RNA扩增、杂交和图像扫描。我们使用了Affymetrix Human Genome U133-2.0和GeneChip，其中包含近50000个探针集，代表47000多个转录本，这些转录本来自约39500个经证实的人类基因。GGI评分的定义如Sotiriou等人[2]由朱尔斯·博德研究所（Institute Jules Bordet）负责，对临床数据视而不见，并发送至IBCSG统计办公室。原始基因表达数据以及患者特征可在GEO上公开获取网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，具有登录号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE16391”，“term_id”：“16391”}}GSE16391标准.
病理学
IBCSG中央病理实验室通过IHC和荧光原位杂交（FISH）对石蜡包埋的HER2原发肿瘤标本进行了中心审查[10]. 如果通过FISH扩增，则肿瘤被认为是HER2阳性，如果IHC=3+，则在少数情况下FISH结果无价值。
统计分析
根据人口统计学（绝经状态、年龄）、肿瘤特征（肿瘤大小和分级、淋巴结状态、ER/PgR状态、HER2阳性）、接受的治疗（乳腺癌手术、乳腺切除术、放射治疗、辅助或新辅助化疗）、随访时间和GGI，对病例和对照组进行描述性比较。采用连续变量的Wilcoxon秩和检验和分类变量的Fisher精确检验，对基线时的疾病和人口统计学特征进行比较。数据分析基于Kaplan-Meier估计和Cox模型的一般原理。为了评估GGI的独立预后价值，采用了多变量比例风险回归模型。模型通过匹配标准、淋巴结状态和治疗的组合进行分层，并使用95%置信区间的危险比报告结果。多变量比例风险回归也用于探讨GGI在治疗或淋巴结状态定义的亚组中的预后价值。GGI的表现被总结为一个连续的预测因子，并按中位数进行划分
为了评估GGI的预测准确性，使用Heagerty和Zheng的事件/动态定义构建了时间依赖性灵敏度和特异性以及时间依赖性ROC和AUC曲线[11]. 绘制特定时间ROC曲线下的面积AUC（t），作为时间的函数，以表征GGI标记准确性的时间变化。R/S-plus包risksetROC用于处理计算，可通过Heagerty博士的网站下载[12].
所有统计分析均由IBCSG统计中心（AG-H和RDG）进行。
结果
研究人群描述
在最初的70名患者（见选择程序方法）、10名患者（复发）和38名对照组（非复发）中，有48名患者的冷冻组织可用并可进行分析。由于可用组织的数量有限，在适用的情况下，将没有原始匹配病例结果的对照组样本与另一个具有相同匹配特征的病例配对。五个对照组被重新分配，结果是两个病例与6个对照组相匹配，一个病例与5个对照组匹配。在进行任何分析或数据比较之前，重新分配控制。表总结了GGI样本的复发次数和匹配标准。5例复发患者（50%）远处脏器有肿瘤，2例（20%）骨复发，2例对侧乳腺癌（20%），1例（10%）局部复发。病例复发的中位时间为23.8个月[范围：11至49个月]。
表1
根据淋巴结状态和冷冻样本和GGI评分的治疗确定复发状态。
| 复发（例） | 无复发（对照组） | 总计 |
| 否/否，L | 三 | 9 | 12 |
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| 否/否，T | 1 | 5 | 6 |
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| N+、L | 4 | 12 | 16 |
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| N+、T | 2 | 12 | 14 |
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| 总计 | 10 | 38 | 48 |
桌子和总结病例和对照的人口统计学和肿瘤特征。病例和对照组在绝经状态、淋巴结状态、局部治疗、HER2阳性以及辅助或新辅助化疗方面具有可比性。病例年龄略大于对照组，中位年龄分别为62.5岁和59岁。更大比例的病例患有3级肿瘤、2厘米以上的肿瘤和ER阳性/PgR阴性疾病（局部评估）。其中7例患者随机接受了L。病例中的GGI中值为785，而对照组为669。根据Kaplan-Meier估计，总体中位随访时间为27.9个月[范围：11至66个月]。
表2
| 案例/控制 | | |
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| 案例 | 控制 | 总体 | |
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| 特性 | N个 | (%) | N个 | (%) | N个 | P值* |
| 更年期类别 | | | | | | |
| | | | | | |
| 邮差。化疗前 | 9 | 90 | 34 | 89.5 | 43 | |
| |
| 邮差。化疗后 | 1 | 10 | 4 | 10.5 | 5 | 0.99 |
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| 肿瘤大小 | | | | | | |
| | | | | | |
| ≤2厘米 | 1 | 10 | 15 | 39.5 | 16 | |
| |
| >2厘米 | 9 | 90 | 23 | 60.6 | 32 | 0.13 |
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| 肿瘤分级 | . | . | | | | |
| | | | | | |
| 1级 | | | 2 | 5.3 | 2 | |
