肌生长抑制素基因突变可减少动脉粥样硬化性血脂异常和动脉粥样硬化性病变的发生Ldlr公司Null鼠标

身体成分和代谢笼测量。

通过核磁共振（NMR）测定全身脂肪和肌肉质量；EchoMRI-100，Echo Medical System，Houston，TX）。使用低能X射线显微计算机断层扫描（CT）扫描仪（LaTheta LCT-100A，Echo Medical System）进行内脏和皮下脂肪成像。如前所述，使用Oxymax系统（俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司）测量耗氧量和呼吸交换率(11).

磁共振血管造影。

使用1–2%（v/v）异氟醚和1–2 L/min氧气流量通过麻醉监测系统对小鼠进行麻醉（Smiths Medical PM，Waukesha，WI）。呼吸由呼吸传感器枕（SA Instruments，Stony Brook，NY）监测。成像使用的是11.7 T的Bruker Avance 500垂直孔光谱仪（马萨诸塞州，Billerica，Bruker）。使用ParaVision 3.0.2进行数据采集和重建。采用FLASH_3D_ANGIO脉冲序列（翻转角度=20°，TE/TR=2.18ms/20ms，FOV=15mm×15mm×15mm）进行三维磁共振血管造影（MRA）。每次扫描获得四个平均值。

En脸动脉粥样硬化病变的检测。

在喂食HFD 12周后，使用之前描述的程序，在动物身上进行主动脉的制备和动脉粥样硬化病变的量化(12). 将带主动脉的心脏植入最佳切割温度（OCT）下（美国Sakura Finetech，加利福尼亚州Torrance），哈佛医学院（马萨诸塞州波士顿）啮齿动物组织病理学核心用油红O染色主动脉根部连续10μm厚的细胞切片。

血脂和其他代谢物的测量。

分别使用Elite XL型血糖仪（拜耳，纽约州塔里敦）和Precision Xtra（雅培实验室，马萨诸塞州贝德福德）测定血糖和酮类浓度。使用超灵敏ELISA（Alpco、Salem、NH）测定血浆胰岛素和胰高血糖素。为了进行脂质分析，在异氟醚麻醉下，从后颅神经丛采集禁食（12小时进食）和非禁食（3小时进食）血样。使用之前描述的程序进行脂质分析(13). 心血管专业实验室（佐治亚州亚特兰大）使用快速液相色谱法对脂蛋白的胆固醇和甘油三酯分布进行了研究(14). 分数2-6包含VLDL；馏分7–11含有低密度脂蛋白；14–17馏分含有HDL。

葡萄糖和胰岛素耐受测试。

在葡萄糖耐量试验中，给空腹小鼠喂食d日-腹腔注射葡萄糖（1g/kg）。在胰岛素耐受性试验中，通过腹腔注射给非肥胖小鼠注射胰岛素（0.75 IU/kg）（伊利·礼来，印第安纳波利斯，印第安纳州）。使用Elite XL（拜耳）血糖仪测量血糖。

高胰岛素-血糖钳夹研究。

通过修改所述程序，进行高胰岛素-血糖钳夹(15). 简单地说，用肝素涂层MRE-025导管（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）对杀死小鼠的右颈静脉（80–10 mg/kg氯胺酮-噻嗪i.p.）进行插管。允许动物恢复1-2天。胰岛素（10 mU·kg⁻¹·最小值⁻¹)使用注射泵（HA11D，哈佛仪器，马萨诸塞州奥利斯顿）以1μl/min的速度注入含0.3%BSA的溶液。每隔5分钟抽取～2μl尾静脉血测量血糖。以足以维持血糖140 mg/dl的速率注入葡萄糖（25%）。在2小时夹钳的最后30分钟内测量平均葡萄糖输注率（GIR）。在最近三次采集的血液样本中测量了胰岛素。

肌肉[^三H] -2-脱氧葡萄糖摄取。

肌肉对代谢惰性葡萄糖类似物的摄取[^三H] 2-脱氧葡萄糖（DOG），在2小时高胰岛素-血糖钳夹实验结束前30分钟在小鼠体内进行，修改了先前描述的方法(15). 简言之，腹腔注射DOG（30μCi），采集小鼠后肢肌肉，进行变性，并使用液体闪烁分析仪（TriCarb 3100TR，PerkinElmer，Shelton，CT）对洗脱液进行定量。通过将肌肉DOG摄取量除以30分钟间隔（cpm·kg）来计算葡萄糖摄取率⁻¹·最小值⁻¹)平均血糖比活性（葡萄糖cpm/mg）。

