STIM1的寡聚化将内质网钙耗竭与CRAC通道激活偶联

钙²⁺释放活化钙²⁺（CRAC）通道产生持续钙²⁺对一系列细胞功能至关重要的信号，包括抗原刺激的T淋巴细胞活化和增殖^1，2.近期研究^三揭示了钙的消耗²⁺来自内质网（ER）触发STIM1、ER-Ca的寡聚²⁺传感器及其重新分配到ER-PM（ER-PM）结^4——8其中CRAC通道亚单位Orai1积聚在质膜中，CRAC通道开放^9——12然而，ER Ca的损失如何²⁺启动这些协调的分子重排仍不清楚。这里我们定义了[Ca之间的关系²⁺]_急诊室、STIM1再分配和CRAC通道激活，并确定STIM1齐聚是关键的[Ca²⁺]_急诊室–驱动存储操作Ca的相关事件²⁺条目（SOCE）。在表达ER靶向Ca的细胞中²⁺指示剂、CRAC通道激活和STIM1再分配遵循与[Ca相同的功能²⁺]_急诊室，带K_1/2约200μM，希尔系数约4。因为STIM1只结合单个Ca²⁺离子⁵，高的表观协同性表明STIM1必须首先低聚才能在ER-PM结处积累。为了直接评估STIM1齐聚在SOCE中的因果作用，我们替换了管腔Ca²⁺-STIM1与雷帕霉素结合蛋白FRB或FKBP的传感域。雷帕霉素类似物寡聚融合蛋白，使其在ER-PM连接处积聚并激活CRAC通道而不消耗Ca²⁺因此，STIM1寡聚化是Ca²⁺存储耗尽控制存储操作的Ca²⁺入口，作为一个开关，触发ER-PM连接处STIM1-Orai1簇的自组织和激活。

存储操作通道的定义特征是它们对ER-Ca的响应激活²⁺（[钙²⁺]_急诊室)消耗。然而，它们对[Ca的敏感性²⁺]_急诊室而决定这种敏感性的因素一直没有确定，主要是因为定量[Ca的技术困难²⁺]_急诊室为了解决这个问题，我们建立了一个稳定表达Ca的Jurkat T细胞系²⁺-敏感骆驼蛋白YC4.2er。YC4.2er选择性地保留在内质网中，如与常驻内质网蛋白calnexin共定位，但不与线粒体或高尔基体标记物共定位，以及对消耗内质网钙的试剂的功能反应所示²⁺(图1a和补充图1).现场YC4.2er FRET信号的校准表明对[Ca的响应²⁺]_急诊室在~1μM到>1 mM的范围内(补充图2).

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图1

[加利福尼亚州]²⁺]_急诊室-CRAC信道的响应关系

同时测量[Ca²⁺]_急诊室和我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}单个Jurkat T细胞中。a、，I的非静态测量_{中俄国际商用飞机有限责任公司}和[Ca²⁺]_急诊室.使用20μM CPA进行存储消耗会导致I增加_{中俄国际商用飞机有限责任公司}（顶部）[Ca下降后²⁺]_急诊室（中）用YC4.2er监测。I-V关系显示了I的典型内向整流_{中俄国际商用飞机有限责任公司}（底部）。在这个细胞中，一个小的向内电流通过向外重新激活的氯离子⁻通道最初也存在，但在我之前消失_{中俄国际商用飞机有限责任公司}被诱导。b、，I的记录_克拉克（顶部）和[Ca²⁺]_急诊室（中间）稳态条件下。在记录之前，用指示的CPA浓度处理每个细胞8-15分钟，CPA在整个实验期间保持不变。I-V关系是I的典型关系_{中俄国际商用飞机有限责任公司}（底部）。c、，稳定状态I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}和[Ca²⁺]_急诊室用0.5–20μM CPA处理40个细胞后绘制。Hill方程与K的拟合_1/2169μM，希尔系数4.2叠加在数据上。平方：3–12个细胞的平均值±标准误差。圆圈：单个单元格（请参见补充信息).