| |
| 2级 | 三 | 30 | 27 | 71.1 | 30 | |
| |
| 3级 | 7 | 70 | 9 | 23.7 | 16 | 0.03 |
|
| 节点状态 | | | | | | |
| | | | | | |
| 否/否 | 4 | 40 | 14 | 36.8 | 18 | |
| |
| N个+ | 6 | 60 | 24 | 63.2 | 30 | 0.99 |
|
| ER和PgR状态 | | | | | | |
| | | | | | |
| ER-pos/PgR-pos | 5 | 50 | 33 | 86.8 | 38 | |
| |
| ER-pos/PgR-neg | 5 | 50 | 5 | 13.2 | 10 | 0.02 |
|
| HER2阳性 | | | | | | |
| |
| 不 | 8 | 80 | 29 | 76.3 | 37 | |
| |
| 是的 | 1 | 10 | 1 | 2.6 | 2 | |
| |
| 未知 | 1 | 10 | 8 | 21 | 9 | 0.41 |
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| 局部治疗 | | | | | | |
| | | | | | |
| BCS与放射治疗 | 5 | 五十 | 24 | 63.2 | 29 | |
| |
| BCS和无放射治疗 | . | . | 1 | 2.6 | 1 | |
| |
| 乳房切除术和放射治疗 | 4 | 40 | 9 | 23.7 | 13 | |
| |
| 乳房切除术无放射治疗 | 1 | 10 | 4 | 10.5 | 5 | 0.73 |
|
| 佐剂或新佐剂化疗 | | | | | | |
| | | | | | |
| 不 | 6 | 60 | 24 | 63.2 | 30 | |
| |
| 是的 | 4 | 40 | 14 | 36.8 | 18 | 0.99 |
|
| 治疗 | | | | | | |
| | | | | | |
| 来曲唑 | 7 | 70 | 21 | 55.3 | 28 | |
| |
| 他莫昔芬 | 三 | 30 | 17 | 44.7 | 20 | 0.49 |
表3
| 案例/控制 | | | | |
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| | | | |
| 案例 | 控制 | 总体 | |
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| |
| 中值的 | 分钟 | 马克斯 | 中值的 | 分钟 | 马克斯 | 中值的 | 分钟 | 马克斯 | P值* |
| 随机化年龄 | 62.5 | 52 | 70 | 59 | 46 | 78 | 59.5 | 46 | 78 | 0.81 |
|
| GGI公司 | 785.10 | 584.95 | 854.21 | 668.91 | 550.03 | 872.28 | 683.23 | 550.03 | 872.28 | 0.02 |
基因组分级对复发风险的总体影响
为了评估GGI对复发风险的总体影响，采用Cox模型，根据治疗和淋巴结状态的四种组合进行分层，将GGI作为连续线性预测因子。GGI与复发风险呈显著线性相关：GGI每增加10个单位，风险率就会增加约11%（95%CI 3%-21%，log-rank p值=0.02）。
由于没有明确的分界点来将样本分为高GGI和低GGI类别，我们将中值（683.2）作为分界点。高GGI患者复发的风险与低GGI的风险没有统计学差异（风险比：4.55，95%CI 0.95-21.7，log-rank p值=0.06），尽管概率很小，足以证明GGI分类（按GGI中值划分）与复发之间存在关系。
根据随访时间，基因组分级对复发风险的影响
使用Cox比例风险回归评估GGI的预后潜力，并将GGI作为单一协变量来估计时间特异性ROC曲线。构建0至50个月的ROC曲线，然后绘制ROC曲线下的面积，以获得AUC（t）函数（100%=完全分类，50%=无区分）。AUC（t）估计值如图所示在随访的前24个月，AUC（t）在73%和74%之间。这可以解释为，在任何时候，t吨在0到24个月之间，患者复发的概率至少为73%t吨GGI得分高于当时未复发的患者t吨.AUC（t）在27个月时达到最大值77.6%，最大辨别发生在数据中观察到的平均随访时间。
使用ROC曲线下的时间相关面积（AUC）估计GGI的预测精度.
图显示了基于GGI的24、27、36和48个月的ROC曲线。ROC曲线还显示，预测准确度在大约27个月达到峰值，然后随着基线时间的增加而降低。ROC曲线可用于比较固定假阳性率产生的灵敏度。例如，将假阳性率控制在20%，24个月时的敏感性为55.5%，27个月时为56%，36个月和48个月时分别为54%和43%。表总结了登记后24、27、36和48个月按中位数划分的GGI真阳性率和假阳性率。准确度总结（AUC）表明，GGI在入组36个月内具有良好的鉴别潜力，最佳鉴别发生在中位随访时间附近。
表4
| GGI值（%-ile） | 24个月 | 27个月 | 36个月 | 48个月 |
|
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| TP费率 | FP速率 | TP费率 | FP速率 | TP费率 | FP速率 | TP费率 | FP速率 |
| 中值的 | 0.82 | 0.50 | 0.79 | 0.41 | 0.78 | 0.45 | 0.68 | 0.42 |
|
| AUC公司 | 0.74 | 0.776 | 0.73 | 0.68 |
GGI数据24、27、36和48个月的ROC曲线.