组织学。

将肝组织埋入OCT中。在哈佛医学院（马萨诸塞州波士顿）的啮齿动物组织病理学中心制备10μm厚的连续细胞切片，并用油红O和苏木精-伊红染色。

肝内脂质测量。

使用冷冻干燥系统（Freezone，Labconco，Fort Scott，KS）对肝脏进行冷冻干燥，以获得肝脏干重。通过Folch方法提取肝脏脂质(16). 分别使用Infinity胆固醇（宾夕法尼亚州匹兹堡热电公司）和T2449甘油三酯试剂（密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich）测量肝脏胆固醇和甘油三酸酯。

线粒体脂肪酸β-氧化测定。

在250 mmol/l蔗糖、0.1 mmol/lEDTA、50 mmol/lKCl和10 mmol/lHEPES（pH 7.4）中均质新鲜肝组织，并在1000×克5分钟。上清液以10000×克持续15分钟，并且将颗粒溶解在50 mmol/l KCl、70 mmol/l蔗糖、3.6 mmol/lMgCl中₂，7.2毫摩尔/升K₂高功率放大器₄和36 mmol/l Tris-HCl（pH 7.4）。使用Bradford试剂（Bio-Rad，Hercules，CA）测量蛋白质浓度。此外，5μCi/ml[^三H] -棕榈酸酯与1 mg线粒体在预孵育缓冲液中与2 mmol/l KCN在室温下孵育30 min。反应随后在5%高氯酸中孵育60 min，上清液在液体闪烁计数器中计数。

肝脏VLDL（apoB100）分泌。

通过改进先前描述的方法测量VLDL分泌率(17). 简言之，通过尾静脉给禁食小鼠注射Triton WR 1339（500mg/kg；密苏里州圣路易斯市西格玛化学公司）以阻断脂解。在基线检查时、注射后90分钟和180分钟采集血样。血浆apoB100通过使用抗apoB抗体的Western blot分析测定（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。肝脏VLDL分泌是通过血浆apoB100与基线相比增加的百分比来计算的。

蛋白质印迹分析。

使用含有SDS和β-巯基乙醇的样品缓冲液处理后，分析每条通道的1微升血浆，然后在4–15%Tris-HCl梯度凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA）中分离。如前所述提取并处理肝脏和肌肉组织样本(12). 除抗脂肪酸合成酶抗体（马萨诸塞州丹佛市Cell Signaling Technology）和二级抗体外，所有初级抗体均购自圣克鲁斯生物技术公司。

实时Q-PCR。

使用RNeasy迷你试剂盒从冷冻肝脏中提取总RNA（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）。对于逆转录，使用AffinityScript Q-PCR cDNA合成试剂盒（Agilent Technologies，La Jolla，CA）在20μl反应中将1μg总RNA转化为第一链互补DNA，随后将其稀释五倍。对于PCR样品制备，将5μl cDNA与10μmol/l引物和SYBR主酶混合物混合在20μl反应体积中（SABiosciences，Frederick，MD）。反应在94°C下启动10 min，然后通过94°C×15 s和60°C×1 min进行40个循环。所有反应均重复进行。所有CT值均在20-30个周期范围内。使用SDS 1.9.1软件（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）分析扩增曲线。Hprt1（小时）对照提供了相对的基因表达水平。参考补充表1（在线附录中提供，网址：http://diabetes.diabetesjournals.org/cgi/content/full/db09-0349/DC1)用于引物。

Mstn公司缺失减少饮食诱导的动脉粥样硬化Ldlr公司^−/−老鼠。

确定是否删除Mstn公司为了减轻血管病变的发展，我们首先使用活体MRA来评估头臂动脉管腔闭塞，这是最容易损伤的部位之一(图2A类). HFD 8周后，Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−小鼠的内腔缩小，不对称性增加(图2B–D类)；相反，头臂动脉管腔Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−保持通畅而无明显闭塞，如更大的对称性和更大（1.7倍）的管腔面积所示(图2C类和D类).