确定CRAC通道激活对[Ca的依赖性²⁺]_急诊室，我们测量了我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在Jurkat YC4.2er细胞经环丙二酸（CPA）（一种可逆SERCA抑制剂）处理后的穿孔补片记录中。CPA引起[Ca的时间依赖性下降²⁺]_急诊室同时激活I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在同一个单元格中测量(图1a). 然而，因为我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}对[Ca的快速变化反应缓慢²⁺]_急诊室，这样的非平稳测量将扭曲对真实[Ca²⁺]_急诊室CRAC渠道的依赖性。因此，我们确定了²⁺]_急诊室-我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在无细胞外钙的情况下，用0.5–20μM CPA预处理细胞8–15分钟，在稳态条件下的关系²⁺生成常数[Ca的范围²⁺]_急诊室值。这种被动耗竭方法还可以最小化[Ca的空间变化²⁺]_急诊室，允许[Ca²⁺]_急诊室根据全细胞YC4.2er测量结果确定SOCE的依赖性。读取20 mM Ca后²⁺在短暂超极化期间，在恒定[Ca下，从+30–50 mV的静息电位监测电流²⁺]_急诊室(图1b). 电流被识别为I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}基于其对细胞外Ca的延迟反应²⁺反射Ca²⁺-依赖性增强(图1b)，一种内在纠偏的I/V关系(图1b)，以及极低的电流噪声¹⁷。40个细胞的测量结果表明_{中俄国际商用飞机有限责任公司}是[Ca的陡峭函数²⁺]_急诊室带K_1/2169μM和希尔系数（n_H（H）)第4.2页，共4.2页(图1c). 有趣的是，与静止状态相比，[Ca下降>100μM²⁺]_急诊室在这些细胞中启动CRAC通道开放需要约400μM，这可能有助于解释IP的能力_三释放少量ER Ca²⁺不激活I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在一些细胞中¹⁸。

接下来，我们讨论了CRAC渠道严重依赖[Ca的来源²⁺]_急诊室因为STIM1是已知的Ca²⁺SOCE传感器^6，7它重新分布到ER-PM结与I有关_{中俄国际商用飞机有限责任公司}激活^6，8，11，我们测量了STIM1重分布对[Ca的依赖性²⁺]_急诊室暴露于0.5–3μM CPA超过8分钟会导致Cherry-STIM1部分重新分布到细胞外围，这可以通过细胞赤道的宽场成像看到(图2a). 我们将樱桃-STIM1的重新分布量化为平均外周荧光与平均总荧光的比值(图2b); 该方法给出的结果在数量上与STIM1点的TIRF测量值一致(补充图3)同时促进了骆驼和樱桃荧光信号的分离（参见补充信息). 对41个细胞的测量表明，STIM1重分布是[Ca的陡峭函数²⁺]_急诊室和我的很相似_{中俄国际商用飞机有限责任公司}激活，使用K_1/2187μM，希尔系数3.8(图2c). K的值_1/2接近STIM1重组EF-hand/SAM结构域的结合亲和力在体外（K）_D类=200–600μM；裁判⁵)，与其作为ER Ca的作用一致²⁺传感器。重要的是，STIM1和I之间的密切联系_{中俄国际商用飞机有限责任公司}曲线表明，CRAC通道的开放与ER-PM结处STIM1的浓度成正比，并且CRAC通道对[Ca具有高度非线性的依赖性²⁺]_急诊室来自ER Ca²⁺STIM1再分配的依赖性。最近对HeLa细胞的一项研究发现，STIM1的再分配对[Ca有类似的依赖性²⁺]_急诊室（参考¹³). 在该研究中，同源STIM2在较高的[Ca²⁺]_急诊室（K）_1/2=406μM），而STIM1（K_1/2=210μM），并提出STIM2作为体内稳态ER-Ca发挥作用²⁺激活Orai1。我们的发现_{中俄国际商用飞机有限责任公司}STIM1重分布遵循与[Ca相同的功能²⁺]_急诊室意味着在Jurkat细胞中，STIM2最多激活一小部分内源性CRAC通道，这与其在T细胞中的低水平表达一致¹⁴。

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图2

[加利福尼亚州]²⁺]_急诊室STIM1再分配的依赖性决定了[Ca²⁺]_急诊室-CRAC信道的响应关系

a、，用3μM CPA（中间）和TG（底部）在静止（顶部）和存储耗尽后表达Cherry-STIM1的细胞的宽场外荧光图像。樱桃-STIM1在单个细胞中的重新分布被监测为细胞最外围0.5μm处的平均樱桃荧光比率（F_P（P），右）到整个细胞的平均荧光（F_TOT公司，左）。比例尺=2μm。b、，在同一单元格中，STIM1重分布用F表示_P（P）/F类_TOT公司用TG（蓝色）归一化为最大比率。F类_P（P）/F类_TOT公司随[Ca]增加_急诊室（红色）下跌。显示了单个数据点（开放符号）和平均响应（条形图）。c、，STIM1再分配（F_P（P）/F类_总计，蓝色）绘制于[Ca²⁺]_急诊室用0-3μM CPA处理后（3-4个细胞的平均值±标准偏差；总共41个细胞）。希尔方程拟合（蓝线）表示K_1/2μM，Hill系数为3.8。稳定状态I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}用希尔方程拟合的数据从图1（红色）。