基因组分级对治疗复发风险的影响
为了评估GGI对每个治疗分配的复发的影响，根据GGI分别对来曲唑和他莫西芬进行了复发时间的探索性亚组比较。对于随机接受L治疗的患者，GGI高于中位数的患者复发的风险是GGI低于中位数的患者的4.8倍（95%CI:1.01至22.9，p=0.048）。在接受T治疗的样本中只有3例患者，没有证据表明高GGI和低GGI治疗组的复发风险存在差异。
基因组分级对淋巴结状态下复发风险的影响
为了估计GGI对每种淋巴结状态复发的影响，根据GGI分别对N+和Nx/N-定义的亚组的复发时间进行比较。对于淋巴结阳性疾病患者，GGI高于中位数的患者复发的风险是GGI低于中位数患者复发风险的5.5倍（95%CI:1.12-26.9，p=0.04）。对于结节阴性疾病患者，没有证据表明高GGI和低GGI之间的复发风险存在差异，这可能是因为结节阴性病例的数量较少。
讨论
芳香化酶抑制剂在治疗激素依赖性乳腺癌患者中的疗效已在几项临床试验中得到证实，其中使用第三代芳香化酶抑制剂可显著提高无病生存率[4-8,13]. 然而，与三苯氧胺一样，对这些治疗产生了耐药性，患者复发。我们最近发现，与GGI低的患者相比，肿瘤基因组分级高的他莫昔芬治疗患者的预后较差。然而，由于三苯氧胺（ER拮抗剂）和芳香化酶抑制剂（预防雌激素合成）的作用本质上不同，因此我们在本研究中试图评估高GGI水平是否也与芳香化酶抑制剂治疗患者的不良预后有关。
总之，这些结果证实了我们之前的发现，即GGI是ER阳性乳腺癌患者复发的良好预测因子[三]. 事实上，该分析支持GGI作为48名绝经后激素阳性乳腺癌患者样本中复发的良好预测因子，该样本为具有可用冷冻组织的BIG 1-98前瞻性试验，并表明GGI值较高与复发风险增加相关，GGI每增加10个单位，导致危险率增加约11%。同时，将GGI视为由中值定义的二元变量，为高GGI值和增加复发风险之间的关系提供了证据。使用时间依赖性、事件/动态、ROC/AUC方法，估计AUC值在73%到78%之间，发生在入组的前36个月，表明GGI对复发具有良好的预测能力，最佳预测能力出现在大约27个月。然而，使用GGI的假阳性率很高，保持在40%以上。
淋巴结状态或治疗中的探索性亚组分析表明，高GGI值表明预后较差。当在淋巴结状态中比较GGI的表现时，GGI处于或高于淋巴结阳性患者亚组中位数的患者复发的风险明显更大。
由于使用三苯氧胺治疗的患者具有可用样本的病例数量较少，因此对治疗分配内GGI表现的分析有一定局限性。在随机接受来曲唑治疗的患者亚组中，与GGI值低于中值的患者相比，GGI处于或高于中值的患者复发的风险明显更大。
结论
这些结果，再加上我们之前关于他莫昔芬治疗患者的回顾性数据，表明ER阳性的高基因组分级患者需要另一种治疗策略。
虽然很有希望，但我们的结果是探索性的，需要得到证实。这是计划在同一个BIG 1–98试验中使用简化GGI的大量样本上进行的，GGI仅由四个基因表示，可以通过RT-PCR在福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）上进行测试，与冷冻样本相比，该组织在所有医院都是常规可用的。然后，我们还将能够调查是否如Viale等人最近对同一试验中2685名女性所报告的那样[14]在他们的研究中，通过Ki-67蛋白表达捕捉到的高度增殖性肿瘤显示出L相对于T的最大差异益处。此外，由于研究人员最近通过体外研究证明，对芳香化酶抑制剂的耐药性是一种极其复杂的现象，在阿那曲唑、来曲唑和依西美坦之间确实存在差异[15,16]，在将这些结果推广到所有第三代芳香化酶抑制剂之前，我们应该谨慎。
竞争性利益
C.Sotiriou和M.Piccart是本研究中使用的基因表达等级指数专利申请的发明人。没有其他利益冲突。
作者的贡献
CD和CS设计了整个研究。FL进行了微阵列实验。BHK处理了微阵列数据。AG-H和RG进行统计分析。MP、PN、RP、MC、AS和CS提供了乳腺肿瘤学临床专业知识。CD写了手稿。所有作者都批准了手稿的最终版本。所有作者都参与了手稿的编写。
致谢
这项工作得到了乳腺癌研究基金会、比利时抗癌联合会、比利时科学研究基金会FNRS（C.D.和C.S.）的部分支持。BIG 1–98试验由诺华公司赞助，IBCSG协调。IBCSG统计中心由国家癌症研究所拨款CA-75362（R.D.G.和A.G.-H.）提供部分支持。我们感谢BIG 1-98协作小组和瑞士伯尔尼国际乳腺癌研究小组（IBCSG）的合作。
工具书类
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