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图2。

的影响Mstn公司动脉粥样化进展中断Ldlr公司^−/−老鼠。A类：主动脉弓及其主要分支的典型MRA。BCA，头臂动脉。B类：BCA的横截面图像。C类和D类：对称系数（最大直径与最小直径之比）(C类)，和横截面积(D类)BCA管腔的(n个= 4).电子：主动脉瓣水平处主动脉根部动脉粥样硬化病变的油红O染色(顶部面板). 放大倍数40倍。主动脉总弓和主动脉分支(底部面板) (n个= 9–20).F类和G公司：苏丹红IV染色面对面主动脉(F类)动脉粥样硬化病变面积的定量分析（占总主动脉表面积的百分比）(G公司) (n个= 9–20).^++/++,Mstn公司^+/+/Ldlr公司^+/+.^++/−−,Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−.^+−/−−,Mstn公司⁺⁻/Ldlr公司^−/−.^{−−/−−},Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−数据表示为平均值±SE(n个= 11–21). **P（P）< 0.05. **P（P）< 0.01. （该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

HFD 12周后，处死动物并解剖主动脉。Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−小鼠出现偏心的大斑块（动脉壁的部分周长），并沿主动脉弓和降主动脉分散(图2电子). 油红O染色显示病变富含脂质(图2电子). 分析面对面主动脉显示动脉粥样硬化病变区域Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠比in低41%Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−控件(图2F类和G公司). 与类似脂肪量积累相关(图1B类和C类),Mstn公司^+/−/Ldlr公司^−/−小鼠的病变面积与Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−控件(图2G公司)，表明杂合性缺失Mstn公司不足以防止脂肪堆积或动脉粥样硬化。阴性对照，Mstn公司^+/+/Ldlr公司^+/+小鼠组，未见明显病变。因此，Ldlr公司^−/−带有Mstn公司该基因的缺失可防止动脉粥样硬化病变的发展/进展。

接下来我们研究了破坏Mstn公司延缓动脉粥样硬化进程。由于循环脂质是动脉粥样硬化的重要因素，我们测定了血脂和脂蛋白的变化。

Mstn公司在中删除Ldlr公司^−/−小鼠可减轻致动脉粥样硬化性血脂异常。

即使在HFD导入之前，Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−与对照组相比，小鼠的血浆甘油三酯、游离脂肪酸（FFA）和总胆固醇水平显著降低Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−老鼠(图3A类). HFD治疗10周后，Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−与基线相比，对照组的血浆甘油三酯（3.0倍）、游离脂肪酸（2.3倍）和胆固醇（3.8倍）水平显著升高；血脂的变化明显大于Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−HFD后的小鼠。HFD后血浆甘油三酯、FFA和胆固醇水平在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−比中的Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−控件(图3B类)，表明Mstn公司缺失可防止动脉粥样硬化性血脂异常的发生Ldlr公司^−/−喂食HFD的小鼠。

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图3。

动脉粥样硬化脂质分布Ldlr公司^−/−带有Mstn公司删除。A类和B类：小鼠基线时的空腹血浆FFA、甘油三酯和胆固醇水平(A类)HFD（HF-diet）10周后(B类).C类和D类：脂蛋白概况Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−（○）和Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−（●）HFD 11周后的小鼠。数据以平均胆固醇表示(C类)和甘油三酯(D类)每个组的分布。电子：HFD诱导前后血浆载脂蛋白A1和载脂蛋白B100颗粒。这些图表显示了每个分子的定量，显示为apoB100/apoA1比率。取四种不同凝胶的平均值。在HFD治疗10周后，从小鼠身上抽取血液。^++/−−,Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−.^{−−/−−},Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−数据显示为平均值±SE(n个=7–10）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

我们使用快速液相色谱法分离血浆脂蛋白。血浆总胆固醇、VLDL-胆固醇和LDL胆固醇水平在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−老鼠比在Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−控件(图3C类). VLDL（VLDL-TG）和LDL组分（LDL-TG）的甘油三酯含量也显著低于Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠比对照组(图3D类).