STIM1再分配曲线的形状对SOCE的机制具有重要意义。~4的Hill系数表明，点阵的形成是一个关于[Ca的非线性过程²⁺]_急诊室但不一定表明合作机制或STIM1的活性形式是四聚体。然而，高Hill系数意味着ER-PM连接处的STIM1点状结构并不是由STIM1单体的独立增生形成的，STIM1的单体只含有一个管腔钙²⁺结合位点⁵但这表明只有STIM1的低聚物才能在这些位点聚集。已知STIM1齐聚有两种方式。在静息细胞中，STIM1通过其胞浆螺旋结构域与未知的化学计量比自结合^15，16; 此外，钙的去除²⁺来自STIM1的EF-hand推动进一步齐聚在体外⁵和体内⁴STIM1的存储依赖性齐聚反应在几秒钟内发生，稍早于点状结构的形成，已经假设了其在SOCE中的因果作用，但从未测试过^4，5。

为了解决STIM1齐聚在SOCE中的可能作用，我们采用了一种基于雷帕霉素诱导的蛋白质异二聚的方法^17，18我们将Cherry-STIM1的EF-SAM结构域替换为FK506结合蛋白（FKBP12）的串联二聚体或mTOR（FRB）的雷帕霉素结合结构域的变体，以生成STIM1嵌合体，当与雷帕霉素类似物（AP21967或rapalog）结合时，该嵌合体将异二聚化。已知STIM1在休息时会自我联想^15，16因此，rapalog有望将含有FRB的多聚物与含有FKBP的多聚体连接起来，形成STIM1的延伸低聚物(图3a). 我们使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析了表达Cherry-FRB-STIM1和Cherry-FKBP-STIM1（以下简称F-STIM1）的HEK293细胞中的低聚物形成¹⁹拉帕洛处理后表观质量增加了2倍以上，证实了其低聚F-STIM1的能力，并且由于单体交联预计最多会使质量增加一倍，这表明FRB-STIM1和FKBP-STIM1的静止状态至少是二聚体(图3b).

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图3

STIM1齐聚诱导STIM1在ER-plasma膜连接处积聚

a、，这幅漫画描述了由拉帕洛（R）诱导的F-STIM1齐聚反应。休息时，FKBP-STIM1和FRB-STIM1有望形成同源和异源二聚体；这里只显示了同二聚体之间的分子间交联。缩写：EF（EF hand）、SAM（无菌-α基序）、CC（线圈）、S/P（富含丝氨酸-脯氨酸）、K（富含赖氨酸）、CH（mCherry）。b、，HEK293细胞瞬时表达F-STIM1的BN-PAGE和Western blot。使用单克隆抗STIM1抗体检测未处理（左）和经rapalog处理（右）的F-STIM1。c、，Rapalog诱导F-STIM1的时间依赖性外周再分布（n=10个细胞）。日期：，TG对樱桃-STIM1的外周再分布（红色条；每个条n=31）和rapalog对F-STIM1的再分布（黑色条；n=39，其余；n=42，rapalog.）。数值表示为平均值±标准误差(c、 天).e–h，Jurkat细胞的TIRF图像，比例尺=2μm。e、，用雷帕霉素孵育前（左）和孵育后（右）的F-STIM1。f、，樱桃-STIM1在使用TG之前（左）和之后（右）存储耗尽。克，樱桃-STIM1与rapalog孵育前（左）和孵育后（右）。小时，经rapalog处理（左栏）和随后用TG（右栏）进行存储耗尽后，单个细胞的F-STIM1（顶行）、GFP-STIM2（中行）和合并图像（底行）。樱桃和GFP强度在TG处理后被缩放到每个荧光团的最大强度。

我们首先研究了rapalog对F-STIM1在Jurkat细胞中定位的影响。Rapalog诱发F-STIM1向细胞外周的重新分布，并在几分钟内完成(图3c). 定量分析表明，雷帕霉素与钙一样有效地触发F-STIM1的重新分布²⁺存储耗尽导致野生型STIM1的重新分布(图3d). 当用TIRF显微镜检查时，雷帕霉素驱动的F-STIM1的外周积聚(图3e)类似于野生型STIM1因存储耗尽而形成的斑点(图3f). 在HEK293细胞中也得到了类似的结果。Rapalog不影响野生型STIM1的定位(图3g)也没有消耗钙²⁺商店（见下文）。最后，rapalog诱导的F-STIM1点与储存消耗诱导的GFP-STIM1点状物在同一细胞中共存，证实了Rapalug导致F-STIM2在已知STIM1和Orai1相互作用的同一ER-PM交界处积聚。因此，我们得出结论，STIM1的齐聚足以驱动STIM1向ER-PM结的再分配。

FRB-STIM1和FKBP-STIM1的异二聚化也激活内源性CRAC通道。Rapalog提高了平均休息时间[Ca²⁺]_我在表达F-STIM1（樱桃阳性细胞）的Jurkat细胞中，从170±11 nM（未处理；n=61）到388±45 nM(图4a; n=45），但不影响[Ca²⁺]_我在未转染的Jurkat细胞中。升高的基底[Ca²⁺]_我依赖细胞外钙²⁺(图4a)被2-APB和低浓度La抑制³⁺(补充图4)，与Ca的组成一致²⁺通过开放的CRAC渠道进入。重要的是，TG释放了类似数量的ER-Ca²⁺在rapalog预处理和静息细胞中，表明rapalag刺激Ca²⁺在不消耗Ca的情况下进入²⁺商店(图4a). 高[Ca的全细胞录音²⁺]设计用于最小化存储消耗的移液管溶液证实FRB-STIM1和FKBP-STIM1的异二聚化直接激活I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在未经处理的表达F-STIM1的Jurkat细胞中_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在进入全细胞结构时可以忽略不计，并缓慢发展到小幅度，可能是由于部分存储耗尽。相比之下，在有可见斑点的雷帕霉素分泌细胞中，一旦进入，立即可见大量内向电流(图4b)展示了我的基本特征_{中俄国际商用飞机有限责任公司}包括对细胞外钙的依赖²⁺，内部整流电流电压关系(图4c)、低电流噪声、快速Ca²⁺-依赖性失活以及2-APB和La的抑制³⁺(补充图4). 平均电流振幅（2.6±0.6 pA/pF，n=9）与Ca产生的振幅相似²⁺过度表达Cherry-STIM1的Jurkat细胞中的存储损耗（参考¹¹)与STIM1和F-STIM1对TG或rapalog的可比重分布程度一致(图3). 总之，这些结果表明ER-PM连接处的F-STIM1低聚物是完全活性的，并直接证明STIM1的低聚物化独立于[Ca²⁺]_急诊室，足以激活CRAC通道。

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图4

STIM1齐聚激活Ca²⁺通过CRAC渠道进入

a、，在表达F-STIM1（黑色，n=45）的rapalog处理细胞中，静息[Ca²⁺]_我升高，对细胞外钙的清除敏感²⁺，表示Ca的组成²⁺条目。相反，静息钙²⁺未经处理的F-STIM1表达细胞（红色，n=61）和带有（绿色，n=617）或不带（蓝色，n=517）rapalog的wt-Jurkat细胞中基本上没有内流。TG诱导Ca²⁺rapalog处理细胞的释放与未处理细胞相似。b、，我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}表达F-STIM1的rapalog处理细胞（黑色，n=9）和未处理细胞（红色，n=8）在全细胞记录期间的发育。我_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在断裂后5 s内开始测量。c、，中断时的I–V关系，显示I的典型内向矫正_{中俄国际商用飞机有限责任公司}在rapalog处理的细胞中（黑色），未处理的细胞没有电流（红色）。数值表示为平均值±标准误差(a、 b).

我们已经证明STIM1再分配和_{中俄国际商用飞机有限责任公司}对[钙]的依赖程度很高²⁺]_急诊室F-STIM1的齐聚足以驱动puncta的形成和CRAC通道的激活。这些结果定义了CRAC通道的输入输出关系，并确定STIM1寡聚化是确定这种关系的主要转导事件。考虑到钙的去除，STIM1的EF手和SAM结构域似乎主要用于控制齐聚程度²⁺导致重组EF-SAM肽寡聚在体外⁵F-STIM1中的FRB和FKBP模块可以有效地替代EF-SAM域并激活I_{中俄国际商用飞机有限责任公司}当rapalog交联时。后者在没有Ca的情况下发生²⁺存储耗尽表明，一旦STIM1齐聚，导致SOCE的所有后续步骤都独立于ER-Ca发生²⁺因此，我们认为STIM1的齐聚作用是一个开关，触发了STIM1和Orai1复合物在ER-PM连接处的自组织，并随后激活了CRAC通道。

这种低聚“开关”是如何运作的？处于静止状态时，Ca²⁺-结合的STIM1在内质网膜中自由移动⁴但在存储耗尽后，STIM1寡聚体在距离PM 10–25 nm的内质网亚区聚集，距离PM足够近，可以通过结合PM中的靶点进行捕获⁸这些靶点尚未明确，但建议候选靶点包括Orai1（参考文献20、21）或相关蛋白²²和PM磷脂^4，23一旦定位于ER-PM交界处，STIM1就会促进Orai1在对合位点的积累，从而导致通道激活^11，12，24寡聚化可能通过两种方式促进STIM1与靶点的结合：一种是基于亲和力的机制，其中构象变化暴露出先前被掩盖的胞浆结合域；另一种是以亲和力为基础的机制，在该机制中，结合域的聚集增加了它们在ER-PM连接处的局部浓度。这两种机制都可能有助于构成SOC激活过程最后阶段的CRAC通道复合体的组装和功能。

方法总结

补充材料

致谢

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