载脂蛋白B是心血管风险的重要预测因子；尽管有目标胆固醇水平，但一些apoB100水平升高的患者患心血管疾病的风险增加(18,19). 我们分析了小鼠血浆apoB100的含量。血浆样本的Western blot分析Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−HFD 11周后，小鼠的apoB100显著增加，这种饮食效应在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−老鼠(图3电子). 我们还测量了高密度脂蛋白的支架蛋白apoA1。apoB100与apoA1的比值在化学计量学上与非HDL与HDL颗粒的比值相关，在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠与对照组的比较(图3电子)，表明在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−老鼠。

Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠具有更大的胰岛素介导的葡萄糖处置。

饮食诱导的肥胖与胰岛素敏感性的恶化密切相关，临床表现为循环胰岛素、葡萄糖、甘油三酯和FFA的增加(20). 胰岛素也是脂肪脂肪分解和肝脏VLDL生成的重要调节器。在喂食HFD的小鼠中，这些胰岛素代谢功能的失调可能导致高脂血症并加速动脉粥样硬化(21,22). 因此，我们评估了Mstn公司胰岛素敏感性缺失Ldlr公司^−/−老鼠。

除了具有较低的血浆甘油三酯、FFA、VLDL和apoB浓度外，Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠的空腹血糖和胰岛素水平也显著降低。这些数据表明Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠对胰岛素的敏感性高于Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−即使在喂入HFD时也能控制(图4A–C). 血浆胰岛素与胰高血糖素的比值也显著降低（Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−老鼠）。葡萄糖耐量试验未显示葡萄糖处理率之间的显著差异（补充图3A类（见在线附录），但这可能是因为Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−(图4B类). 当小鼠在胰岛素耐受性试验期间注射固定剂量的胰岛素时，Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠的血糖水平显著低于Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−室友（补充图3B类，在线附录中提供）。此外，Ldlr公司^−/−带有Mstn公司缺失显著降低磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(佩普克)表达式（补充图3C类，在线附录中提供），限速肝糖原生成酶(23)与胰岛素敏感性的提高相一致。

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图4。

代谢研究Ldlr公司^−/−带有Mstn公司删除。A–C：空腹血糖(A类)，血浆胰岛素(B类)和葡萄糖（mg/dl）×胰岛素产物（μIU/ml）的比值(C类)第页，共页Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−和Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−HFD 8周后的小鼠。D–G型：HFD 12周后小鼠的高胰岛素-血糖钳夹研究。2小时钳夹期间血糖和GIR的追踪(D类)（○和●，血糖；□和■，GIR），平均GIR(电子)四头肌的葡萄糖摄取(F类)，以及钳制期间的平均血浆胰岛素(G公司).H（H）小鼠股四头肌中的Akt丝氨酸-473和GSKα/β丝氨酸-21/9磷酸化。图表显示了每个分子磷酸化形式的量化。平均值取自三个不同的实验。++/-，Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−.^{−−/−−},Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−.AU，任意单位。数据显示为平均值±SE(n个= 7–10). *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

为了证实我们在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠，我们进行了高胰岛素-血糖钳夹研究，这是公认的评估胰岛素敏感性的金标准(24).Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−需要显著提高GIR才能维持正常血糖(图4D类和电子)与对照组相比。这些数据表明Mstn公司缺失通过增强胰岛素刺激的葡萄糖在外周组织中的处置来提高全身胰岛素敏感性。GIR增加可能仅仅是因为双基因敲除小鼠的肌肉质量增加以及由此导致的代谢需求增加。为了进一步探讨这个问题，我们测量了[^三H] 钳夹过程中骨骼肌的脱氧葡萄糖摄取。在Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠的葡萄糖摄取股四头肌肌肉明显高于Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−控件(图4F类)处于类似的高胰岛素状态(图4G公司). 此外，Akt中丝氨酸-473的磷酸化显著高于Mstn公司^−/−/Ldlr公司^−/−小鼠与对照组进行比较。作为Akt底物之一的GSK3中丝氨酸-21/9的磷酸化也显著升高，进一步证明了骨骼肌中胰岛素作用的改善(图4H（H）). 总之，这些数据表明HFD在Mstn公司^+/+/Ldlr公司^−/−老鼠和Mstn公司预防胰岛素抵抗的发展，与其他报道一致(9,10).

我们感谢美国国立卫生研究院拨款RO1 DK49296、DK59261、DK64572、DK078512、DK72449和T32 DK070201–31的支持。

没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

我们感谢S.-J.Lee慷慨捐赠Mstn公司^−/−老鼠和Q.Yan为导管放置手术提供培训。我们还感谢L.Jiang、S.Wong、L.Kaoutzani和E.Yang提供的宝贵技术援助。